带3蛋白C末端与血型糖蛋白A在哺乳动物细胞内相互作用的研究

目的 研究人类红细胞带3蛋白C末端与血型糖蛋白A(GPA)之间在哺乳动物细胞内的相互作用。方法 利用穿梭位点,将AEl—c—end和GPA的基因从pGADT7—AEl—c—end和pGBKT7—GPA中分别亚克隆至pM和pVP16载体上,将pVP16—AEl-c—end、pM—GPA及报告基因质粒pG5CAT共同转染Hela细胞,采用ELISA检测报告基因CAT蛋白(氯霉素乙酰转移酶)的活性。结果 转染后48—72h检测到CAT蛋白的表达,其表达水平和活性明显高于阴性对照。结论 本实验在哺乳动物细胞内证明了带3蛋白C末端与GPA之间有直接的相互作用。     

用PCR体外定点突变技术诱导霍乱毒素A亚基突变体的构建

目的： 有效去除霍乱毒素Ａ 亚基（ ＣＴ Ａ） 的毒性作用而保存其佐剂性能。方法： 采用ＰＣＲ 体外定点突变技术（ＰＣＲ ＳＤＭ） ,设计两对引物,引入一个突变位点,通过重叠延伸法两次ＰＣＲ 扩增,使ＣＴ Ａ 编码基因第６３ 位密码子由ＣＴＣ 突变为ＴＴＴ,亦将扩增片断克隆入ＰＵＣ１９ 载体。结果： ＤＮＡ 测序结果表明在预期位点已发生突变,用ＰＣＲ 诱导成功ＣＴ Ａ 突变体。结论： ＰＣＲ 诱导突变准确、简便,为深入研究ＣＴ 免疫佐剂的作用打下了基础     

带3蛋白C末端132个氨基酸残基与血型糖蛋白A相互作用位点的研究

目的：利用酵母双杂交系统探寻带3蛋白与血型糖蛋白A(GPA)的相互作用位点。方法：采用PCR方法，从pFAST-Bac-AE1-C-end杆状病毒表达载体中扩增出AE1—C—end截断突变体(Arg832-Arg879)，将突变体的cDNA片段插入酵母双杂交系统GAL4AD端表达载体中，观察其在选择性培养基上的表达情况。用醋酸锂法将构建好的重组质粒与BD端表达质粒共同转化酵母菌AHl09，经酵母双杂交营养缺陷培养和β—半乳糖苷酶检测证实带3蛋白C—末端与GPA之间的作用位点。结果：成功构建了AE1-C-末端截断突变体酵母双杂交的AD端表达质粒，证实带3蛋白C-末端截断突变体与GPA不止有一个相互作用位点。结论：带3蛋白与GPA的作用位点不仅在带3蛋白的酸性C端域，还涉及其最后两次跨膜域。     

PDIP1基因定点突变的研究

目的将DNA聚合酶δ相互作用蛋白1(PDIP1)编码序列562位碱基T突变为G。方法利用定点突变PCR对PDIP1编码序列进行定点突变,然后将PCR定点突变产物和pGEX-4T-2载体经EcoRⅠ与SalⅠ酶切,再利用连接酶将它们定向连接起来形成pGEX-4T-2-PDIP1重组质粒,转化E.coli DH5α感受态,对所得重组质粒进行酶切和测序。结果第1轮和第2轮PCR都得到了预期大小的扩增片段,重组质粒经酶切也得到预期大小的片段,测序结果表明已成功将PDIP1编码序列第562位碱基T突变为G。结论利用PCR定点突变是基因点突变的一种简单实用的好方法。     

血型糖蛋白A在恶性疟原虫入侵红细胞中的受体作用

人红细胞膜血型糖蛋白A(GPA)与恶性疟原虫入侵红细胞关系密切。本实验在体外培养条件下,观察了GPA及其抗体,α1-酸性糖蛋白、鸡卵类粘蛋白及麦胚凝集素等对恶性疟原虫入侵红细胞的影响。结果表明:GPA与恶性疟原虫裂殖子之间的结合具有高度特异性和亲和力,有饱和趋势,结合后产生特定的生物效应。首次从配体—受体相互作用的特点,证实了GPA是恶性疟原虫裂殖子识别和结合的受体。     

白念珠菌钙调蛋白定点突变重组菌株的构建和鉴定

目的：构建白念珠菌钙调蛋白（Cmd1）定点突变重组菌株,为进一步探讨钙调蛋白基因突变对真菌生长周期及致病性的影响奠定基础。方法：将含白念珠菌钙调蛋白基因（CMD1）定点突变的重组质粒转染CMD1缺陷HIS3^ 重组单倍体菌株,用His/Trp省却培养基和His/Trp/Ura省却培养基联合选择培养筛选到Cmd1定点突变酵母菌株。结果：经选择培养筛选得到能在His/Trp省却培养基上生长而不能在His/Trp/Ura省却培养基生长的菌株4株。结论：成功构建了4株Cmd1定点突变重组菌染,为进一步探讨Cmd1定点突变对白念珠菌生物学特性及致病性的影响奠定基础。     

红细胞血型糖蛋白A位点正常变异及肿瘤放疗的影响

目的了解血型糖蛋白Ａ（ＧＰＡ）背景突变水平,观察照射近期的变化规律。方法在正常人和肿瘤放疗病人中进行ＧＰＡ突变分析,结合单克隆抗体标记和流式细胞技术,检测ＭＮ杂合子个体中罕见的变异细胞ＮＯ和ＮＮ,确定变异率。结果对２８个正常成人的初步测定,ＮＯ／ＮＮ变异率（Ｖａｒｉａｎｔｆｒｅｑｕｅｎｃｙ,Ｖｆ）（８．３±４．１３）／（５．５０±３．７７）×１０－６;ＮＮ变异率与年龄相关性接近显著意义（Ｐ＝０．０５７）,男女之间、吸烟与不吸烟者均无显著差异。随访肿瘤病人,６例治疗前ＧＰＡ变异率ＮＯ（１２．９±６．６０）×１０－６,ＮＮ（７．７±５．０１）×１０－６,与同年龄者无显著差异。连续盆腔照射１月Ｖｆ已有升高,照射２个月的病人ＮＮＶｆ（１７．５±８．９５）×１０－６,显著高于未照病人（Ｐ＝０．０４６８）。结论正常人ＧＰＡ变异率基本与文献相符,年龄等因素可影响背景水平;病人照射后Ｖｆ变化不一,表明个体对辐射敏感性不同,照射近期主要是ＮＮ的变化,是较晚造血周期细胞突变的表现。     

恶性疟原虫EBA-175与血型糖蛋白A结合位点的鉴定

目的 探索EBA-175与GPA之间的结合信息,为疟疾短肽疫苗及拮抗药物的研制奠定基础.方法 以EBA-175重组蛋白为靶,采用亲和筛选法对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选,通过ELISA、竞争抑制试验、Dot-ELISA及Western blotting等方法鉴定获得的噬菌体短肽与EBA-175之间的结合特性.对阳性克隆进行DNA序列测定,推导其十二肽的氨基酸序列并与GPA氨基酸全序列进行了同源性比较.结果 经3轮亲和筛选后,结合噬菌体得到良好富集.从第3轮洗脱液铺制的琼脂板中随机挑取30个噬菌体单克隆,ELISA检测有27个为阳性,阳性率达90%.竞争性ELISA显示多数阳性噬菌体能竞争抑制EBA-175与其单抗结合.DNA及氨基酸序列分析表明24个噬菌体展示十二肽中共有序列IRR与GPA的114-116位氨基酸同源.结论 阳性噬菌体表达的短肽是EBA-175所识别的模拟表位,IRR几位氨基酸可能对EBA-175与GPA的结合起重要作用.     

重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化

目的：基于重叠延伸PCR (SOE PCR)技术构建转录因子EB (TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法：根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物Fn和Rn进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的 DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用Bam HⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌(E. coli)中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。结果：第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段...     

傅里叶变换红外技术研究麦胚凝集素作用下血型糖蛋白A构象变化

目的进一步阐明麦胚凝集素作用下，膜血型糖蛋白Ａα螺旋改变的部位。方法：首先，制备重组蛋白体膜血型糖蛋白Ａ，然后，以ＦＴＩＲ技术定量测定麦胚凝集素作用下，血型糖蛋白Ａ二级结构的改变。结果发现：麦胚凝集素结合于血型糖蛋白，导致血型糖蛋白Ａα螺旋减少，β结构增加。且相同浓度的麦胚凝集素作用下，重建脂蛋体膜血型糖蛋白Ａα螺旋下降较多，溶液血型糖蛋白Ａα螺旋下降较少。提示：麦胚凝集素作用下，膜血型糖蛋白Ａ膜内、膜外螺旋均有减少。     

中国人Brugada综合征SCN5A基因突变K317N的定点诱变及其载体构建

目的对我们发现的中国人Brugada综合征新的SCN5A基因突变K317N进行体外定点诱变研究,并构建携带有基因突变K317N的pRc/CMV-hH1的表达载体。方法采用PCR定点突变技术,根据突变位置附近的两个单一限制性内切酶位点AgeI/Sse8387I设计一对定点诱变引物,将突变位点设计在引物上,通过PCR扩增,使扩增片段上含有所需要的突变位点,最后将扩增片段克隆入pRc/CMV-hH1载体中。结果DNA测序表明,在预期位点巳经发生突变,SCN5A基因在第317密码子由赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N),成功实现定点诱变。结论PCR技术诱导定点突变,准确、高效。pRc/CMV-hH1(K317N)的成功构建,为进一步进行该突变的结构与功能研究奠定了基础。     

PCR介导的ret基因体外定点突变

目的:利用PCR技术介导ret基因cDNA上第2 753位碱基的体外定点突变.方法:利用PCR技术进行定点突变,采用Dpn Ⅰ进行原始模板消化.经Amp抗性、PCR技术初步筛选,通过序列分析进行确证.结果:Amp抗性及PCR筛选结果均为阳性;序列分析提示,2 753处碱基由T→C.结论:成功完成了ret基因的体外定点突变.     

可溶性Ⅰ型补体受体活性区基因的突变修正

目的：修正可溶性Ⅰ型补体受体（ｓＣＲ１）过程中造成的碱基突变,保证基因序列氨基酸编码的准确性,为蛋白表达和基因转染打下基础。方法：采用掺尿苷寡聚核苷酸介导的定点突变法,对ｓＣＲ１活性区基因中错配的碱基加以修正,用点杂交方法筛选突变子阳性克隆,测序鉴定。结果：４０℃洗膜,放射自显影示除阴性对照和１个样品外,阳性对照和其余１９个克隆均显阳性黑斑;５６℃洗膜,放射自显影示５个样品为阳性。阳改天我隆测序结     

云南省迁延性新生儿黄疸与UGT1A1基因多态性的遗传关联性研究

目的探讨尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT1A1)基因编码序列(Gly71Arg)的突变及启动序列(非编码序列即TATA)核苷酸的多态性与云南省迁延性新生儿黄疸遗传关联性.方法 289例迁延性新生儿黄疸作为病例组,96例无黄疸新生儿作为对照组.采用常规方法提取DNA,用聚合酶链反应(PCR)方法扩增UGT1A1第1外显子,琼脂糖凝胶电泳鉴定产物,PCR产物进行DNA测序.结果病例组与对照组Gly71Arg等位基因突变率分别为33%及17%,病例组Gly71Arg基因频率显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);病例组与对照组TATA等位基因突变率均为8%,等位基因频率在病例组及对照组间无统计学差异(P>0.05).结论云南省迁延性新生儿黄疸的发生与Gly71Arg突变密切相关,而与TATA的多态性无关.     

Analysis of the ratio of mitchondrial DNA with A1555G mutant to wild type in deaf patients of Fujian province in China by a new method and its relationship with the severity of hearing loss

Background  It has been suggested that the ratio of mutant and wild type mitochondrial DNA may be related to its clinical phenotype. In this study, we developed a high sensitive real-time amplification refractory mutation system-quantitative polymerase chain reaction (RT-ARMS-qPCR) assay for quantitation of the mitochondrial DNA (mtDNA) with a mutated 1555 site, and explored the relationship between the ratio of mutated mtDNA and the severity of hearing loss of mitochondrial deafness (MD) patients of Fujian province in China.

Methods  An amplified mtDNA fragment containing the 1555 site was ligated into a vector to construct a plasmid DNA standard. An RT-ARMS-qPCR system was used to measure the mtDNA copy number containing wild-type and mutant sequences in a cohort of 126 MD patients of Fujian province in China. Combined with the clinical data, we explored the relationship between the ratio of mutated mtDNA and the severity of hearing loss of MD.

Results  The variation coefficient in the cohort was 1.21%, the interassay variation coefficient was 1.78%, and the linear range was 10²–10⁸ copies/µl for detecting a recombinant, wild-type plasmid. The primers amplified only the intended sequences. Mutation copy number correlated with the degree of deafness in sporadic cases with heteroplasmic mutations of mtDNA A1555G (R=0.811, P=0.003), but not in sporadic cases with homoplasmic mutations (R=0.007, P=0.989). The copy number of homoplasmic or heteroplasmic mutations of mtDNA A1555G in familial cases correlated with degree of deafness (R=0.352, P=0.023 and R=0.90, P=0.012, respectively).

Conclusions  The RT-ARMS-qPCR system is suitable for determining the copy number of mtDNA fragments containing the A1555G mutation. The ratio of mutated mtDNA correlates with the severity of hearing loss of MD.

     

进行性骨化性纤维增殖不良症临床及ACVR1基因c.774G>C突变分析

目的:研究1例具有非典型临床特征的进行性骨化性纤维增殖不良症(fibrodysplasia ossificans progressiva,FOP)患者,并对其致病基因人活化蛋白/促激蛋白A受体1 (activin A type 1 receptor,ACVR1)进行突变分析?方法:根据患者大踇趾轻微畸形和进行性异位骨化等临床表现,结合骨骼系统放射线检查?骨ECT和相关血液生化检查进行临床诊断?采集患者?患者父母和60位正常人外周血,提取基因组DNA,对ACVR1基因全部外显子进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增和序列分析;对突变后的蛋白质结构进行分子模拟以便评估其突变后的功能改变?结果:患者具有非典型的临床表现:先天性大踇趾轻微畸形和进行性非经典顺序的异位骨化,其父母无FOP相关临床表现?患者的ACVR1第5外显子存在c.774 G>C (R258S)杂合突变,而其父母和正常对照组均无此杂合突变?此外,患者和所有正常人都存在c.690 G>A(E230E),此为无意义突变?三维蛋白质分子模拟发现R258与高度保守的甘氨酸-丝氨酸(glycine-serine,GS)活化区邻近,该突变可能导致ACVR1与ACVR1的抑制蛋白FK506结合蛋白12(FK506 binding protein 12,FKBP12)结合的亲和力降低,进而对ACVR1抑制作用降低?结论:典型FOP均在ACVR1之GS区发生突变,而本例FOP在ACVR1激酶区发生突变,这可能是该患者在临床表现呈非典型的原因?该结果有助于我们更好地去理解FOP表型和基因型之间的关系?     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷逆转RASSF1A基因甲基化对人乳腺癌MCF-7细胞的影响

目的：探讨启动子甲基化对乳腺癌MCF-7细胞RASSF1A基因的作用及5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）干预对启动子甲基化的影响,为临床治疗乳腺癌奠定理论基础.方法：用1,3,5,7,9μmol/L不同浓度的5-Aza-CdR处理MCF-7乳腺癌细胞株,通过MTT检测5-Aza-CdR对MCF-7乳腺癌细胞株存活率的影响;建立5μmol/L,10μmol/L的浓度梯度流式细胞仪检测5-Aza-CdR对MCF-7乳腺癌细胞株生长周期及凋亡率的影响,MSP（甲基化PCR）检测5-Aza-CdR处理前后RASFF1A抑癌基因的甲基化状态,RT-PCR检测处理前后抑癌基因RASSF1A mRNA表达情况.结果：5-Aza-CdR抑制体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞,诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡和细胞周期停滞在G0/G1期,呈浓度依赖性.经5-Aza-CdR处理人乳腺癌MCF-7细胞后,MSP检测RASSF1A基因发生了甲基化,RT-PCR检测RASSF1A mRNA恢复了表达.结论：RASSF1A基因启动子甲基化是导致其失活的主要原因,5-Aza-CdR可以逆转乳腺癌细胞株MCF-7细胞RASSF1A基因启动子甲基化状态,使其重新表达．     

miR-126-3p.1通过SLC7A5调控间变性甲状腺癌细胞糖酵解的作用机制

目的 探讨miR-126-3p.1对间变性甲状腺癌(ATC)细胞糖酵解的作用,并分析其潜在的机制。方法 通过TCGA数据库检索miR-126-3p.1在甲状腺癌中的表达及与甲状腺癌诊断、预后的关系。运用荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)实验检测人正常甲状腺细胞Htori-3、人间变性甲状腺癌细胞SW1736、人乳头瘤状甲状腺癌细胞TPC-1中miR-126-3p.1、溶质运载家族7成员5(SLC7A5)的表达;将TPC-1细胞分为agomiRNA(转染agomiRNA)组、agomiR-126-3p.1(转染agomiR-126-3p.1)组、si-NC(转染si-NC)组、si-SLC7A5(转染si-SLC7A5)组、agomiR-126-3p.1+pcDNA(共转染agomiR-126-3p.1和pcDNA)组、agomiR-126-3p.1+pcDNA-SLC7A5(共转染agomiR-126-3p.1和pcDNA-SLC7A5)组,各组细胞用脂质体法转染至SW1736细胞。细胞计数试剂(CCK8)、5-溴-2-脱氧尿嘧啶(EdU)法检测细胞增殖能力;ELISA法检...