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重组水蛭素Ⅲ的分离纯化与鉴定 总被引:4,自引:0,他引:4
目的 :从分泌型重组水蛭素 Ⅲ 基因工程菌发酵液中分离纯化水蛭素 Ⅲ。 方法 :将发酵液经离心、大孔吸附树脂处理后 ,用DEAE- celluloseDE5 2离子交换层析 ,进而用HPLC反相层析。结果 :总收率达 5 0 %以上 ,纯度达 99.9% ,比活力达 90 0 0ATU/mg。结论 :分离纯化系统令人满意 ,回收率较高。 相似文献
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目的:在已有的分泌表达载体pTASH基础之上构建一种更为高效的新型大肠杆菌分泌表达载体,并检验其分泌表达水平是否提高。方法:提取原始质粒pTASH作为模板,用PCR扩增重组水蛭素基因表达盒片段以后,再插入到原表达载体pTASH的BamHⅠ位点上,从而产生含有两个串联的水蛭素基因表达盒单元的质粒p(TASH)2,转入大肠杆菌进行摇瓶表达。结果:双表达盒菌种p(TASH)2进行摇瓶水平的培养,其上清液抗凝血酶活性可达3 500 ATU.ml-1。结论:与单表达盒质粒pTASH的表达水平(2 000 ATU.ml-1)相比,双表达盒质粒p(TASH)2的摇瓶表达水平显著提高。 相似文献
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重组水蛭素临床应用的研究进展 总被引:3,自引:0,他引:3
重组水蛭素是一种特异的凝血酶抑制剂,它能与血浆中游离的和与纤维蛋白结合的凝血酶结合,以防止血栓形成。本文综述了重组水蛭素的临床应用,包括急性心肌梗死溶栓后的辅助治疗、治疗不稳定型心绞痛、深静脉血栓、Ⅱ型肝素相关的血小板减少症和弥漫性血管内凝血,并在血液透析和体外循环时预防血栓形成。 相似文献
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发酵液中重组水蛭素的分离纯化 总被引:6,自引:1,他引:5
目的:建立毕赤酵母(pichia)高密度表达的重组水蛭素(recombinant hirudin-2,rHV2)分离纯化工艺。方法:高密度培养重组毕赤酵母并诱导表达水蛭素至胞外,发酵液经超滤、透析、离子交换层析。分离纯化rHV2目的蛋白;采用SDS-PAGE和抗凝血酶活力分别检测目的蛋白纯度和活性。结果:纯化样品经SDS-PAGE电泳检测为单一条带,重组水蛭素比活性为6000ATU/mg,纯化收率达38.6%。结论:超滤、透析和离子交换层析可用于发酵液中大规模分离纯化重组水蛭素。 相似文献
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目的 研究了自行研制的重组水蛭素Ⅲ在大肠杆菌中的分泌表达产物的抗凝与抗血栓作用。方法 采用大鼠下腔静脉血栓模型和大鼠体外A V循环模型进行水蛭素Ⅲ (HV3)的抗凝及抗血栓作用研究。结果 给予重组水蛭素 2 5 ,5 0 μg/kg两剂量的大鼠下腔静脉血栓重量分别为 2 1.30± 7.35mg和 10 .4 0± 16 .2 0mg ,生理盐水对照组为 5 9.5 0± 4 .95mg ;重组水蛭素 5 0、2 5 μg/kg的血栓湿重为 15 .3± 3.6mg和 2 1.5± 5 .3mg ,生理盐水对照组为 4 8.6± 4 .9mg。结论 重组水蛭素Ⅲ可显著减少静脉血栓重量 ,能显著地降低体外循环的血栓湿重 ,与生理盐水组比较具有很显著的差异 ,结合体外抗凝实验等结果表明 ,重组水蛭素Ⅲ具有很强的体外和体内抗凝抗栓作用 ,应用前景良好 相似文献
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目的研究重组水蛭素iv给药在大鼠体内的药动学。方法采用125-标记的放射性同位素法(RA法)、三氯醋酸沉淀结合放射性检测法(TCA-RA法)研究重组水蛭素iv给药在大鼠体内的药动学。结果大鼠iv0.5、1.0和2.0mg/kg重组水蛭素,以RA法检测,该药的消除半衰期(t1/2ke)分别为162.8、147.5和172.8min,AUC分别为264.9、429.9和1112.9(μg·min)/mL;以TCA-RA法检测,该药的t1/2ke分别为100、101和107min,AUC分别为160.7、327.7和551.3(μg·min)/mL。两种方法所得结果均证明AUC与剂量呈正相关,相关系数均大于0.99。大鼠iv重组水蛭素1.0mg/kg后用RA法和TCA-RA法测定不同组织的药物质量浓度,在各时间点以肾脏含药量显著高于其他组织,肺、胃、脾、心、肝、性腺等组织次之,脑、脂肪最少。大鼠iv重组水蛭素1.0mg/kg后,用RA法测定不同时间段内尿、粪的放射性总量,在96h内70.16%放射性从尿中回收,1.35%从粪中回收到,24h内胆汁排泄量为3.46%。结论RA法和TCA-RA法测得重组水蛭素在大鼠体内的药动学结果不同,但整体趋势一致;重组水蛭素主要由尿排泄。 相似文献
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重组水蛭素对恒河猴长期毒性研究 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:观察连续静注重组水蛭素 30 d对恒河猴的长期毒性.方法:健康雌雄恒河猴分别按体质量随机分为低、中、高剂量组(1.0、3.0和6.0 mg/kg)和空白对照组.连续30 d静注给药.末次给药后处死一半动物做病理解剖,另一半停药后继续观察15 d.观察和检测项目包括:(1)一般症状; (2)心电图; (3)凝血时间(CT)等血液学指标; (4) 凝血酶时间(TT)、部分凝血活酶时间(aPTT)等血液生化指标; (5)尿液检查; (6) 抗体测定; (7) 骨髓检查; (8)病理检查.结果:动物连续给药后,d15及d30给药后30 min采集的血样中,与d0或空白对照组相比,高、中、低剂量组的CT、TT、aPTT明显延长,且有量效关系.d15及d30给药后24 h及d45采集的血样中,上述指标恢复正常.d30及d45病理组织学检查发现每组均有部分动物出现肝、肾淤血,轻度细胞水肿,可能系动物的隐性感染而非药物所致.d30各组均可见部分动物注射部位皮肤出现小灶性出血和局部炎症反应,d45注射部位病理变化消失.其余观察指标未见明显异常.结论:重组水蛭素对猴血液系统有一定的药理毒理作用,主要表现为使高、中、低剂量组猴CT、TT、aPTT时间延长,且有量效关系.因此,重组水蛭素对猴药理毒理作用的靶器官为血液系统,其作用均是可逆的.重组水蛭素对猴的安全剂量为1.0 mg/kg.临床使用时应密切注意重组水蛭素对血液系统的影响. 相似文献
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目的 探讨重组水蛭素 (rH)抗大鼠静脉血栓形成作用。方法 应用Reyers法将大鼠随机分为 7组 ,各组分别自舌静脉注入不同药物或同一药物不同剂量 ,结扎下腔静脉后 6h ,观察血栓形成和血栓干重 ,并进行统计比较。结果 随rH剂量增加 ,血栓形成和血栓干重呈下降趋势 ,与正常对照组比较 ,具有显著性差异 (P <0 .0 1或P <0 .0 5 )。结论 rH具有较强的抗静脉血栓形成作用 相似文献
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目的 优选重组水蛭素-2(rHV2)鼻腔给药纳米粒最佳制备工艺。方法 采用壳聚糖与三聚磷酸钠复凝聚法,以包封率、载药量等为评价指标,以单因素考察和正交试验设计,对壳聚糖黏附纳米粒制备过程中有关影响因素及工艺参数进行优化。结果 壳聚糖的类型、壳聚糖溶液的pH值、壳聚糖与多聚磷酸钠的最终质量比以及搅拌速率对rHV2纳米粒的包封率和载药量均有较显著影响;优选工艺的包封率可达到70%以上,载药量>8%。结论 经优选的工艺稳定可靠,可用于rHV2鼻腔给药纳米粒的制备。 相似文献
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局部应用重组水蛭素治疗脑出血后脑水肿的实验研究 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 探讨局部应用凝血酶特异性抑制剂(重组水蛭素)治疗脑出血后保护机制。方法 成年雄性SD大鼠随机分为生理盐水组、脑出血组和水蛭素组(出血后3h)。以50m自体血注入大鼠尾状核方法建立脑出血模型,应用干一湿重法观察脑水肿变化,前肢放置实验观察行为学。每组每时相点(1、2、3、7、14、28天)各6只大鼠。结果 脑出血组和水蛭素组脑含水量与生理盐水组在24h、48h、72h比较P〈0.05,7天时各组间无明显差异(P〉0.05);脑出血组大鼠前肢放置实验结果与生理盐水组比较(P〈0.05),水蛭素组与脑出血组比较P〈0.05。结论 脑出血后24~48h水肿达高峰;重组水蛭素可明显减轻脑水肿,同时可以改善脑出血后的神经功能缺损。 相似文献
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目的:研究重组水蛭素的抗凝活性,为水蛭素新药开发提高实验依据,方法:家兔iv重组水蛭素前及后心脏采血,应用血凝仪测定凝血酶时间(TT),凝血酶原时间(PT),和活化的部分凝血活酶时间(APTT),并考察其抗凝活性的量效和时效关系。结果:重组水蛭素能明显延长TT和APTT,且呈剂量依赖性,但在所试剂量范围内对PT无明显影响,其延长TT和APTT的作用随时间而下降,作用持续约60min,结论:重组水蛭 素具有明显抗凝作用,明显强于现有抗凝药肝素,且其作用强度与同剂量德国产基因重组水蛭素Refludan相同。 相似文献
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脑血栓的发病率很高,引起的后果相当严重,抗脑血栓药物是当前研究的热点。近年,国内外对重组水蛭素(recombinant hirudin,rH)——一种由65个氨基酸组成的高效、特异的凝血酶抑制剂的研发取得了令人瞩目的进展。本研究组曾对国产rH的药效学和药动学进行了较深入的研究, 相似文献
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目的:考察甘油对毕赤酵母生长和重组水蛭素Ⅱ表达的影响。方法:在摇瓶和10L发酵罐中用含有不同浓度甘油的培养基培养毕赤酵母,测定毕赤酵母的生长和重组水蛭素Ⅱ的表达。结果:发酵培养基中初始甘油浓度为5 g/L时,毕赤酵母生长速度明显加快;补料过程中甘油浓度大于70 g/L时,毕赤酵母生长受到抑制。与不加甘油相比较,诱导表达期维持培养基中甘油浓度在5 g/L以下,重组水蛭素表达可提前4 h,诱导30 h其活性达13 000 ATU/mL,比仅用甲醇诱导时效价提高了7.7%。结论:降低初始培养基中甘油浓度有利于毕赤酵母生长,补料过程中培养基甘油浓度应维持在抑制毕赤酵母生长的浓度之下,诱导阶段培养基中少量的甘油有利于水蛭素的表达。 相似文献
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[目的 ]研究国产重组水蛭素 (r -hirudin ,rH)对家兔体外血栓形成的对抗作用 ,为rH的新药开发提供实验研究资料。 [方法 ]采用Chandler体外血栓形成模型 ,家兔ivrH前及iv后心脏采血 ,立即置于Chandler体外血栓形成仪中 ,测定体外血栓形成之栓长和血栓块干重 ,并与药前比较计算血栓形成抑制百分率。 [结果 ]量效关系研究表明rH 1.0、0 .5、0 .2 5和 0 .12 5mg·kg- 1iv后栓长抑制率分别为 10 0 %、96 .37%、36 .83%和 1.93% ,血栓干重抑制率分别为 10 0 %、97.5 6 %、4 5 .0 5 %和 4 .6 3%。时效关系研究表明rH 0 .5mg·kg- 1iv后 5、15、30、6 0及 12 0min对血栓栓长的抑制率分别为 96 .0 9%、93.94 %、4 2 .14 % (P <0 .0 1)和 - 2 .4 7%、- 5 .34% (P >0 .0 5 ) ,血栓干重抑制率分别为 97.81%、96 .0 3%、5 3.2 0 % (P <0 .0 1)和 0 .5 9%、8.2 6 % (P >0 .0 5 )。 [结论 ]国产rH具有明显的体外抗血栓作用 ,且具有明显的量效和时效关系。并与国外同类权威产品Reludan作用强度一致。 相似文献
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重组水蛭素对实验性白内障的防治作用 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:观察重组水蛭素(Recombinanthirudin,Rh)对实验性白内障的影响和对眼的刺激性。方法:采用D-半乳糖诱发哺乳期大鼠白内障模型和亚硒酸钠诱发哺乳期大鼠白内障模型进行试验,并用家兔进行眼刺激性试验。结果:Rh能减轻D-半乳糖和亚硒酸钠诱发哺乳期大鼠白内障模型的晶状体浑浊度,升高晶状体超氧化物歧化酶(SOD)活力,降低晶状体丙二醛(MDA)含量,对家兔眼无刺激性。结论:R-h对实验性白内障具有较好的防治作用,对眼无明显局部刺激性。 相似文献
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重组水蛭素对大鼠半乳糖性白内障的防治作用 总被引:1,自引:1,他引:0
目的:观察重组水蛭素对大鼠半乳糖性白内障的防治作用.方法:采用D一半乳糖诱发白内障,从实验开始第4天起各给药组分别结膜下注射,双眼点重组水蛭素.在实验开始第8,14天用检眼仪观察大鼠晶状体的变化,并在实验结束后取晶状体,测定晶状体中超氧化物歧化酶(SOD)活力,丙二醛(MDA)含量.结果:重组水蛭素可显著推迟白内障发生时间,减轻混浊程度,降低MDA含量及增大SOD活力.结论:重组水蛭素对半乳糖诱导的大鼠白内障有一定的防治作用. 相似文献
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弥散性血管内凝血(DIC)是发生于许多严重疾病复杂病理过程的一个重要中间环节。近年来有关DIC的研究进展主要集中在发病机制、诊断及治疗等方面,其中采用基因重组水蛭素治疗DIC是一个方向。水蛭素是目前发现的最强的凝血酶特效抑制剂,其作用不依赖于抗凝血酶Ⅲ,抗原性弱,少有过敏反应,在治疗DIC方面具有较好的前景。 相似文献
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水蛭素为活血化瘀中经水蛭的重要成分,现已通过基因重组技术大量制备,具有强大的抗凝抗栓作用。现对水蛭素的生理处置、临床前药动学和临床药动学及其血药浓度测定的研究进展进行综述,为水蛭素的进一步研究和临床应用提供科学依据。 相似文献