硫化氢对大鼠离体结肠平滑肌细胞作用的研究

目的：研究硫化氢（H2S）对结肠平滑肌细胞舒缩作用的影响及其作用机制。方法：制备大鼠离体的结肠平滑肌细胞,观察NaSH（H2S供体）的舒张效应及其他工具药对该舒张效应的影响。结果：（1）1×10^-5mol／L、1×10^-4mol／LNaSH分别可使结肠平滑肌细胞舒张11．49％、20．57％。（2）ATP敏感钾离子通道（KATP通道）阻滞剂格列本脲能减弱NaSH的细胞舒张作用,但不能完全阻断。（3）KATP通道开放剂吡那地尔也可产生细胞舒张作用。结论：H2S可以使离体单个结肠平滑肌细胞产生舒张作用;激活KATP通道可能是其作用机制之一。     

ATP 敏感钾通道在神经退行性疾病中的研究进展

ATP 敏感钾通道（ATP-sensitive potassium channel,KATP）,因其通道活性受ATP/ADP 的影响而得名。KATP 是一种耦联细胞电活动和细胞代谢的特殊通道,通道功能在正常状态下,对于维持神经细胞线粒体膜电位、抑制细胞凋亡有重要作用。KATP 广泛存在于胰岛细胞、心肌、骨骼肌、血管平滑肌和神经细胞等组织中。近几年的研究发现KATP 参与了多种疾病的发病过程,该文对ATP 敏感钾通道在神经退行性疾病中的研究进展作了综述。     

表皮生长因子在醋酸诱导的结肠高敏感模型大鼠中的表达及其作用

目的:初步探讨表皮生长因子(EGF)在醋酸诱导的结肠高敏感模型大鼠中的表达及其作用?方法:新生雄性乳大鼠20只,于出生第10~21天,模型组(n = 10)给予0.5%醋酸灌肠,建立慢性结肠高敏感模型,对照组(n = 10)给予相同体积生理盐水?通过结直肠扩张(CRD)刺激,记录腹壁撤退反射(AWR) 评分和腹外斜肌肌电活动(EMG),评估内脏敏感性?ELISA法检测两组大鼠血清及结肠组织中EGF和5-羟色胺(5-HT)水平,采用Western blot方法检测模型组与对照组结肠组织中5-HT转运体(SERT)表达,并分析两组大鼠结肠组织EGF水平与SERT蛋白表达间关系?体外细胞实验进一步探讨EGF对SERT表达的影响,大鼠肠上皮细胞(IEC-6细胞)给予不同浓度EGF(0?20?40?80 ng/ml)刺激24 h,检测SERT蛋白表达?结果:结肠高敏感组大鼠AWR评分及EMG幅值较对照组显著增高(P < 0.05),HE染色及髓过氧化物酶(MPO)水平检测显示两组大鼠结肠组织均无明显炎症表现,提示持续内脏高敏感形成?模型组大鼠与对照组相比,血清EGF水平明显降低[(2.639 ± 0.107)ng/ml vs(4.066 + 0.573)ng/ml,P < 0.05],且结肠中EGF表达也明显减低[(3.244 ± 0.135)ng/100 mg vs(3.582 + 0.197)ng/100 mg,P < 0.05]?结肠组织中SERT蛋白表达量,模型组大鼠与对照组相比显著下降[(0.711 ± 0.219)vs(0.980 ± 0.239),P < 0.01]?模型组大鼠血清及结肠组织中5-HT水平显著高于对照组[(6.125 ± 0.534)ng/ml vs(3.540 ± 0.442)ng/ml,(5.527 ± 0.514)ng/100 mg vs(2.650 ± 0.495)ng/100 mg,P < 0.05]?结肠组织中EGF水平与SERT蛋白表达存在显著正相关(r = 0.820,P < 0.001)?体外细胞实验结果显示,予不同浓度EGF(20?40?80 ng/ml)刺激细胞,SERT相对表达量(分别为1.398 ± 0.091?1.725 ± 0.124?1.571 ± 0.088),与0 ng/ml(1.011 ± 0.012)比较,P < 0.05?结论:醋酸诱导结肠高敏感大鼠结肠组织中5-HT水平增高,结肠组织SERT蛋白表达下降,同时其血清及结肠组织中EGF水平下降,且结肠组织中SERT表达与EGF水平呈正相关?体外细胞实验EGF可呈浓度依赖上调IEC-6细胞SERT蛋白表达,提示EGF可能通过影响SERT的表达参与内脏高敏感性形成?     

肠系膜细动脉平滑肌细胞的分离及其ATP敏感钾通道特性

旨在探索一种分离细动脉平滑肌的方法，并研究其ATP敏感钾通道（KATP）的特性。采用链酶蛋白酶E消化及机械分离的方法分离细胞，以膜片钳技术之细胞贴附式和内面向外式记录KATP通过电流。该平滑肌的分离方法简单；细动脉平滑肌KATP通道在高钾平衡液中电导为（111．0±6.5）pS，门控动力学表现明显的ATP和电压依赖性，通道开放概率低，提示其对缺血、缺氧、酸中毒等病理条件下细动脉张力和组织血流分布的调节具有潜在的作用。     

SK3表达在雌二醇介导的大鼠结肠平滑肌收缩中的作用

目的：探讨小电导钙激活钾通道3（SK3）表达在17β?雌二醇（E2）介导的大鼠结肠平滑肌收缩中的作用及机制。方法：将24只雄性SD大鼠随机分为4组。30 mm硅胶管皮下植入大鼠背部,内含不同溶液。分为对照组（C）,内含溶剂;生理剂量组（EP）内含E2 0.3 mg/mL,使大鼠血清雌激素在生理浓度;超剂量组（ES）内含E2 0.9 mg/mL,使大鼠血清雌激素超生理浓度;ER抑制剂+E2组（EI）内含相同摩尔浓度E2和雌激素受体抑制剂（ICI 182780）。各组干预14 d后处理,免疫荧光及Western blot检测结肠平滑肌组织SK3分布及表达;MPA分析系统记录肌条收缩张力及对卡巴胆碱（Cch）刺激反应。E2孵育结肠平滑肌细胞（SMC）24 h后及过表达SK3后,激光共聚焦显微镜下动态观察Cch刺激后SMC内Ca2+变化。结果：Cch刺激后,EP组及ES组肌条收缩明显低于其他各组（P < 0.05）。 EP组及ES组平滑肌组织SK3表达高于C组及EI组,其中ES组有统计学意义（P < 0.05）。Cch刺激后,E2孵育组及过表达SK3组胞内Ca2+上升幅度较相应对照组显著降低（P < 0.05）。结论：E2可能通过促进SK3表达,减少Ca2+内流从而抑制结肠收缩。     

牵张大鼠左心室所致的心律失常

目的观察牵张大鼠左心室对心脏电活动的影响,并通过施加阻断剂观察牵张激活离子通道在该过程中的作用,揭示机械电反馈的可能机制。方法记录离体大鼠心脏的表面心电图,应用压力钳技术控制左心室内压。在心室舒张末期施加额外的牵张刺激,观察大鼠心电活动的变化。并观察用链霉素(800μmol/L)灌流30min后,对牵张所致心电活动变化的阻断作用。结果0mmHg压力钳制或以正常心室内压波形钳制左心室内压不引起心电活动变化。在正常心室内压钳制波形的舒张末期施加强度为140mmHg、持续时间为30ms的额外牵张刺激,可以引起大鼠心室发生期前兴奋。链霉素(800μmol/L)灌流30min后,额外牵张刺激所致期前兴奋消失。结论心室舒张末期施加较强的额外牵张刺激引起心电活动改变,表现为期前兴奋,提示牵张激活了去极化电流。该机械电反馈现象可以被链霉素阻断,提示牵张激活非选择性阳离子通道在该过程中发挥作用。     

瞬时感受器电位通道 vanilloid 4 在机械牵张人脑微血管内皮细胞中对内皮型一氧化氮合酶的作用

目的：筛选人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells,HBMEC)中瞬时感受器电位 (transient receptor potential,TRP)通道亚型,检测该通道亚型在机械牵张刺激中对内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)蛋白表达的影响及探讨相关机制。方法：荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)、Western印迹及细胞免疫 荧光筛选HBMEC上TRP通道亚型。根据筛选的TRP通道亚型将细胞分组,应用多功能小型生物撞击机给予机械牵张 刺激;流式细胞仪检测细胞牵张前后胞内Ca2+荧光强度变化;Western印迹检测eNOS蛋白表达情况。结果：qRT-PCR 结果表明：TRPV4及TRPC1的mRNA相对表达量较多;细胞免疫荧光及Western印迹显示TRPV4通道蛋白表达;流式细 胞仪检测结果显示,特异性TRPV4通道抑制组较单纯牵张组Ca2+相对浓度低(P<0.001),较未牵张组(P=0.072)、非特异 性TRP通道抑制组(P=0.308)无明显差异。Western印迹检测结果显示：TRPV4通道抑制组和内皮型一氧化氮合酶抑制 组eNOS蛋白表达水平较单纯牵张组明显降低(P<0.05),较未牵张组无明显差异(P>0.05)。结论：TRPV4在HBMEC上有 表达,机械牵张将其激活后,可以引起eNOS蛋白表达增多,其机制可能与胞外Ca2+的内流有关。     

胞膜和线粒体ATP敏感性钾通道在心肌保护中的作用

自Noma1983年发现在豚鼠心室肌存在ATP敏感性钾通道以来，大量研究显示在胰腺β细胞、骨骼肌细胞、血管和其它平滑肌细胞、神经细胞、内皮细胞以及肾上皮细胞等多种组织中均有此类通道。它们主要受细胞内ATP浓度的调控^[1]，这类通道被命名为ATP敏感性（或依赖性）K^ 通道（KATP通道）。该通道在上述组织生理活动的调节中起重要作用。1991年Inoue等应用膜片钳（patch clamp)技术首次发现在大鼠肝细胞线粒体内膜上有对ATP敏感的钾离子通道^[2]。而后，又有实验证实牛心肌细胞的线粒体内膜也有KATP通道^[3]。令人感兴趣的是，线粒体的KATP（mitoKATP)通道除具有与胞膜KATP（cellKATP)通道相似的一些特性和作用外，对组织细胞还有某些特殊意义。本文就cellKATP和mitoKATP通道生理特性和作用以及它们的心肌保护效应作一综述。     

格列美脲对2型糖尿病GK大鼠KATP通道表达的影响

目的观察磺脲类药物格列美脲对2型糖尿病GK大鼠心肌组织ATP敏感性钾通道（KATP）表达的影响。方法自发性糖尿病GK大鼠48只随机分入糖尿病对照组、糖尿病胰岛素治疗组、糖尿病格列本脲组、糖尿病格列美脲组，另设正常对照组（n=12）。放射配体结合法检测SUR2蛋白含量，半定量RT-PCR法检测KATP通道亚单位SUR2和Kir6.2 mRNA表达。结果干预12周后糖尿病组、糖尿病胰岛素治疗组和正常对照组SUR2受体密度、SUR2 mRNA及Kir6.2 mRNA表达水平无显著差异；格列美脲治疗组SUR2受体密度较正常对照组和糖尿病组无明显改变；SUR2 mRNA及K ir6.2 mRNA表达水平无明显改变。第24周，糖尿病大鼠SUR2 mRNA表达水平较12周下降，也低于同期正常对照大鼠，但尚无统计学意义；格列美脲治疗组SUR2受体密度无明显改变；KATPmRNA表达水平变化不大。结论自发性糖尿病GK大鼠的糖尿病状态不影响心肌KATP通道表达水平；治疗剂量的格列美脲对糖尿病大鼠心肌组织KATP通道表达无明显影响。     

葛根素抑制大鼠结肠平滑肌收缩活动的机制探讨

目的：探讨葛根素抑制大鼠离体结肠平滑肌收缩活动的作用机制。方法制备大鼠离体结肠平滑肌标本,用Po w‐erLab数据采集分析系统记录结肠平滑肌收缩活动的变化。结果葛根素对大鼠离体结肠平滑肌的收缩活动具有明显抑制作用（P＜0.05）;阿托品、尼莫地平、普萘洛尔和格列本脲对结肠平滑肌收缩活动无明显作用（P＞0.05）,但可部分阻断葛根素对平滑肌收缩的抑制作用（ P＜0.05）。结论葛根素对大鼠离体结肠平滑肌收缩活动的抑制作用可能由β受体、M 受体、K＋通道和C a2＋通道所介导。     

HEK293细胞内源性电压门控钾离子通道电生理学特性研究

目的探讨人胚胎肾细胞(HEK293细胞)内源性电压门控钾通道的电生理特性,避免HEK293细胞上内源性离子通道对外源性离子通道表达时的干扰。方法利用全细胞膜片钳技术分析了HEK293细胞内源性电压门控钾通道的电生理特性。结果在HEK293细胞上去极化电压从-80 mV开始可触发1个外向电流。在+100 mV时电流为(422.78±68.87)pA,电流密度为(21.91±3.20)pA/pF。钾通道阻断剂四乙胺(tetraethylammonium,TEA)、4-氨基吡啶(4-aminopyri-dine,4-AP),在将细胞外液钾浓度由4 mmol/L提高到40 mmol/L时,对外向电流有影响。结论正常培养的HEK293细胞本身有内源性的钾通道。该外向电流可能包括了IK、IK1、IKur和Ito。     

β_2肾上腺能受体与黏蛋白2在大鼠结肠黏膜的共存

目的探究去甲肾上腺素对大鼠结肠黏液分泌的影响以及肾上腺能β受体在大鼠结肠黏膜的分布。方法采用酶联免疫吸附测定法检测去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)对结肠黏液分泌的影响;用免疫荧光组织化学方法观察黏蛋白2(mucin2,MUC2)及β肾上腺能受体在结肠黏膜的分布;实时定量PCR方法检测β肾上腺能受体在大肠结肠黏膜的表达;同时采用阿利新蓝/过碘酸雪夫染色方法检测黏液细胞在结肠黏膜的分布;使用激光共聚焦显微镜观察β2肾上腺能受体与MUC2在结肠黏液细胞的共存。结果去甲肾上腺素可刺激大鼠远端结肠黏膜的黏液释放增加,比对照组增加约247%。免疫荧光组织化学结果显示β1和β3肾上腺能受体在结肠黏膜有弱表达,β2肾上腺能受体为高表达。β1和β2肾上腺能受体mRNA表达相对量与免疫荧光组织化学一致。黏蛋白MUC2主要表达在结肠隐窝的黏液细胞内,且与β2肾上腺能受体有共存。结论β2肾上腺能受体与MUC2在结肠黏液细胞共存;去甲肾上腺素可促进结肠黏液分泌。     

体外培养视网膜神经元电压门控钾离子通道特性的研究

目的探讨体外培养不同时期新生小牛视网膜神经元电压门控钾离子通道的特性。方法分别取培养2、4、6周的视网膜神经元,进行全细胞膜片钳记录,并进行统计学分析。结果去极化刺激可诱导3组细胞产生IK电流,各组检出率差异无统计学意义(P>0.05);随培养时间延长,IK电流平均峰值增高(P<0.05)。超极化刺激可诱导培养6周的部分细胞产生内向整流钾电流。结论体外培养新生小牛视网膜神经元表达不同电压门控钾电流。某些神经元的电生理学特性在不同培养阶段发生变化。     

西地那非抑制低氧对人肺动脉平滑肌细胞电压依赖性钾通道的下调作用

目的探讨西地那非对低氧下调人肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)电压依赖性钾通道(voltage-dependent potassium channels,Kv)的干预作用。方法应用膜片钳技术记录PASMCs K+电流;观察低氧刺激前后钾离子(K+)电流的变化以及西地那非(sildenafil)的干预作用;通过特异性Kv1.5抗体透析,分析西地那非作用于人PASMCs Kv分子靶点即通道亚单位;运用Real-time PCR及Western blotting技术检测低氧刺激前后及西地那非对人PASMCs上的Kv1.5通道基因转录水平和蛋白表达水平的影响。结果低氧明显抑制了人PASMCs细胞膜上的全细胞K+电流;而西地那非则可以对抗低氧对全细胞K+电流的抑制作用;而且西地那非对低氧下人PASMCs Kv的调控作用靶点主要是Kv1.5;同时西地那非部分恢复了低氧抑制的细胞上的Kv1.5 mRNA和蛋白表达。结论西地那非能够抑制低氧对人肺动脉平滑肌细胞电压依赖性钾通道功能与表达的下调作用。     

High extracellular potassium ion concentration attenuates the blockade action of ketanserin on Kv1.3 channels expressed in xenopus oocytes

Background Ketanserin （KT）, a selective serotonin （5-HT） 2-receptor antagonist, reduces peripheral blood pressure by blocking the activation of peripheral 5-HT receptors. In this study electrophysiological method was used to investigate the effect of KT and potassium ion on Kv1.3 potassium channels and explore the role of blocker KT in the alteration of channel kinetics contributing to the potassium ion imbalances. Methods Kv1.3 channels were expressed in xenopus oocytes, and currents were measured using the two-microelectrode voltage-clamp technique. Results KCI made a left shift of activation and an inactivation curve of Kv1.3 current and accelerated the activation and inactivation time constant. High extracellular [K^＋] attenuated the blockade effect of KT on Kv1.3 channels. In the presence of KT and KCI the activation and inactivation time constants were not influenced significantly no matter what was administered first. KT did not significantly inhibit Kv1.3 current induced by tetraethylammonium （TEA）. Conclusions KT is a weak blocker of Kv1.3 channels at different concentrations of extracellular potassium and binds to the intracellular side of the channel pore. The inhibitor KT of ion channels is not fully effective in clinical use because of high [K^＋]. and other electrolyte disorders.     

非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏内源性H_2S合成减少

目的探讨非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)大鼠肝脏硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)变化及与肝细胞线粒体损伤的可能关系。方法采用雄性SD大鼠26只,分为正常对照组(n=6),NASH模型组(n=10)及复方牛胎肝提取物治疗组(n=10),高脂饮食12周建立NASH大鼠模型。亚甲基蓝分光光度法测定肝组织H2S生成率,RT-PCR及免疫组织化学测定肝组织CSEmRNA及其表达。透射电子显微镜观察肝细胞超微结构、PCR法测定肝细胞线粒体DNA(mtDNA)片段ND1、ND6、CO1、CYB及ATP6。结果 NASH大鼠模型组肝细胞线粒体肿大、膜模糊或嵴消失,正常组大鼠mtDNA片段ND1、ND6、CO1、CYB及ATP6表达明显高于模型组和治疗组(P<0.05)。NASH模型组肝组织H2S生成率〔(1.26±0.08)nmol/min〕较正常组〔(2.11±0.17)nmol/min〕明显减少(P<0.05),且肝脏CSEmRNA水平及其表达减少,治疗组与模型组比较差异无统计学意义。结论 NASH大鼠肝脏H2S合成减少可能与肝细胞线粒体损伤有关,H2S在NASH发病机制中可能具有保护肝脏的作用。     

基因芯片联合激光捕获显微切割技术在脊髓背根神经节基因表达研究中的应用

目的探索联合激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)与基因芯片技术在大鼠脊髓背根神经节的感觉神经元基因表达研究中的可行性。方法取大鼠L4、L5、L6节段脊髓背根神经节,用LCM技术获取神经细胞,提取总RNA,甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA质量,检测纯度和产量,并以实时RT-PCR方法进行验证。结果总RNA的完整性较好,经单轮T7线性扩增后得到足量的aRNA,可用于实时RT-PCR研究和进一步基因芯片杂交实验。结论结合有效的RNA保护方法和线性扩增,LCM可以分离出纯净的背根神经节的感觉神经元,满足下游基因芯片研究的要求。     

K<Superscript>+</Superscript> channels and their effects on membrane potential in rat bronchial smooth muscle cells

Summary In order to investigate the K⁺ channels and their effects on resting membrane potential (Em) and excitability in rat bronchial smooth muscle cells (BSMCs), the components of outward K⁺ channel currents and the effects of K⁺ channels on Em and tension in rat bronchial smooth muscle were observed by using standard whole-cell recording of patch clamp and isometric tension recording techniques. The results showed that under resting conditions, total outward K⁺ channel currents in freshly isolated BSMCs were unaffected by ATP-sensitive K⁺ channel blocker. There were two types of K⁺ currents: voltage-dependent delayed rectifier K⁺ channel (K_v) and large conductance calcium-activated K⁺ channel (BK_Ca) currents. 1 mmol/L 4-aminopyridine (4-AP, an, inhibitor of K_V) caused a significant depolarization (from −8.7±5.9 mV to −25.4±3.1 mV,n=18,P<0.001). In contrast, 1 mmol/L tetraethylammonium (TEA, an inhibitor of BK_Ca) had no significant effect on Em (from −37.6±4.8 mV to −36.8±4.1 mV,n=12,P>0.05). 4-AP caused a concentration-dependent contraction in resting bronchial strips. TEA had no effect on resting tension, but application of 5 mmol/L TEA resulted in a left shift with bigger pD₂ (the negative logarithm of the drug concentration causing 50% of maximal effect) (from 6.27±0.38 to 6.89±0.54,n=10,P<0.05) in the concentration-effect curve of endothine-1, and a right shift with smaller pD₂ (from 8.10±0.23 to 7.69±0.08,n=10,P<0.05) in the concentration-effect curve of isoprenaline. It was suggested that in rat BSMCs there may be two types of K⁺ channels, K_v and BK_Ca, which serve distinct roles. K_v participates in the control of resting Em and tension. BK_Ca is involved in the regulation of relaxation or contraction associated with excitation. LIU Xiansheng, male, born in 1969, M. D., Ph. D. This project was supported by a grant from the National Natural Sciences Foundation of China (No. 30270583).     

香烟烟雾及银杏叶对哮喘大鼠气道TGF-β_1表达的影响

目的探讨香烟烟雾(cigarette smoke,CS)及银杏叶对哮喘大鼠气道组织转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA和蛋白表达的影响。方法30只Wistar大鼠随机分为5组:1)哮喘烟熏组(A组);2)哮喘组(B组);3)哮喘烟熏+银杏叶治疗组(C组);4)哮喘+银杏叶治疗组(D组);5)对照组(E组)。用蛋白印迹法(Western blot)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组气道组织中TGF-β1蛋白和mRNA表达的变化。结果香烟烟雾可显著增加哮喘大鼠气道组织TGF-β1mRNA和蛋白的表达,银杏叶则可显著抑制其表达。结论香烟烟雾使哮喘大鼠气道组织TGF-β1的表达上调,提示银杏叶可能通过降低TGF-β1的表达发挥抑制哮喘的作用。     

齐墩果酸和去氧胆酸衍生物合成及抗血管生成活性研究

目的合成齐墩果酸、去氧胆酸-丙酮基衍生物并评价2者对新生血管生成的影响。方法以丙酮/K2CO3作为反应体系,利用溴代川芎嗪分别与齐墩果酸和去氧胆酸发生亲核取代反应,得到齐墩果酸和去氧胆酸衍生物。采用鸡胚绒毛尿囊膜模型(chorioallantoic membrane,CAM)对其进行在体新生血管活性评价。结果产物结构经1H-NMR、13C-NMR及IR确证为齐墩果酸乙酰甲酯和和去氧胆酸乙酰甲酯;二者作用于CAM模型后,新生血管的数目均比空白组减少。结论在丙酮/K2CO3/溴代川芎嗪反应体系中,得到齐墩果酸和去氧胆酸-丙酮基衍生物;经CAM模型测试发现去氧胆酸-丙酮基衍生物对新生血管具有较好抑制活性。