HO-1真核表达质粒的构建及在肾小管上皮细胞中的表达

[目的]构建HO-1基因真核表达质粒,转染大鼠肾小管上皮细胞,检测其在细胞中的表达效果.[方法]从大鼠肾组织中提取总RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增大鼠HO-1基因片段,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )中,运用脂质体将重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1转染大鼠肾小管上皮细胞,通过RT-PCR和Western blot分析HO-1基因细胞转染及表达的效果. [结果]成功构建了HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1.RT-PCR及Western blot分析显示,HO-1基因能转染大鼠肾小管上度细胞并在细胞内有效表达. [结论]HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1的成功构建及其在肾小管上皮细胞中的有效表达为深入研究其生物学作用奠定了基础.     

人乳腺珠蛋白基因疫苗的构建及其免疫原性研究

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因重组质粒pcDNA3.1-hMAM,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序后克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM。将重组载体脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法和ELISA检测目的基因的表达。结果:成功扩增hMAM基因,酶切测序表明,重组质粒含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM基因疫苗构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

潜伏活性的人可溶性TNFⅠ型受体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:采用基因工程技术,将转化生长因子β前体相关蛋白(LAP)通过基质金属蛋白酶(MMP)水解部位与人可溶性TNFⅠ型受体(hsTNFRⅠ)连接,构建pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白真核表达载体,获得LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白。方法:将编码MMP水解部位氨基酸的正反义DNA序列退火形成互补双链后定向克隆插入真核表达载体pcDNA3.1( ),得到pcDNA3.1/MMP重组体;将TGF-β1的LAP段和hsTNFRⅠ与MMP水解部位连接,获得pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ真核表达载体。测序鉴定后,脂质体介导重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR检测融合基因的表达。结果:酶切及测序结果证实pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ重组载体构建成功,转染后RT-PCR结果表明重组质粒在COS-7细胞中得到有效表达。结论:成功构建了融合蛋白真核表达载体pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ,并获得融合基因的瞬时表达,为进一步研究融合蛋白在子宫内膜异位症中的靶向治疗奠定了实验基础。     

单纯疱疹病毒II型gD糖蛋白在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pcDNA3/gD,并在体外COS-7细胞中进行表达。方法:体外PCR扩增出gD糖蛋白基因,克隆入真核表达质粒pcDNA3中。PCR、酶切和测序证实插入的gD基因正确后,转染COS-7细胞,用原位ELISA鉴定表达蛋白。结果:构建了pcDNA3/gD真核表达质粒,经原位ELISA证实,转染COS-7细胞表达的gD蛋白能和gD单克隆抗体ID3和DL11结合,证明该蛋白具有天然gD蛋白的抗原性。结论:构建的重组真核表达质粒pcDNA3/gD能够在COS-7细胞中表达。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型gD糖蛋白在真核细胞中的表达

目的：构建真核表达质粒pcDNA3／gD，并在体外COS-7细胞中进行表达。方法：体外PCR扩增出gD糖蛋白基因，克隆入真核表达质粒pcDNA3中。PCR、酶切和测序证实插入的gD基因正确后，转染COS-7细胞，用原位ELISA鉴定表达蛋白。结果：构建了pcDNA3／gD真核表达质粒，经原位ELISA证实，转染，COS-7细胞表达的gD蛋白能和gD单克隆抗体ID3和DL11结合，证明该蛋白具有天然gD蛋白的抗原性。结论：柯建的重组真核表达质粒pcDNA3／gD能够在COS-7细胞中表达。     

人乳腺珠蛋白基因真核表达载体的构建及其表达

[目的]构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础.[方法]利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序分析后,克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM.将重组载体用脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达.[结果]成功扩增hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达.[结论]hMAM基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据.     

hMAM与人HSP70融合基因真核表达载体的构建与表达

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)与人热休克蛋白70(hHSP70)融合基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,经酶切测序分析后,与人HSP70基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建了融合基因真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70。将重组载体电穿孔法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达。结果:成功扩增了人HSP70基因与hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM与人HSP70的融合基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM与人HSP70融合基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

全长型人Smac基因真核表达载体构建及表达

目的 构建全长型(full length,FL)人Smac基因(hSmac)真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中表达.方法 应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人宫颈癌细胞株Hela中扩增到Smac CDs基因片段,构建重组真核表达载体peDNA3.1 -FL hSmae.PCR、酶切鉴定重组质粒正确后,通过脂质体介导将其和作为阴性对照的空载体pcDNA3.1 分别转染人肝癌细胞株(SMMC-7721).同时转染含EGFP的质粒pcDNA3.1 -EGFP.利用荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率.采用RT-PCR、western blot法检测外源基因Smac的表达.结果 PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人Smac基因克隆成功.且鉴定证实真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac构建成功.流式细胞术检测到转染效率高达48%,荧光显微镜下也可见非常明亮的绿色荧光.无论是在mRNA水平还是蛋白水平上,转染后的细胞中外源基因Smac表达均明显增加.结论 成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中明显表达,为研究Smac基因在细胞凋亡过程中的调控作用.以及探讨以Smac基因为基础的肿瘤基因治疗策略提代基础依据.     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据。方法提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定。结果扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL。     

小鼠无纤毛柱状上皮细胞分泌蛋白基因真核表达载体的构建及其生物活性的鉴定

目的克隆小鼠无纤毛柱状上皮细胞分泌蛋白(CCSP)基因并构建其真核表达重组体,鉴定重组CCSP的生物学活性。方法采用TRIzol法提取小鼠肺组织总RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对CCSP基因进行扩增,Bam H I和XhoⅠ双酶切扩增产物与真核表达载体p CDNA3.1(+),酶切产物连接并转化入感受态细胞Trans 5α,阳性重组质粒p CDNA3.1(+)-m CCSP经PCR、酶切和测序鉴定正确后,通过DNAfectin 2100 DNA转染试剂将重组质粒转染人胚肾(HEK293T)细胞,采用Western blot法检测表达产物。脂多糖分别刺激转染有p CDNA3.1(+)-m CCSP和p CDNA3.1(+)质粒DNA的HEK 293T细胞,利用磷脂酶A2的水解作用,以掺入大肠杆菌膜的[3H]标记的油酸为酶解底物,检测HEK 293T细胞内PLA2的活力。结果聚合酶链反应结果显示,从小鼠肺组织中扩增出约290 bp的片段。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒p CDNA3.1(+)-m CCSP构建成功且序列正确。Western blot结果显示,在转染p CDNA3.1(+)-m CCSP的HEK293T细胞中有CCSP蛋白的表达,蛋白质分子量约为10 k Da,而转染空质粒组未见表达。CCSP蛋白可以显著降低脂多糖诱导的HEK 293T细胞内PLA2的活力。结论成功构建了真核表达重组体p CDNA3.1(+)-m CCSP,且重组蛋白CCSP具有生物学活性,为进一步研究其功能奠定了基础。     

人细胞间黏附分子1cDNA的克隆及表达载体的构建

目的 构建人细胞间黏附分子-1真核表达重组体pcDNA3．1hisB-ICAM-1。方法 设计、合成ICAM-1基因序列特异性引物，从肝癌组织中提取总RNA，以此为模板经RT-CR扩增人ICAM-1的cDNA片段；然后将其克隆到pGEM-T Easy Vector，构建中介重组体(pGEM-ICAM-1)，再克隆，构建真核表达重组体pcDNA3．1HisB-ICAM-1，经菌落PCR和限制性酶切有目的片段出现，进行DNA序列分析。结果 RT-PER扩增得到人成熟ICAM-1的cDNA片段大小为1622bp，中介重组体(pGEM-ICAM-1)，酶切后与真核表达载体连接，根据酶切鉴定和DNA序列分析得到真核表达重组体pcDNA3.1HisB-ICAM-1；结论：成功构建了真核表达重组体pcDNA3．1HisB-ICAM-1。     

外源性血管内皮生长因子基因在新生鼠缺氧缺血性脑损伤模型中的表达

目的:研究外源性血管内皮生长因子(VEGF)在新生鼠缺氧缺血脑损伤(Hypoxic-ischemic brain damageHIBD)模型中的表达情况。方法:构建了负载有鼠VEGF120 cDNA的真核表达质粒pCDNA3.1,建立新生鼠缺氧缺血脑损伤模型,将质粒注射至新生鼠缺氧缺血脑损伤局部,探讨外源性VEGF在新生鼠脑内的表达情况。应用VEGF免疫组织化学方法检测转移pCDNA3.1/rVEGF120真核表达质粒后大鼠脑中VEGF的表达情况。结果:与转移空载质粒的对照组相比,脑内注射外源性VEGF基因,在大脑皮质及海马的神经细胞、神经胶质细胞及血管内皮细胞胞浆中高度表达。结论:在HIBD模型中,脑内注射的外源性VEGF基因在大脑皮质及海马处神经细胞、胶质细胞、血管内皮细胞胞浆中高度表达。     

HSV 2多功能蛋白ICP27真核表达载体构建及其在Vero细胞中的表达

目的构建单纯疱疹病毒2型（HSV 2） 多功能蛋白感染细胞多肽27（ICP27）真核表达载体pCDNA3.0 ICP27,并检测其在非洲绿猴肾细胞（Vero）中的表达。方法提取病毒株HSV 2333 DNA,用高保真DNA聚合酶对多功能蛋白ICP27基因进行高保真扩增,用双酶切连接至真核表达载体pCDNA3.0中。pCDNA3.0 ICP27经双酶切、测序验证,并通过脂质体介导质粒瞬时转染Vero 细胞,经RT PCR和Western blot检测ICP27蛋白的表达。结果pCDNA3.0 ICP27经双酶切可切出目的片段,测序结果经比对,与基因库中的序列完全一致。转染后经RT PCR 和Western blot检测,证实转染重组质粒组有ICP27蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到ICP27的表达。结论成功构建了HSV 2 多功能蛋白ICP27真核表达载体pCDNA3.0 ICP27,并能在Vero 细胞中表达。     

结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因的真核表达载体pcDNA3-Rv3873，并对其进行鉴定。[方法]利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因，并将其定向克隆至原核载体pGEx-4T-1中，经测序鉴定后，将重组质粒pGEX-4T-1-Rv3873中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建重组子pcDNA3．1-Rv3873，通过限制性内切酶切酶及PCR进行鉴定。[结果]克隆的Rv3873基因序列与GenBank公布的一致性为100％，限制性内切酶酶切及PCR分析表明Rv3873已成功插入pcDNA3．1（＋）中。[结论]成功构建了Rv3873基因真核表达载体，为进—步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。     

真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1的构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的构建pcDNA3．1－RASSFl真核表达载体,并检测其对肝癌细胞系HepG2凋亡的影响。方法应用聚合酶链反应技术从人RASSFlcDNA中扩增出RASSF1基因后,以内切酶XhoI和EcoRI进行双酶切,将其克隆人用相同酶处理的载体pcDNA3．1;将重组质粒pcDNA3．1－RASSF1转染肝癌HepG2细胞,应用Westernblot法检测RASSF1的表达水平;用AnnexinV／PI法检测细胞的凋亡情况。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3．1．RASSF1构建成功;Westernblot法结果表明转染pcDNA3．1-RASSF1后HepG2细胞中RASSFl表达升高;AnnexinV／PI法用流式细胞术检测凋亡,空白组、pcDNA3．1组和pcDNA3．1-RASSFl组HepG2细胞的凋亡率分别为（5．8±0．42）％、（7．48±0．68）％和（35．1±3．15）％。结论真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1构建成功;RASSF1蛋白在HepG2细胞中高表达,并促进细胞凋亡。     

肿瘤转移抑制基因KiSS-1的克隆与真核表达载体的构建

目的克隆不含信号肽的人肿瘤转移抑制基因KiSS-1,构建KiSS-1基因的真核表达载体并鉴定。方法从正常人膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,将其克隆到真核表达栽体pcDNA3.1( ),构建真核表达质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1。结果经基因序列分析及PCR和酶切鉴定,证实目的基因片段已成功插入载体pcDNA3.1( )且序列正确。结论重组质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1构建成功,为下一步KiSS-1蛋白的表达和研究该蛋白的功能奠定了良好的基础。     

卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒构建与表达

[目的]构建大鼠源卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒,进行表达。[方法]以卡氏肺孢子虫DNA为模板,应用PCR扩增MSG基因片段,连接至pGEM-T Easy载体,再克隆至PCDNA3.1( )载体。构建的重组表达质粒经酶切、PCR鉴定后转染至COS-7细胞,并进行大量增殖。RT-PCR验证转染基因的表达。[结果]重组表达质粒PCDNA3.1( )/MSG经酶切及PCR鉴定结果表明构建成功。RT-PCR结果显示MSG基因片段成功转染至COS-7细胞,并在其中进行基因表达。[结论]成功构建了PCDNA3.1( )/MSG重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究打下基础。     

结核分支杆菌抗原ESAT-6真核表达质粒在COS-7中的表达

目的 探讨结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT—6基因真核表达重组质粒在真核细胞(COS—7)中的表达。方法 用LipofectAMINE^TM2000介导真核表达重组质粒pcDNA3．1( )—ESAT—6转染真核细胞COS—7，72h后，通过RT—PCR和Western Blotting试验鉴定ESAT—6基因在COS—7中的表达。结果 通过RT—PCR从转染了pcDNA3．1( )—ESAT—6的006—7中检测到目的基因mRNA的转录；Western Blotting试验鉴定在转染pcDNA3．1( )—ESAT—6的COS—7的细胞裂解上清液中有ESAT—6基因的表达蛋白。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ES—AT—6真核表达重组质粒能够在真核细胞COS—7中表达ESAT—6蛋白，为进一步研究其特性及为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下了基础。