人补体杀伤小鼠N9小胶质细胞及亚溶破模型的建立

目的: 探讨正常人血清(normal human serum,NHS)补体杀伤小鼠N9小胶质细胞的机制,建立人补体攻膜复合物(sublytic membrane attack complex,sMAC)N9细胞亚溶破刺激模型.方法: 用阻断补体活化途径的方法探讨 N9细胞活化人补体系统的机制;采用微量补体反应性溶破法,以酵母多糖 (Zymosan,Z)活化急性期病人血清制备补体优球蛋白C56,EDTA-NHS作为C7-C9的来源,组装N9细胞sMAC亚溶破模型;CCK-8比色实验确定sMAC亚溶破剂量;激光共聚焦鉴定sMAC沉积;脱落细胞计数及台盼蓝拒染法分别判定细胞黏附力变化及脱落细胞活力.结果: 未致敏N9细胞可通过旁路途径直接活化人血清补体系统;当C56稀释度在1∶ 500 以上,NHS(含1 mmol/L EDTA)稀释度为 1∶ 20时,膜攻击复合物(membrane attack complex,MAC)活性逐渐降低,细胞溶破减少,确定 C56 1∶ 500,NHS 1∶ 20为N9细胞亚溶破补体量;激光共聚焦鉴定sMAC沉积于N9细胞表面;亚溶破剂量MAC刺激N9细胞后与对照组相比细胞脱落增加(P<0.05),而细胞活力正常.结论: 探讨了小鼠N9细胞活化人补体的机制;通过建立N9细胞人补体sMAC亚溶破模型,证实sMAC刺激N9细胞后可降低细胞黏附力但不影响细胞活力;为sMAC对中枢神经系统小胶质细胞亚溶破刺激效应的深入研究提供了理论与实验基础.     

体外组装补体膜攻击复合物建立肾小管上皮细胞亚溶破模型

目的 体外组装补体膜攻击复合物(membrane attack complex,MAC),建立肾小管上皮细胞HK-2亚溶破模型,为进一步探讨小管间质的免疫性损伤效应奠定基础.方法 用酵母多糖激活急性期患者血清制备补体优球蛋白C56,以新鲜正常人血清(NHS)作为C7～C9来源,体外组装sMAC建立HK-2亚溶破模型,LDH检测评价细胞亚溶破剂量,激光共聚焦显微镜(LSCM)鉴定sMAC沉积,流式细胞仪检测sMAC对HK-2表面HLA-DR 分子表达的影响.结果 确定C561:80,NHS 1:0为HK-2最适亚溶破量;LSCM显示sMAC沉积于HK-2细胞表面;不同时相观察sMAC刺激后HK-2细胞HLA-DR表达量逐渐升高,HLA-DR比对照组显著增加(P＜0.01).结论 成功建立了肾小管上皮细胞补体膜攻击复合物亚溶破模型,补体活化可能导致TEC本身参与了免疫炎症效应.     

体外组装补体膜攻击复合物对肾小管上皮细胞Ⅳ型胶原合成的影响

目的 探讨补体膜攻击复合物(membrane attack complex,MAC)对肾小管上皮细胞HK-2细胞外基质成分Ⅳ型胶原表达的影响.方法 以纯化的C56及新鲜正常人血清(the normal human serum,NHS)作为C7～C9来源,体外组装sMAC建立HK-2亚溶破模型,通过流式细胞仪检测MAC刺激后的Ⅳ型胶原表达情况,荧光显微镜检测MAC的沉积.结果 MAC刺激后的HK-2与对照组比较Ⅳ型胶原和合成增多(P＜0.05).结论 亚溶破剂量的MAC能使HKC的Ⅳ型胶原表达上调,可能是引起肾小管间质纤维化细胞外基质增多的原因之一.     

LPS刺激对大鼠视网膜小胶质细胞CD80、CD86和CD40表达的影响

目的 研究脂多糖(LPS)刺激对CD80、CD86、CD40在大鼠视网膜小胶质细胞上表达的影响,探讨视网膜小胶质细胞在视网膜和视神经病变中与T细胞活化的关系.方法 分离培养大鼠视网膜小胶质细胞并进行OX42染色鉴定,当细胞培养达80%融合状态时分为正常培养组和LPS刺激组.采用RT-PCR法检测两组细胞CD80、CD86和CD40 mRNA的表达,硝酸还原法和ELISA法检测两组细胞一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌量.结果 RT-PCR检测显示,LPS刺激组的视网膜小胶质细胞CD80、CD86和CD40 mRNA的表达较正常培养组显著增加,两组比较差异有统计学意义(均P<0.01).正常培养组的视网膜小胶质细胞有少量NO和TNF-α分泌,LPS刺激组的小胶质细胞培养上清液中NO和TNF-α的分泌量较正常组显著增加[(18.10±1.57)μmol/L vs (1.55±0.15)μmol/L,(51.07±4.30)pg/mL vs (2.37±0.31)pg/mL],两组比较差异有统计学意义(均P<0.01).结论 培养的大鼠视网膜小胶质细胞有共刺激分子表达,LPS刺激后表达上调,提示视网膜小胶质细胞可能与T细胞活化有关.     

LPS刺激对大鼠视网膜小胶质细胞CD80、CD86和CD40表达的影响

目的 研究脂多糖(LPS)刺激对CD80、CD86、CD40在大鼠视网膜小胶质细胞上表达的影响,探讨视网膜小胶质细胞在视网膜和视神经病变中与T细胞活化的关系.方法 分离培养大鼠视网膜小胶质细胞并进行OX42染色鉴定,当细胞培养达80%融合状态时分为正常培养组和LPS刺激组.采用RT-PCR法检测两组细胞CD80、CD86和CD40 mRNA的表达,硝酸还原法和ELISA法检测两组细胞一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌量.结果 RT-PCR检测显示,LPS刺激组的视网膜小胶质细胞CD80、CD86和CD40 mRNA的表达较正常培养组显著增加,两组比较差异有统计学意义(均P<0.01).正常培养组的视网膜小胶质细胞有少量NO和TNF-α分泌,LPS刺激组的小胶质细胞培养上清液中NO和TNF-α的分泌量较正常组显著增加[(18.10±1.57)μmol/L vs (1.55±0.15)μmol/L,(51.07±4.30)pg/mL vs (2.37±0.31)pg/mL],两组比较差异有统计学意义(均P<0.01).结论 培养的大鼠视网膜小胶质细胞有共刺激分子表达,LPS刺激后表达上调,提示视网膜小胶质细胞可能与T细胞活化有关.     

小檗碱通过NF-κB相关通路抑制AGEs诱导的小鼠小胶质细胞活化的实验研究

目的 探讨小檗碱对AGEs诱导的小鼠小胶质细胞活化的干预作用和机制。方法 将细胞分为CON组、AGEs组、小檗碱和BSA阴性对照组,MTT法检测细胞活力,倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化,ELISA法检测细胞上清液中TNF-α的分泌情况,Western blot法检测细胞内CD68、RAGE、pNF-κB p65蛋白的表达。结果 AGEs 在不改变细胞活力的情况下,对小胶质细胞的形态有改变作用,并且可以显著上调细胞上清液中的炎性细胞因子TNF-α的分泌量(P=0.000),增加CD68、RAGE及pNF-κB p65蛋白的表达(P<0.05)。小檗碱可以改善AGEs诱导的小胶质细胞形态改变,显著下调小鼠小胶质细胞CD68和pNF-κB p65蛋白的表达(P<0.05),对TNF-α的分泌量没有影响。结论 小檗碱可以抑制AGEs诱导的小鼠小胶质细胞的活化,其作用可能与NF-κB介导的炎性信号通路有关。     

大黄酚对LPS诱导小胶质细胞炎性因子分泌的影响

[目的]抑制小胶质细胞的过度活化,对中风、神经退行性病变等疾病的治疗有重要意义。考察大黄酚对脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞炎性因子分泌的影响。[方法]培养小胶质细胞细胞株,检测大黄酚对小胶质细胞活力及LPS诱导的小胶质细胞一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)产生的影响。[结果]与LPS相比,大黄酚可以抑制NO、TNF-α的分泌。[结论]大黄酚可以抑制LPS诱导小胶质细胞炎性因子的分泌。     

吗啡活化离体培养星形胶质细胞效应研究

目的 研究吗啡活化离体培养星形胶质细胞的效应.方法 用吗啡、纳络酮处理离体培养纯化的小鼠星形胶质细胞,在第1、2、4、7天采用CCK-8检测细胞增殖,激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)检测细胞内钙浓度[(Ca2+)i],采用ELISA检测细胞分泌TNF-α,用Griess法测定NO浓度,以期观察吗啡对星形胶质细胞的效应.结果 2μmol/mL吗啡刺激星形胶质细胞,第1天和第2天短期作用效应不明显;延长作用时间,于4、7d细胞增殖下降,(Ca2+)i升高,NO和TNF-α分泌显著升高,阿片受体阻断剂纳络酮可以翻转吗啡作用效应.结论 吗啡长期作用经阿片受体活化星形胶质细胞,表现为(Ca2+)i升高,TNF-α和NO分泌上调.     

原代培养的小鼠星形胶质细胞CD46、CD55、CD59的表达及炎症刺激因子对其的影响

目的通过体外培养小鼠大脑皮层星形胶质细胞,明确补体调节蛋白CD46、CD55、CD59在原代小鼠大脑皮层星形胶质细胞上的表达情况,及炎症因子对CD46、CD55、CD59表达的影响,为研究补体系统在AD中的作用打下基础.方法原代纯化培养小鼠星形胶质细胞,用RT-PCR,免疫荧光的方法,分别在mRNA水平、蛋白质水平,检测炎症因子刺激前以及LPS、IFN-γ单独或协同刺激后,CD46、CD55、CD59的表达情况.结果 RT-PCR检测到CD59 mRNA的表达,CD46、CD55的表达不明确,未刺激组和刺激组无明显差别;免疫荧光结果示CD59阳性,CD46、CD55弱阳性.结论保护素CD59在原代小鼠星形胶质细胞上显著表达,可能可以保护星形胶质细胞免受补体的溶破效应的杀伤.     

探索全氟辛烷磺酸对HAPI小胶质细胞炎症反应的影响

目的：探讨全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate,PFOS)对HAPI小胶质细胞的毒性反应及作用机制。方法：用20 nmol/L PFOS处理HAPI小胶质细胞6、12 h后;采用细胞免疫荧光检测活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的表达;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)的分泌量。结果：细胞免疫荧光显示 HAPI小胶质细胞在PFOS处理后,ROS的表达显著增加(P＜0.05);ELISA检测显示TNF-α的分泌量增加并达到(81.00±2.38) pg/mL,而对照组TNF-α为(22.00±1.63) pg/mL。结论：PFOS可以引起HAPI小胶质细胞产生氧化应激并分泌TNF-α。