旋毛虫抗原基因Ts87在真核细胞中的表达

目的 在体外真核细胞COS7中表达重组质粒pcDNA3．1／Ts87，为旋毛虫病DNA疫苗的研究奠定基础。方法 将重组质粒pcDNA3．1／Ts87：经脂质体Lipofectamine介导，体外转染真核细胞COS7，通过细胞免疫组化，细胞裂解物的SDS—PAGE电泳和Western—blot分析检测表达产物。结果 重组质粒能够在COS7中表达出约38ku的目的蛋白，并能够被旋毛虫阳性血清特异识别。结论 构建的重组质粒可在体外真核细胞COS7中成功表达。     

旋毛虫Ts87基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化

目的 为进一步研究和应用旋毛虫Ts87基因，本文原核表达了PET-28a( )／Ts87重组质粒，并纯化鉴定了该蛋白。方法 将Ts87基因片段克隆入原核表达载体PET-28a( )，形成重组质粒PET-28a( )／Ts87，转化后经IPTG诱导得到表达蛋白(约40kDa)，利用固定化金属离子(Ni^2 )配体亲和层析纯化目的蛋白，进行复性，并用兔人工感染旋毛虫血清鉴定表达产物。结果与结论 成功构建了PET-28a( )／Ts87，SDS-PAGE显示融合蛋白主要以包涵体形式存在，经过亲和层析得到纯化的目的蛋白，经鉴定可被人工感染旋毛虫兔血清识别。     

旋毛虫Ts87抗原基因在毕赤酵母中的构建及表达

目的构建旋毛虫Ts87抗原基因并在毕赤酵母中分泌表达。方法通过PCR特异性扩增Ts87抗原基因,构建重组质粒P^PICZαA-Ts87。其线性化后,转化毕赤酵母GS115,抗生素Zeocin筛选高抗性转化子,PCR筛选阳性重组菌株。表型鉴定后进行甲醇诱导表达,收集培养不同天数的上清液。斑点杂交法分析上清液以确定有无重组蛋白分泌表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)分析鉴定表达蛋白。结果与结论成功构建了P^PICZαA-Ts87毕赤酵母表达重组质粒,确定了Ts87抗原基因在毕赤酵母中获得分泌表达。     

旋毛虫抗原基因Ts88原核表达及重组蛋白鉴定

目的　原核表达旋毛虫抗原基因Ts88,并对重组蛋白的抗原性进行鉴定。　方法　免疫筛选cDNA文库得到旋毛虫抗原新基因Ts88,克隆入原核表达载体pET28c(+),异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达。重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体滴度。蛋白质印迹法检测重组蛋白的抗原性。免疫荧光试验确定Ts88蛋白在虫体的分布。　结果　经原核表达的Ts88重组蛋白,用其免疫小鼠可得到高滴度的抗体血清。蛋白质印迹法结果表明该重组蛋白能与旋毛虫病患者血清、旋毛虫病猪血清、人工感染及人工免疫兔血清反应,不与其他蠕虫病患者血清发生交叉反应 ,并能识别旋毛虫虫体天然抗原成分。免疫荧光试验显示Ts88蛋白主要分布于虫体体壁。　结论　成功制备Ts88基因的重组蛋白,证明该蛋白具有较好的抗原性     

旋毛虫抗原基因Ts43原核表达及重组蛋白鉴定

目的原核表达旋毛虫相对分子质量(Mr)43 000抗原基因(Ts43)并对重组蛋白进行抗原性鉴定。方法将旋毛虫抗原基因Ts43克隆入原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-Ts43,经测序分析正确后转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Western blotting analysis)鉴定重组蛋白的抗原性。结果SDS-PAGE结果显示表达产物为Mr 41 000的重组融合蛋白,IPTG诱导4 h时表达量最大,薄层凝胶光密度扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的14.7%。Western blotting结果显示该重组蛋白可被旋毛虫、乡土旋毛虫及纳氏旋毛虫感染小鼠血清及旋毛虫病患者血清识别,与人芽囊原虫、微小隐孢子虫感染小鼠和正常小鼠血清和正常人血清无交叉反应,但与棘球蚴病、囊尾蚴病、日本血吸虫病、并殖吸虫病及华支睾吸虫病患者血清均有交叉反应。结论旋毛虫Ts43基因的重组蛋白具有较好的抗原性,但与某些寄生虫病患者血清有交叉反应。     

旋毛虫抗原基因Ts21的原核表达与重组蛋白鉴定

目的 原核表达旋毛虫相对分子质量（Mr）21 000抗原基因（Ts21）并对重组蛋白进行纯化和抗原性鉴定。 方法 将旋毛虫抗原基因Ts21亚克隆入原核表达载体pMAL-c2X，构建重组表达质粒pMAL-c2X-Ts21，经酶切鉴定正确后转化大肠埃希菌TB1，以异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。亲和层析法纯化表达产物。应用十二烷基磺酸钠?鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析鉴定重组蛋白的抗原性。将重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清，ELISA检测抗体滴度，免疫荧光检测（IFA）确定Ts21蛋白在肌幼虫体内的分布。 结果 SDS-PAGE结果显示，表达产物为Mr 63 500的重组融合蛋白，IPTG诱导4 h后表达量最大，薄层凝胶光密度扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的18.2%。Western blotting结果显示该重组蛋白可被旋毛虫、纳氏旋毛虫感染小鼠血清及旋毛虫病患者血清识别，但不能被乡土旋毛虫、布氏旋毛虫及伪旋毛虫感染小鼠血清识别；与钩虫病、囊尾蚴病、日本血吸虫病患者血清无交叉反应，但与并殖吸虫病、华支睾吸虫病及棘球蚴病患者血清有交叉反应。重组蛋白免疫小鼠可产生高滴度的血清抗体，IFA显示Ts21蛋白主要分布于肌幼虫体壁。 结论 成功制备了旋毛虫Ts21基因的重组蛋白，该蛋白具有较好的抗原性。     

旋毛虫pcDNA3.1/Ts87重组质粒的构建和表达

目的构建和表达旋毛虫重组质粒。方法PCR法在旋毛虫抗原基因Ts87两端加上合适的酶切位点和KOZAK序列,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1/Ts87重组质粒。采用Lipofectamine介导的细胞外源DNA转染法,把重组质粒导入COS7细胞。分别用肌肉注射和基因枪免疫小鼠。结果和结论成功构建pcD-NA3.1/Ts87重组质粒,并在COS7细胞和BALB/c小鼠体内表达。     

旋毛虫ES抗原P49基因的体外表达分析

目的克隆和表达旋毛虫ES抗原P49基因,并分析表达产物的免疫原性。方法以重组质粒pCDNA3.1 P49为模板,PCR扩增旋毛虫ES抗原P49基因,将扩增片段双酶切产物连接到质粒pEGFP N1中,构建重组真核表达载体pEGFP N1 P49,利用脂质体法将其转染哺乳动物细胞COS 7。于转染24h后在荧光显微镜下观察发绿色荧光的转基因细胞;通过Western blot分析证实P49基因表达产物的免疫原性。结果成功构建旋毛虫ES抗原P49基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP N1 P49,并在COS 7细胞中表达了目的蛋白,并且表达的蛋白可被感染旋毛虫小鼠阳性血清特异地识别。结论成功获得了重组蛋白,并证实该融合蛋白具有免疫原性,其结果为研究其生物学功能奠定了基础。     

多房棘球绦虫elp基因在真核细胞COS7中的表达

目的　构建中国四川株多房棘球绦虫 elp基因真核表达载体 ,为核酸疫苗研究奠定基础。　方法　应用 RT-PCR方法从多房棘球绦虫续绦期幼虫 RNA获得 elp基因的编码序列 ,定向克隆于 p GEM- 11zf( +)。经酶切鉴定及测序后将目的基因亚克隆于真核表达载体 pc DNA3.1( +)。重组真核表达载体 pc D- EL P鉴定后 ,纯化无内毒素的重组质粒 ,电穿孔方法转染哺乳动物细胞 COS7。RT- PCR、dot- EL ISA和免疫组化方法鉴定目的基因在 COS7细胞中的表达。　结果　琼脂糖凝胶电泳、酶切及序列分析证实多房棘球绦虫 elp基因编码区已成功地克隆于真核表达载体 pc DNA3.1( +)。RT- PCR、dot- EL ISA和免疫组化证实 ,重组质粒在哺乳动物细胞 COS7中能够表达多房棘球绦虫 EL P抗原。　结论　成功地构建了中国四川株多房棘球绦虫 elp基因的真核表达载体 ,该载体在 COS7哺乳动物细胞中能表达 EL P抗原 ,为多房棘球绦虫 elp基因疫苗研究奠定了基础。     

旋毛虫ES抗原特异性蛋白两个结构基因的序列分…

获取旋毛虫ＥＳ抗原的结构基因，对其鉴定和克隆，并研制旋毛虫基因组抗原。先用反转录ＰＣＲ技术获取目的基因，经序列测定和酶切分析后，再用重组ＤＮＡ技术分别将目的基因与融合表达载体ｐＥＸ３１Ｃ、ｐＥＸ３１Ｂ及表达载体ＰＢＶ２连接，评价在大肠杆菌中的表达效果和鉴定表达产物的异性。     

旋毛虫ES抗原特异性蛋白两个结构基因的序列分析及重组质粒的构建

目的：获取旋毛虫ＥＳ抗原的结构基因，对其鉴定和克隆，并研制旋毛虫基因重组抗原。方法：先用反转录ＰＣＲ技术获取目的基因，经序列测定和酶切分析后，再用重组ＤＮＡ技术分别将目的基因与融合表达载体ｐＥＸ３１Ｃ、ｐＥＸ３１Ｂ及表达载体ｐＢＶ２２０连接，评价在大肠杆菌中的表达效果和鉴定表达产物的特异性。结果：获得了编码ＥＳ抗原特异性蛋白成分的两个结构基因（０．７ｋｂ和０．９５ｋｂ），其序列与文献报道的稍有差异。共构建３个重组质粒并在大肠杆菌中表达出相应分子量大小的重组蛋白，均能被猪旋毛虫病阳性血清所识别，但非融合蛋白的特异性强于融合蛋白。在相同条件下，融合蛋白的表达量高于非融合蛋白，而表达蛋白的分子量大小与表达水平呈负相关性。结论：在大肠杆菌中表达的３种重组蛋白是研制旋毛虫基因重组抗原的良好候选抗原蛋白。     

免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达

目的　获取旋毛虫抗原的 c DNA克隆并进行蛋白的原核表达。　方法　应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫 c DNA文库进行筛选 ,并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为 Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆入 PET- 2 8a( +)表达载体 ,IPTG诱导表达后用 SDS- PAGE电泳分析表达产物。　结果　免疫筛选获得阳性克隆 Ts87;成功构建重组表达质粒 PET- 2 8a( +) / Ts87。诱导表达该融合蛋白 ,SDS- PAGE电泳表明 ,其能表达一分子质量约为 40 ku的融合蛋白 ,与预测分子质量相符。　结论　筛选到 c DNA克隆 Ts87,与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应 ;PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。     

旋毛虫新生幼虫期特异性T668 cDNA在大肠埃希菌中的表达及鉴定

目的对旋毛虫新生幼虫期特异性T668cDNA进行表达及鉴定,以获得基因工程抗原。方法应用PCR技术,从pBK CMV T668重组质粒中扩增到不含信号肽序列的T668cDNA片段,将目的基因克隆于原核表达载体pET28a(+),构建pETT668重组质粒,再将其转化到E.coli表达菌株DE3感受态细胞中,经IPTG诱导表达,以SDS PAGE鉴定表达产物。结果pETT668表达蛋白的分子质量单位为49ku,且随诱导时间的延长蛋白表达量逐渐增加,诱导5h时表达量达到高峰;薄层扫描结果显示,目的蛋白占菌体总蛋白的34.6%。Western blotting检测显示,表达蛋白可被感染旋毛虫家猪血清所识别。结论旋毛虫新生幼虫期特异性T668基因在大肠埃希菌中获得高效表达,且表达蛋白具有良好的抗原性。     

旋毛虫肌幼虫特异性抗原的鉴定

目的 寻找诊断旋毛虫病的特异性抗原。方法 应用SDS—PAGE和Western blot对旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中的蛋白组分进行研究。结果 旋毛虫肌幼虫可溶性抗原经SDS—PAGE后显示29条蛋白带，分子量范围在112—12kDa之间，其中65、43、42、31、30、20、17、16kDa为主带。112、110、108、102、97、95、65、63、58、55、53、49、45、43、42kDa蛋白组分与并殖吸虫感染的大鼠及患者血清、华支睾吸虫病、血吸虫病及囊尾蚴病患者血清均具有明显的交叉反应带；24—20kDa蛋白组分只与旋毛虫感染的大鼠、小鼠及患者血清反应，而不与其它寄生虫感染的动物或患者血清、正常大鼠和小鼠及正常人血清发生交叉反应。结论旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中24—20kDa蛋白组分为旋毛虫肌幼虫的特异性抗原，可用于旋毛虫病的免疫学诊断及血清流行病学调杏。     

旋毛虫部分抗原表位的识别与分析

[目的 ]筛选旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中具有免疫显性的表位。 [方法 ]采用杂交瘤技术 ,获得 15株特异性单克隆抗体 ,随后用酶联免疫吸附试验 (ELISA)、免疫印迹法 (Westernblotting)和间接免疫荧光试验(IFA)对部分免疫显性抗原进行分析。 [结果 ]Westernblotting试验显示 ,6株单抗与旋毛虫肌幼虫可溶性抗原反应显示有特异条带 ,分子量为 40～ 70kDa ;而多抗血清则可识别 2 0～ 2 0 0kDa之间 10条条带。IFA可观察到 ,6株单抗中有 4株单抗的靶抗原定位在旋毛虫肌幼虫表皮层上 ,另 2株定位于杆状体 (stichosome)及表皮层。 [结论 ]识别与分析部分旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中具有免疫显性的表位 ,为纯化旋毛虫的抗原及疫苗靶抗原的研制提供了有价值的实验依据。     

湖北省人群旋毛虫感染情况调查

为了解我省人体旋毛虫病流行特征、危害情况，以酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）对全省５个片区的２１个县、市４７１９人进行血清流行病学调查，结果抗体阳性率为１２．２％，主要流行区为鄂西北、鄂东北地区。提示目前我省人体旋毛虫病流行仍然十分严重，制定相应的防治措施应提到议事日程上来     

旋毛虫感染家兔治疗前后血清IgG抗体水平的变化

应用旋毛虫肌肉内成囊期幼虫的盐水浸出液为抗原，用ＥＬＩＳＡ间接法检测了旋毛虫感染家兔治疗前后血清ＩｇＧ水平的消长情况。血清ＩｇＧ于感染后７周达高峰，１０周下降，治疗后抗体水平明显升高。认为血清学检测在旋毛虫病的疗效考核中有一定价值。     

从基因水平对新型佐剂在旋毛虫疫苗中免疫调节作用的探讨

目的　从细胞因子的基因转录水平探讨两种新型佐剂霍乱毒素 B亚单位(CT B)和皂素(Saponin)在旋毛虫疫苗中的免疫调节作用。　方法　36只NIH小鼠随机分为CT B佐剂免疫组、Saponin佐剂免疫组和对照组。将CT B和Saponin分别与旋毛虫肌幼虫可溶性抗原混匀后,以口服或皮下注射途径免疫小鼠,隔周1次。第3次免疫后 1 周,经口感染旋毛虫感染期肌幼虫。感染后第8 d,采用RT PCR技术分析各组小鼠脾细胞在体外旋毛虫肌幼虫抗原刺激下,转录细胞因子 IFN γ、IL 2、IL 4及 IL 5 mRNA的水平。　结果　各组小鼠的脾细胞在体外抗原诱导下均未能转录 IL 2和 IFN γmRNA,但均有不同程度的 IL 4和 IL 5特异扩增,两免疫组的 IL 4 及 IL 5 mRNA转录水平明显高于对照组。结论　 Th2细胞及其分泌的细胞因子在机体抗旋毛虫的保护性免疫中发挥着重要作用;从佐剂角度提高旋毛虫疫苗的保护性是可行的。