通心络治疗缺血再灌注损伤机制的脑片研究

目的通过器官型脑片研究通心络含药血清对缺血再灌注损伤的治疗作用及机制。方法制备生后3d SD的全脑器官型脑片,随机分为缺血再灌注脑片模型组和正常对照组,各组根据干预方式的不同再分为大剂量含药血清组、小剂量含药血清组、对照血清组、空白组,于干预后不同时间通过倒置显微镜及免疫荧光染色观察通心络对脑片上神经干细胞增殖、迁移、分化的影响。结果经含药血清干预后室下区、海马齿状回单位区域新生细胞(nestin )数量增多,正常对照组新生细胞密度高于缺血再灌注脑片模型组(P<0.05);两组1,3,7d时新生细胞数量均按照大剂量含药血清组、小剂量含药血清组、对照血清组、空白组顺序递减(P<0.05);因新生细胞向外迁移,随着培养时间延长上述区域新生细胞密度逐渐减少;1d时各组均有大量nestin 新生细胞,7d时只有大、小剂量含药血清组有少量nestin 新生细胞。结论通心络可能通过促进神经干细胞的增殖迁移和分化来治疗缺血再灌注损伤,其效应随剂量增加而增强。     

通心络治疗缺血再灌注损伤机理的脑片研究

目的 通过器官型脑片研究通心络含药血清对缺血再灌注损伤的治疗作用及机制。方法 制备P3 SD的全脑器官型脑片，随机分为缺血再灌注脑片模型组和正常对照组，各组根据干预方式的不同再分为大剂量含药血清组、小剂量含药血清组、对照血清组、空白组，于干预后不同时间通过倒置显微镜及免疫荧光染色观察通心络对脑片上神经干细胞增殖、迁移、分化的影响。结果 经含药血清干预后室下区、海马齿状回单位区域新生细胞（nestin+）数量增多，正常对照组新生细胞密度高于缺血再灌注脑片模型组（P<0.05）；两组1d、3d、7d时新生细胞数量均按照大剂量含药血清组、小剂量含药血清组、对照血清组、空白组顺序递减（P<0.05）；因新生细胞向外迁移，随着培养时间延长上述区域新生细胞密度逐渐减少；1d时各组均有大量nestin+新生细胞，7d时只有大、小剂量含药血清组有少量nestin+新生细胞。结论 通心络可能通过促进神经干细胞的增殖迁移和分化来治疗缺血再灌注损伤，其效应随剂量增加而增强。     

缺血再灌注损伤大鼠脑内神经巢蛋白的变化及通心络对它的影响

目的 探讨神经巢蛋白（nestin）在脑缺血再灌注损伤后神经细胞的活化增殖情况及通心络对其影响。方法 采用大鼠缺血再灌注损伤（MCAO）模型，应用免疫组织化学方法观察缺血后3、7、14以及21d缺血侧室管膜及室管膜下区（SVZ）、海马齿状回（HDG）神经巢蛋白的变化。给予模型大鼠通心络灌胃，观察神经干细胞增殖分化的变化。结果 神经巢蛋白阳性细胞随缺血再灌注时间的延长，荧光强度值增加，第7、14、21天组与假手术组比较，差异具有显著性（P〈0．05）。造模后通心络组BrdU阳性细胞荧光强度值和BrdU＋nestin免疫双标荧光强度值均高于脑缺血再灌注模型组,差异显著（P〈0．05）。结论 大鼠缺血再灌注损伤后可引起其缺血侧SVZ、HDG区神经干细胞反应和增殖；而通心络可显著增加MCAO大鼠神经干细胞增殖分化能力。     

丙泊酚对大鼠胚胎神经干细胞增殖及分化的影响

目的探讨丙泊酚对体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)增殖及分化的影响。方法采用孕14～16 d Wistar大鼠,进行NSCs原代培养并用Nestin鉴定,按以下给药分成六组:空白对照组(control)、脂肪乳对照组(introlipid)、丙泊酚不同浓度组[5、25、50、100μmol/l],用5-溴脱氧尿(Brdu)掺入法观察丙泊酚对胚胎神经干细胞增殖的影响。胚胎神经干细胞诱导分化过程中加入50μmol/l丙泊酚,采用NeuN、GFAP免疫组化法观察丙泊酚对胚胎神经干细胞分化的影响。结果分离培养的神经干细胞95%以上呈Nestin阳性,不同浓度丙泊酚组Brdu阳性细胞百分数没有差异,丙泊酚NeuN阳性细胞百分数(23.1±0.9%)明显高于对照组(13.4±0.8%)(P<0.05),而GFAP细胞阳性细胞数与对照组相比没有明显差异。结论临床相关剂量丙泊酚对体外培养大鼠神经干细胞增殖没有影响,但能诱导神经干细胞向神经元细胞分化。     

大鼠孕期染邻苯二甲酸二丁酯对子代神经干细胞增殖分化的影响

目的 探讨大鼠孕期染环境雌激素邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)对子代神经干细胞增殖和分化的影响.方法 40只SD孕鼠随机分为3个不同DBP剂量[25、75、225 mg/(kg·d)]的实验组和对照组,各组孕鼠自E0起分别给予不同剂量DBP或玉米油溶剂灌胃直至生产.取新生大鼠进行神经干细胞培养,检测计数细胞克隆形成率、克隆球直径大小;分离的神经干细胞进行分化培养,以Neu-N和GFAP免疫荧光检测DBP干预后的神经干细胞分化为神经元与星形胶质细胞的比例差别与形态变化.结果 大鼠孕期染DBP致子代神经干细胞增殖能力降低.与对照组相比,中、高剂量染毒组新生鼠神经干细胞克隆率明显低于对照组[实验对照组克隆率为(40.53±4.65)%;药物处理组克隆率分别为(30.96±3.80)%、(15.35±5.29)%、(6.58±1.43)%,P<0.01].高剂量处理组克隆球的直径也明显小于对照组.DBP高剂量组神经干细胞分化为星形胶质细胞比例显著增加[高剂量组为(36.8±3.5)%,而对照组为(30.8±2.4)%,P<0.01 ].分化后的神经元和神经胶质细胞形态随着染毒浓度增大,形态变化明显.星形胶质细胞的细胞突起逐渐变短,变粗,以高剂量染毒后为明显.结论 大鼠孕期染DBP会影响子代神经干细胞的增殖与分化,从而影响神经系统的发育.     

通心络超微粉对局灶性脑缺血大鼠神经行为学和脑梗死面积的影响

目的探讨通心络超微粉对局灶性脑缺血大鼠神经行为学和脑梗死面积的干预作用。方法利用开颅结扎法阻断大鼠一侧大脑中动脉制作局灶性脑缺血模型（MCAO）,筛选后随机分为假手术组、模型组、通心络大剂量组、通心络中剂量组、通心络小剂量组、尼莫地平组,灌胃给药3 d、7 d、14 d后,积分法测定MCAO大鼠神经行为学评分,氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法测定大脑梗死面积。结果给药3 d后,通心络大剂量组、尼莫地平组与模型组比较差异有统计学意义（P〈0.05）,通心络大剂量组与尼莫地平组比较差异无统计学意义（P〉0.05）,通心络中、小剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。给药7d后,通心络大剂量组、通心络中剂量组、尼莫地平组与模型组比较差异均有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）,且通心络大剂量组优于通心络小剂量组（P〈0.05）;给药14 d后,通心络大剂量组、通心络中剂量组、通心络小剂量组、尼莫地平组与模型组比较差异均有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）,且通心络大剂量组优于通心络中、小剂量组及尼莫地平组（P〈0.05）。结论通心络能够显著改善局灶性脑缺血模型大鼠神经功能障碍,缩小脑梗死面积,具有显著的神经保护作用。     

表皮生长因子对大鼠胚胎神经干细胞增殖分化的影响

目的：建立神经干细胞分离、培养的技术方法，探讨表皮生长因子(EGF)对大鼠胚胎神经干细胞增殖、分化的影响。方法：从大鼠胚胎大脑组织中分离、培养神经干细胞，并用EGF和血清诱导其分化，采用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞增殖和分化的神经样细胞。结果：大鼠胚胎神经干细胞在无细胞因子和血清的培养基中无新生细胞形成，但能在EGF和血清的诱导下产生nestin和BrdU阳性细胞，细胞贴壁后分化为神经元和星形胶质样细胞。结论：EGF和血清能促进神经干细胞增殖，并诱导其向神经元样和星形胶质样细胞分化。     

EDS对新生SD大鼠海马神经干细胞增殖分化的作用

目的观察在不同剂量蜕皮甾酮（ecdysterone,EDS）作用下,体外培养的神经干细胞（neural stem cells,NSCs）增殖、分化情况。方法原代培养新生SD大鼠海马NSCs,经EDS处理后,传代细胞克隆形成率、四甲基偶氮唑盐比色法观察神经干细胞增殖能力的变化,免疫荧光细胞染色技术、流式细胞术检测神经干细胞分化情况。结果与对照组相比,中低剂量组（50、100、200mg／L）,对大鼠海马NSCs增殖能力无显著影响,而高剂量的EDS（400mg／L及800mg／L）干预组则明显抑制了NSCs的增殖。在分化条件下,EDS200mg／L干预组显著提高NSCs向神经元分化的比例,其余各组无统计学差异。结论EDS能够调节体外培养的大鼠海马NSCs的增殖和分化水平,在合适的剂量下明显提高了神经元的分化比例。     

胚胎神经上皮干细胞体外克隆增殖与分化的实验研究

目的观察胚胎神经上皮干细胞在体外克隆增殖和诱导分化的情况。方法取孕11 d大鼠的胚胎,经分离获得神经管上皮细胞,在无血清培养基内克隆、增殖、传代。取不同时期的神经球进行神经干细胞的鉴定和诱导分化,并通过免疫组织化学染色鉴定分化的结果。结果胚胎神经上皮干细胞在体外能够克隆、增殖,形成的神经球呈nestin阳性,在分化培养基内可分化为星型胶质细胞和神经元。结论胚胎神经上皮干细胞可在体外进行单细胞克隆和诱导分化。     

施万细胞对共培养的神经干细胞增殖与分化的影响

目的:探讨施万细胞诱导神经干细胞增殖与分化的影响因素。方法:大鼠胚胎神经干细胞单独培养及与新生SD大鼠施万细胞共培养,观察神经干细胞的形态变化,并分别检测特异性标志蛋白S-100、NF和GFAP的表达。结果:相差显微镜下可见共培养组大部分神经干细胞伸出多个细长突起;与单独培养组相比,免疫荧光染色显示共培养组NF表达阳性细胞数多;GFAP表达阳性细胞数少。结论:施万细胞可促进共培养的神经干细胞增殖,并可诱导神经干细胞向神经元方向分化。     

神经干细胞在胚胎脑皮质发育过程中的变化

目的 比较3个不同胚胎时期神经干细胞的增生、分化和凋亡等生物学性状,了解胚胎脑皮质发育过程.方法E14、 E18和E20胎鼠前脑脑皮质来源的神经干细胞在原代培养后,用BrdU细胞增生检测试剂盒检测增生能力;诱导分化7天后,对细胞分别进行MAP2和GFAP免疫荧光标记和Hoechst 33342核染色,计算MAP2 细胞和GFAP 细胞占Hoechst 细胞的各自比例;用Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测早期凋亡率.结果 3组神经干细胞的OD值分别是:E14为1.1771±0.0422(n=22),E18为0.4127±0.0328(n=23),E20为0.2117±0.0456(n=16)(均为P<0.001);E14神经元细胞比例和星形胶质细胞比例分别为:81.96%±4.91%(n=10)和16.63%±4.05%(n=10),E18为27.56%±3.54%(n=10)和58.98%±5.91%(n=10),E20为4.75%±2.39%(n=10)和89.43%±3.40%(n=10)(均为P<0.001);早期凋亡率分别为:E14为41.12%±9.75%(n=8),E18为56.30%±9.35%(n=19),E20为5.74%±3.31%(n=9)(均为P<0.01).结论神经干细胞的增生能力随着胚胎发育变得越来越弱,而凋亡比例先小后大,最后逐渐变小.神经干细胞分化为神经元细胞的比例随着胚胎发育过程会越来越小,而星形胶质细胞的比例会越来越大.     

磁标记大鼠神经干细胞移植入脑缺血大鼠的磁共振示踪

[目的]使用菲立磁（Feridex）体外标记胎鼠神经干细胞（neural stem cells,NSCs）,并在移植脑缺血大鼠后进行活体MRI示踪观察。[方法]分离、培养大鼠胚胎源性神经干细胞,使用“Feridex-多聚赖氨酸复合物（FE-PLL）” ,标记神经干细胞,对标记细胞分别进行普鲁士蓝染色、电镜观察,将FE-PLL标记神经干细胞分别移植人脑缺血大鼠左右侧脑室内,活体移植后1、5、14d体内MRI示踪。[结果]菲立磁可以高效率地标记神经干细胞,普鲁士蓝染色显示FE-PLL标记神经干细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。电镜结果显示FE-PLL标记的神经干细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡。MRI检查发现脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变。[结论]菲立磁可以用来体外标记神经干细胞,利用MRI技术可以对脑内移植后的标记细胞进行初步的活体追踪。     

Effect of Rat Schwann Cell Secretion on Proliferation and Differentiation of Human Neural Stem Cells

Objective:To investigate the effect of rat Schwann cell secretion on the proliferation and differentiation of human embryonic neural stem cells(NSCs).Methods:The samples were divided into three groups.In Group One,NSCs were cultured in DMED/F 12 in which Schwann cells had grown for one day.In Group Two,NSCs and Schwann cells were co-cultured.In Group Three,NSCs were cultured in DMEM/F12.The morphology of NSCs was checked and β-tubulin,GalC,hoechst 33343 and GFAP labellings were detected.Results:In Group One,all neural spheres were attached to the bottom and differentiated.The majority of them were β-tubulin positive while a few of cells were GFAP or GalC positive.In Group Two,neural Spheres remained undifferentiatied and their proliferation was inhibited in places where Schwann cells were robust.In places where there were few Schwann cells,NSCs performed in a similar manner as in Group One.In group Three,the cell growth state deteriorated day after day,On the 7th day,most NSCs died.Conclusion:The secretion of rat Schwann cells has a growth supportive and differentiation-inducing effect on human NSCs.     

LIF对人胚神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨LIF对人胚神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法:从孕24周流产胎儿脑组织中分离NSCs,并分4组培养。对照组用基础培养液,第1,2,3实验组分别于基础培养液中加入20μg/L EGF和B27,20μg/L LIF和B27,20μg/L LIF、20μg/L EGF及B27。观察细胞生长情况并在不同时间进行细胞计数。诱导细胞分化后,显微镜下观察。结果:培养3 d细胞开始分裂并聚集成球,后逐渐增大,培养10 d,第1,2,3实验组和对照组神经球形成数分别为(21.5±7.8),(23.8±5.4),(25.2±6.3)和(24.8±6.9),各组间差异无统计学意义。分化实验显示含LIF培养的神经干细胞分化少。结论:在体外,LIF能够促进神经干细胞的增殖并抑制神经干细胞的分化。     

超顺磁性氧化铁对大鼠神经干细胞生物学活性的影响

目的 初步研究利用超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓基质细胞来源的神经干细胞及其对细胞活力、增殖等生物学活性的影响,并确定最佳标记浓度.方法 无菌条件下取大鼠股骨骨髓,梯度密度离心法分离得到骨髓基质细胞.体外培养、诱导成神经干细胞,使用不同终浓度的(6.25、12.5、25、37.5、50μg/ml)Ferumoxides(超顺磁性氧化铁)标记神经干细胞,采用普鲁士蓝染色、MTT法、流式细胞仪、透射电镜等方法鉴定Ferumoxides标记神经干细胞的效率及对细胞活力、增殖等生物学特性的影响.结果 Ferumoxides可以高效率标记神经干细胞,标记效率在90%以上.普鲁士蓝染色显示标记的神经干细胞胞质内存在细小蓝色铁颗粒,细胞呈淡蓝至深蓝色,颜色的深浅与所加Ferumoxides的剂量成正相关.电镜结果显示标记的神经干细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡,主要集中在胞体上.当Ferumoxides终浓度高于25 μg/ml时,Ferumoxides颗粒在细胞内聚集成团块状,量较多,在一定程度上影响了细胞超微结构的观察;低于25 μg/ml时,Ferumoxides颗粒散布于细胞胞质内,并随着浓度的降低,Ferumoxides颗粒在胞质内分布越分散,量越少.MTT及流式细胞仪结果显示Ferumoxides终浓度大于25 μg/ml时则对细胞活力、增殖、凋亡有一定影响,小于等于25 μg/ml时对细胞活力、增殖无明显影响.结论 利用Ferumoxides在体外标记神经干细胞是一种可行的实验方案,其最佳终浓度为25 μg/ml.     

缺氧对体外培养的鼠胚神经干细胞分化的影响

目的分离大鼠胚胎皮质神经干细胞（NSCs）进行体外培养,探讨缺氧对体外培养的鼠胚大脑皮质神经干细胞分化的影响。方法对孕14d（E14d）大鼠取鼠胚脑皮质用无血清培养技术分离培养神经干细胞,血清：培养基贴壁诱导分化。通过免疫细胞化学染色检测细胞分化情况;NSCs采用三气培养箱予以不同缺氧干预,缺氧培养后再用10％胎牛血清培养基进行贴壁分化,用MAP2免疫荧光染色检测缺氧对NSCs向神经元方向分化的影响。结果①大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;②缺氧干预实验中,5％O2组尤以72h组可诱导NSCs向神经元方向分化。结论从大鼠胚胎皮质可成功分离NSCs,缺氧可影响NSCs的分化,适度缺氧可诱导离体培养的大鼠脑皮质NSCs向神经元方向分化。     

不同条件对胎鼠海马神经干细胞增殖分化的影响

目的:探讨不同条件对胎鼠海马神经干细胞的增殖与分化的影响.方法:从胎鼠海马获取神经干细胞;新生鼠坐骨神经获取雪旺细胞.培养成功后对细胞进行鉴定.将提取的神经干细胞放在不同的培养条件下:雪旺细胞与神经干细胞共培养、DMEM/F12 bFGF EGF及DMEM/F12进行比较,观察其增殖和分化的情况.结果:含雪旺细胞的共培养组神经干细胞生长分化得最好,bFGF EGF组次之,DMEM/F12组生长的最差;共培养组细胞团之间建立了良好的突触联系,尤其是远距离的细胞间更为明显.此现象在bFGF EGF组及DMEM/F12组则没有出现,且该两组生长速度也较共培养组差.结论:雪旺细胞能更好的促进神经干细胞的生长、增殖和分化,它为神经干细胞提供了与活体内相似的环境 .     

绿色荧光蛋白转基因胎鼠神经干细胞的超顺磁性氧化铁标记

目的探讨超顺磁性氧化铁（SPIO）标记对绿色荧光蛋白（GFP）转基因胎鼠神经干细胞（NSCs）的标记效果及标记后对其生物学特性的影响.方法采用多聚赖氨酸（PLL）介导SPIO的方法标记NSCs,用普鲁士蓝染色观察标记后NSCs内铁,比较标记和未标记NSCs的GFP表达、活力、增殖、凋亡及多向分化能力.结果普鲁士蓝染色示标记NSCS胞质内见大量蓝色颗粒,细胞的活力、增殖、凋亡及多向分化能力检测均显示两组细胞间无明显差别.结论用PLL介导SPIO标记NSCs是一种可行、安全、有效的细胞内标记方法.