日本血吸虫乳酸脱氢酶基因的获得和序列分析

目的 从日本血吸虫(Schistosoma japonlcum，Sj)成虫cDNA文库中筛选日本血吸虫新基因，为日本血吸虫病的诊断或防治提供靶抗原。方法 筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行DNA测序，再对新基因序列进行步移法测序获取全长cDNA，并利用生物信息学技术对其进行分析。结果 获得了1个新基因，其cDNA全长1251bp(AY225190)，编码331个氨基酸，编码蛋白与人类或螈、蟾蜍、鸡、鼠及猪等其它生物的乳酸脱氢酶高度同源。结论 利用表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术三者相结合，成功获得了编码日本血吸虫乳酸脱氢酶基因的cDNA全长序列。     

牛带绦虫乳酸脱氢酶基因原核表达及免疫学特征

目的 克隆牛带绦虫乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)基因在大肠杆菌中表达,研究其免疫学特征。方法 将牛带绦虫成虫LDH基因与质粒pET-28a(+)连接构建原核重组质粒,在大肠埃希菌BL21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷诱导表达,表达产物通过十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Westernblotting)进行分析。结果 牛带绦虫乳酸脱氢酶基因编码332个氨基酸,理论分子量为35.4kDa,PCR、双酶切及DNA测序的结果均证明pET-28a(+)-LDH构建成功;SDS-PAGE结果表明,牛带LDH基因在大肠埃希菌高效表达,经过亲和层析高纯度蛋白,且该重组蛋白可以被亚洲带绦虫、牛带绦虫及猪带绦虫感染病人血清识别,表明其具有免疫反应性。结论 牛带绦虫LDH基因可在原核系统中有免疫活性的高效表达。     

日本血吸虫p 50亲免素基因克隆、表达及纯化

目的扩增、原核克隆和表达日本血吸虫（Sj）p50亲免素基因全长cDNA，并进行表达产物的纯化。方法从成虫RNA中RT-PCR扩增Sjp50亲免素基因完整的编码阅读框后，将其克隆入pET 30a（＋）原核表达载体中，异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导高表达后用亲和层析柱对表达产物进行纯化。结果将Sjp50亲免素基因成功克隆入pET 30a（＋）表达载体中；诱导表达并成功纯化出重组Sjp50亲免素蛋白。结论成功克隆sjp50亲免素基因，并表达和纯化得到了p50亲免素蛋白，为研究Sip50亲免素的功能及其进行疫苗等研究奠定了基础。     

重组大鼠溶菌酶C端多肽的原核表达与纯化

目的 应用基因重组技术,构建pET30a（＋）与LY70的原核表达重组质粒.方法 采用PCR方法扩增LY70基因,经Nde I和Not I双酶切后插入相同酶切pET30a（＋）载体,转化DH5α感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌Ecoli Rosetta （DE3）,用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性,表达产物经Ni＋-NTA琼脂糖柱层析纯化.结果 成功构建了重组表达载体pET30a（＋）与LY70,并优化表达,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在.结论 原核细胞可以高效表达溶菌酶的C端多肽而不影响原核表达系统,不失为一种制备溶菌酶功能性多肽的有效手段.     

汉坦病毒核蛋白原核表达纯化及其单抗制备

目的制备稳定、特异的汉坦病毒核蛋白重组抗原和单克隆抗体.方法构建汉坦病毒（HTNV）-76118株核蛋白原核表达载体（pBV）220-S1.3和（pET）28a-S1.3,大肠埃希菌诱导表达.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western-blot分析显示,在48kD附近有目的蛋白表达,且有较好的抗原活性.用纯化的包涵体抗原免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经镍合氨基三乙酸（Ni-NAT）亲和纯化的核蛋白包被酶标板,进行ELISA筛选阳性克隆株,并建立细胞系,选2株高效分泌抗核蛋白单克隆抗体（McAb）的阳性杂交瘤细胞,常规制备腹水,进行单抗鉴定.结果成功构建了重组核蛋白原核表达载体pBV220-S1.3和pET28a-S1.3,获得了高纯度重组核蛋白（rNP）及其高效价单克隆抗体2E6和4D8.结论重组核蛋白抗原及其单克隆抗体在流行性出血热的监测、诊断和科研中有重要价值.     

附睾蛋白酶抑制剂Eppin蛋白的原核表达及纯化

目的 构建人附睾蛋白酶抑制剂Eppin蛋白的重组质粒pET28a(+)-Eppin,并研究该质粒在原核细胞中的表达及纯化.方法 本研究以人睾丸组织cDNA为模板获得人Eppin基因片段,将其插入pET28a(+)载体His6-Tag上游,构建重组质粒pET28a(+)-Eppin,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IP...     

脑卒中对血糖、异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶的影响

目的 研究脑卒中患者血糖（BS）、异柠檬酸脱氢酶（IDH）、乳酸脱氢酶（LDH）水平的变化。方法采用葡萄糖氧化酶法检测67例非糖尿病性脑卒中患者的血糖水平,根据血糖值分为高血糖组（41例）和正常血糖组（26例）,另设24例体检健康者为对照组,用比色法检测血清IDH、LDH水平,用琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶（LDH-同工酶）。结果与对照组及正常血糖组相比,高血糖组患者血清IDH、LDH水平显著增高,P〈0．01：对照组与正常血糖组相比较,差异无显著性。结论脑卒中可影响患者BS、血清IDH及LDH水平,非糖尿病脑卒中患者的BS、IDH、LDH水平高,病情较重。     

大鼠Clara细胞分泌蛋白CC16基因的克隆和原核表达及纯化

目的 克隆大鼠Clara细胞分泌蛋白(CC16)基因,原核表达并纯化重组的CC16蛋白,为进一步研究CC16蛋白的功能及对炎症性气道疾病的治疗作用奠定基础.方法 制备大鼠肺组织总RNA,根据大鼠CC16基因全长编码序列(GenBank登录号:NM_013051)的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli DH5α),阳性菌落经PCR和双酶切鉴定并测序.将重组质粒pET30a(+)-rCC16转化至E coli Rosetta(DE3)并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物,重组融合蛋白经Ni2+琼脂糖凝胶亲和纯化.分别以抗His标签抗体和山羊抗CC16抗体进行免疫印迹(Western blotting)分析并鉴定重组蛋白.结果 RT-PCR扩增产物约为290 bp.菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-rCC16构建成功.SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约16 kDa的可溶性重组蛋白.Western blotting结果表明,诱导表达的蛋白质为带His标签的重组融合蛋白,且能被山羊抗CC16抗体识别.结论 成功构建基因重组体pET30a(+)-rCC16,并制备出可溶性大鼠重组CC16蛋白.     

普马拉病毒核蛋白基因片段原核表达及产物纯化

目的通过原核表达获得普马拉病毒重组核蛋白。方法采用RT-PCR方法,从感染普马拉病毒的鼠肺标本中扩增得到编码核蛋白1-117 aa的基因片段。将截短的核蛋白基因片段插入原核表达载体PQE30构建重组质粒,转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,利用N i-NTA Agarose对表达产物进行纯化。结果重组蛋白得到了高效表达。表达产物分子量15 000,在菌体中主要以可溶性蛋白形式存在。通过亲和层析,得到了纯化的重组蛋白。结论普马拉病毒重组核蛋白基因片段得到了有效表达。     

日本血吸虫核糖体蛋白S4基因的克隆、表达、纯化及免疫诊断价值的初步研究

目的 体外重组日本血吸虫核糖体蛋白S4(SjRPS4),并评价其在日本血吸虫病免疫诊断中的应用价值.方法 从日本血吸虫尾蚴cDNA文库获得了SjRPS4蛋白相关基因,将该段基因克隆入pQE30表达载体并转化到大肠杆菌M15中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达.融合蛋白经Ni2+-NTA树脂柱进行亲和层析纯化,并通过十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定蛋白反应,通过Western blot和ELISA对其免疫原性进行鉴定.结果 成功构建了pQE30/SjRPS4重组菌.重组菌诱导培养后,SDS-PAGE电泳分析可见在相对分子质量约30×103处有SjRPS4融合蛋白的表达,经纯化获得纯度达90%以上的表达蛋白.Western blot检测结果表明该重组蛋白能被日本血吸虫病患者血清识别.用ELISA法检测疑似血吸虫病患者血清,敏感性为90.91%(70/77),特异性为92.59%(25/27),SjRPS4重组表达蛋白阳性率为67.30%(70/104),与肺吸虫病患者血清无交叉反应.结论 成功克隆表达了SjRPS4蛋白,初步证实了SjRPS4在诊断血吸虫病中具有良好的应用价值.     

抗亚洲带绦虫药物对乳酸脱氢酶抑制作用

目的探讨抗亚洲带绦虫药物对于重组的亚洲带绦虫乳酸脱氢酶(Ta.LDH)酶促功能的影响。方法将不同浓度的吡喹酮、阿苯达唑和甲苯咪唑加入Ta.LDH所催化的丙酮酸还原成乳酸(正反应)以及乳酸氧化成丙酮酸(逆反应)的标准反应体系当中,测定烔?废汆堰?核苷酸(NADH)在A340处吸光度的变化值。采用SPSS 16.0软件进行分析,计算药物对酶活性的相对抑制率。结果与对照组比较,0.10 mmol/L吡喹酮对Ta.LDH催化正逆反应的相对抑制率分别为93.99%(P0.01)和94.67%(P0.01),0.10 mmol/L阿苯达唑分别为85.45%(P0.01)和73.81%(P0.01);0.15 mmol/L甲苯咪唑分别为92.2%(P0.01)和86.13%(P0.01)。结论Ta.LDH可能为吡喹酮、阿苯达唑和甲苯咪唑抗亚洲带绦虫药物作用的靶标分子。     

EB病毒LMP1-CTAR2结构域的原核表达及蛋白质纯化

目的:构建LMP1-CTAR2原核表达载体,纯化LMP1羧基端活化区2(CTAR2)蛋白。方法:通过RT-PCR技术从B95-8细胞中扩增EBVLMP1 CTAR2 cDNA,克隆至PGEM-T载体后测序。运用亚克隆技术构建PGEX-6P-3-CTAR2重组表达载体。用SDS-PAGE与western blot对表达产物进行鉴定,利用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行分离和纯化。结果:PCR扩增出225 bp的基因片段,测序结果与已知的LMP1 CTAR2序列吻合。成功构建PGEX-6P-3-CTAR2原核表达载体,western blot分析表明表达产物能与抗LMP1单克隆抗体特异结合。成功分离出Mr约37000的PGEX-6P-3-CTAR2融合蛋白,纯化出Mr约15000的LMP1 CTAR2蛋白。结论:成功获得EBV LMP1 CTAR2蛋白,可用于噬菌体筛库和CTAR2致瘤机制研究。     

脑脊液乳酸脱氢酶检查在小儿颅内感染中的意义

目的 研究和分析脑脊液乳酸脱氢酶检查对小儿颅内感染中鉴定小儿化脓性脑膜炎以及病毒性脑膜炎的意义.方法 分析201 3年1-6月进入该院治疗化脓性脑膜炎患儿52例,病毒性脑膜炎患儿48例,以及对照组患儿50例,检测脑脊液乳酸脱氢酶的浓度.结果 脑脊液乳酸脱氢酶浓度在病毒性脑炎组（24.5±3.7）U/L,对照组病例（2.2±3.56）U/L,化脓性脑膜炎组结果（54.6±3.4）U/L与其他两组检测结果相比显著增高（P＜0.05）.结论 脑脊液乳酸脱氢酶检测能够作为鉴别小儿化脓性脑膜炎和病毒性脑炎更为快速和准确的诊断标准,对临床上小儿颅内感染疾病的诊断治疗提供更为准确的实验室数据指标,有助于提高小儿颅内疾病的治疗效率.     

恙虫病东方体蛋白基因的原核表达及活性鉴定

目的 对恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因进行原核表达，并对表达产物进行纯化，以获得有生物活性的重组蛋白，用于恙虫病诊断试剂的研制。方法 根据GiUiam株东方体56kDa蛋白基因序列设计特定引物。用PCR法扩增出编码56kDa抗原长约1320bp的DNA，克隆至原核载体PET28a，构建了表达载体PET-OTG，并获表达。表达产物经镍(Ni2 )柱亲和层析纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白印迹(Western—blot)分析鉴定。并用间接ELISA进行抗原性分析。结果SDS—PAGE检测表明重组蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体两种方式表达，在相对分子质量约52kDa处有表达目的条带。经 Ni^2 层析柱纯化得到目的蛋白，包涵体蛋白纯化后纯度大于可溶性蛋白，达电泳纯。Western-blot证实该蛋白能被患者阳性血清所识别，用阴性血清则未出现相应印迹。间接ELISA结果表明重组蛋白具有良好的抗原性，能有效区分恙虫病阳性和阴性血清。结论 重组蛋白具有免疫反应活性。有望作为诊断抗原用于恙虫病的诊断。     

欧猥迭宫绦虫乳酸脱氢酶新基因识别及其结构与功能预测

目的 用生物信息学方法识别欧猥迭宫绦虫(Spirometra erinaceieuropaei,S.e)乳酸脱氢酶(LDH)全长cD-NA序列,预测其编码蛋白的结构与功能。方法 用NCBI、EMBI、Expasy等在线网站对序列结构域、功能域等进行分析以识别基因,预测其蛋白序列理化参数、信号肽、抗原表位、拓扑结构等,三级结构同源建模应用Vector软件进行同源序列比对、构建进化树及三级结构模型分析。结果 目标序列具有完整开放阅读框、L-LDH结构域及功能域、polyA,确定为LDH全长cDNA,命名为SeLDH(GU 121 968);该序列编码338氨基酸残基(aa),预测等电点为6.38,分子量为36 028.6Da;与华支睾吸虫、日本血吸虫及人LDH的相似性分别为60%、59%及55%;有5个可能跨膜区域;主要线性表位中的185～191 aa、223～235 aa及328～338 aa与人LDH相同区域差异明显;表位104～111 aa与人LDH相同区域有1 aa的差异,其上有NAD及底物结合位点,关键催化位点112 R紧邻该区域;三级结构模型显示其在蛋白表面形成环状结构,3个关键催化位点及NAD、丙酮酸结合位点在该环状结构上或周围形成催化中心。结论 获得SeLDH全长cDNA序列;该蛋白可能是膜蛋白;是理想的免疫诊断、药物作用及疫苗靶分子。     

结核分枝杆菌ESAT-6 His融合蛋白的原核表达及纯化

摘要:目的 构建含有His标签结核分枝杆菌esat-6基因的原核表达质粒,并在体外进行原核表达和纯化。方法 提取结核分枝杆菌基因组DNA,对其采用聚合酶链反应技术扩增esat-6基因,并构建至表达载体pET28a上。将测序正确的载体转化大肠杆菌BL21,然后对His-ESAT6融合蛋白通过IPTG诱导进行表达,最后对重组蛋白使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行分析。结果 PCR扩增出结核分枝杆菌esat-6基因,成功构建至表达载体pET28a-ESAT-6上,并在体外优化表达,产生高水平的目的蛋白表达产物。结论 成功构建并表达了含有His标签的ESAT-6融合蛋白,为临床中预防和治疗结核病提供了有效的参考。     

寨卡病毒非结构蛋白1的真核表达纯化和免疫反应性鉴定

目的 在HEK293F细胞中表达寨卡病毒(Zika Virus,ZKV)的非结构蛋白1(Nonstructural Protein 1,NS1),并分离纯化得到重组ZKNS1以及验证其免疫反应性。方法 根据GenBank中的ZKNS1序列合成基因,在基因上下游分别引入信号肽和组氨酸标签,通过NotI和XbaI双酶切将基因克隆至pcDNA31(+)载体;将重组载体转染HEK293F细胞,重组蛋白用镍亲和柱层析纯化;免疫印迹法(Western blot)鉴定重组ZKNS1与寨卡病毒阳性人血清的免疫反应性。结果 成功构建了ZKNS1的真核表达载体pcDNA31(+)-ZKNS1;在HEK293F细胞中重组ZKNS1以分泌形式表达于细胞培养上清中,经纯化后获得了纯度较高的分子量约为46kDa的重组蛋白;Western blot结果显示重组ZKNS1与寨卡病毒阳性人血清能发生特异性结合。结论 成功构建ZKNS1的真核表达载体,获得了免疫反应性较高的纯化的重组ZKNS1,为进一步建立ELISA检测方法及制备单克隆抗体奠定了基础。     

华支睾吸虫GST的新编码基因的克隆与纯化

目的 扩增华支睾吸虫(Cs)一个编码谷胱甘肽转移酶(GST)的新基因，确认是否存在内含子，进行原核表达，纯化。方法 用PCR方法从成虫cDNA文库和基因组中扩增CsGST基因，测序，定向克隆到原核表达载体pET-30a( )，在大肠杆菌BL21／DE3表达，按照Ni-NTA agarose说明书纯化重组蛋白，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和薄层色谱(TLC)分析。结果 CsGST基因全长639bp，没有内含子，构建的原核表达质粒pET-30a( )-CsGST在大肠杆菌中得到了有效表达，融合蛋白的分子量约为30kDa。重组蛋白达总蛋白的33％，纯化后的重组蛋白纯度为97％。结论 CsGST基因没有内含子，在大肠杆菌中能有效表达，重组蛋白得到了纯化，为进一步研究该基因的功能打下基础。