流感病毒RNA聚合酶亚基PA6片断的克隆及表达

目的将流感病毒RNA聚合酶PA6亚基片段进行亚克隆、表达,获得重组的亚克隆多肽,为进一步研究PA6亚基功能奠定基础。方法以PA亚基cDNA为模板,用PCR方法扩增出PA6片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pQE32重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导各亚克隆系高效表达,优化表达条件。结果PCR法扩增出402bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在E.coliM15中表达得到相对分子量约为17KD的重组蛋白,获得重组多肽。结论成功地亚克隆及表达了流感病毒RNA聚合酶PA6亚基。     

流感病毒RNA聚合酶蛋白PB1在小鼠中可诱导亚型间交叉免疫保护

目的探索流感病毒RNA聚合酶PB2和PB1亚基作为实验性流感疫苗候选抗原的可能性.方法以复制型质粒（pSCA）为载体分别构建表达甲1型和甲3型流感PB2和PB1的复制型DNA疫苗,免疫小鼠后分别用甲1型流感病毒（A/PR/8/34）进行鼻腔攻击,观察针对不同亚型流感病毒的复制型DNA疫苗的免疫保护效果.结果本实验所构建的复制型DNA疫苗在真核细胞中均可表达外源基因;本实验采用的复制型质粒载体（pSCA）与传统质粒载体（pcDNA3）在诱导小鼠产生抗体方面无差异,并且都诱导了偏向TH1类的免疫反应;表达甲1型和甲3型流感PB1基因的复制型DNA疫苗均可保护小鼠抵御甲1型流感病毒（A/PR/8/34）的攻击.结论表达甲型流感病毒PB1的复制型DNA疫苗能保护小鼠抵御同型和异型流感病毒的攻击,本实验为流感疫苗研究提供新的候选抗原.     

人整合素分α４亚基片段的克隆和表达

目的 克隆并表达人整合素分子α４亚基１.2kbcD-NA片段。方法 从ＨＬ－６０细胞系中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ法扩增人整合素分子α４亚基片段１.2kbcDNA(1753-2934bp),并将该片段亚克隆至表达载体pGEX-3X,用ＩＰＴＧ诱导表达。结果 克隆了α４亚基１.2kbcDNA片段。序列分析表明。其所编码的氨基酸序列与文献相比较只有一处错义突变（Ａrg→Ｇln),经分析突变对抗原性影响不大。将该片段亚克隆至表达载体pGEX-3X,经ＩＰＴＧ诱导在大肠杆菌中获得高效表达。结论 获得了α４亚基１.2kbcDNA片段及其原核表达产物。对研究α４整合素的功能具有重要意义。     

甲型流感病毒核蛋白基因的克隆表达及纯化

目的　将甲型流感病毒核蛋白(NP)基因克隆到原核表达载体进行可溶性融合表达,制备纯化的病毒核蛋白,为制备甲型流感病毒单克隆抗体提供材料。方法　提取甲型流感病毒RNA ,设计引物,RT PCR扩增NP基因,利用基因工程的手段,将甲型流感病毒的NP基因在大肠埃希菌中进行融合表达,并将表达产物进行亲和层析。结果　成功构建了甲型流感病毒NP基因原核表达载体,经亲和层析制备了较高纯度的目的表达产物。结论　通过合理控制发酵时间、生长温度和诱导物浓度,制备了较为理想的可溶性甲型流感病毒核蛋白。     

PA28γ蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备

目的蛋白酶体激活亚单位3（PA28γ）的表达、纯化及其多克隆抗体的制备。方法利用pGEX-4T-1原核表达系统表达PA28γ蛋白，经T-A克隆、亚克隆至pGEX-4T-1表达载体；将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR（DE3），诱导表达PA28γ蛋白，通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白（GST-PA28γ）；并用其免疫BALB／c小鼠制备多抗血清，对表达产物和多抗血清进行Westem-blot鉴定。结果成功构建原核表达质粒PA28γpGEX-4T-1。且测序正确；获得高纯度的PA28γ蛋白及其高效价的多克隆抗体血清，并得到Westem-blot证实。结论成功利用基因重组技术制备了PA28γ蛋白和抗PA28γ多克隆血清，为该蛋白的生物学功能研究奠定了基础。     

人神经系统特异表达RNA结合蛋白HuC cDNA的克隆、表达及纯化

目的克隆人神经系统表达RNA结合蛋白HuC的cDNA并原核表达纯化。方法提取人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞株总RNA,经RT-PCR扩增得到人HuC全长cDNA的克隆。将HuC cDNA克隆到原核表达载体pGEX4T-3载体中,并转化到大肠杆菌中,在获得高效表达后,利用GST纯化系统,对HuC重组蛋白进行纯化。结果经过表达及纯化条件的摸索,最终获得重组HuC蛋白。结论HuC蛋白是一种神经系统表达RNA结合蛋白,重组HuC蛋白的获得为HuC抗体的制备及进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

人整合素分子α4亚基片段的克隆及大肠杆菌的表达

目的 克隆并原核表达α４亚基笥段。方法 从ＩＬ－６细胞系中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ方法分两段扩增人整素分子α４亚基片段２．０ｋｂ ｃＤＮＡ,将两片段连接,并将其中的１．７ｋｂ基因片段亚克隆至表达载体ＰＧＥＸ－ＫＧ中,ＩＰＴＧ诱导表达。结果 ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆了α４的两段ＣＤＮＡ,序列分析表明：与文献报道的μ４ＣＤＮＡ序列基本一致。两片段成功连接后将其中的１．７ｋｂ亚克隆至表达载体ＰＧＥＸ－     

RNA聚合酶Ⅱ启动子shRNA表达载体构建的研究进展

一系列研究表明,一些小分子RNA操纵着许多细胞功能,它们通过互补序列的结合反作用于DNA,从而关闭或调节基因的表达。RNA是生物体内最重要的物质基础之一,它与DNA和蛋白质一起构成生命的框架。microRNA（miRNA,即微小RNA）可以通过与特定mRNA结合或调节特定mRNA的蛋白质翻译过程来调控基因表达。目前人类基因组中已确认的miRNA有几百个,可能参与30％人类蛋白质的表达调控。     

人整合素分子α4亚基片段的克隆和表达

目的克隆并表达人整合素分子α4亚基1.2kbcDNA片段。方法从HL-60细胞系中提取总RNA,以RT-PCR法扩增人整合素分子α4亚基片段1.2kbcDNA(1753～2934bp),并将该片段亚克隆至表达载体pGEX-3X,用IPTG诱导表达。结果克隆了α4亚基1.2kbcDNA片段。序列分析表明,其所编码的氨基酸序列与文献相比较只有一处错义突变(Arg→Gln),经分析该突变对抗原性影响不大。将该片段亚克隆至表达载体pGEX-3X,经IPTG诱导在大肠杆菌中获得高效表达。结论获得了α4亚基1.2kbcDNA片段及其原核表达产物,对研究α4整合素的功能具有重要的意义。     

小鼠蛋白激酶CK2β亚基的克隆、表达及活性测定

通过反转录PCR从NIH 3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶CK2β亚基编码区cDNA；构建其表达质粒并经测序证明其编码小鼠蛋白激酶CK2β亚基，但与两种已报道的小鼠CK2β亚基cDNA编码区序列分别存在一个碱基差异，与大鼠、猪、兔和人CK2β亚基cDNA的编码区相应碱基序列则一致。将其在表达菌BL21(DE3)中诱导表达，出现一26kDa分子量蛋白过度表达，表达蛋白占菌体总蛋白的31．7％，但大多数以不溶形式存在。Western blot鉴定表明：过度表达产物能与抗人CK2β亚基抗体发生特异性免疫反应。当CK2α和β亚基以1：1摩尔比混合时，构成性的CK2全酶显示出最大活性，直接表明CK2β亚基对CK2α有激活作用。这些结果有力地证明了克隆表达的重组蛋白是小鼠蛋白激酶CK2β亚基。     

雌激素受体α亚基基因小干扰RNA表达载体的构建

目的探讨构建雌激素受体α（ERα）亚基基因小干扰RNA（siRNA）表达载体的方法，为建立基因敲除ERα亚基突变株提供素材和依据。方法利用计算机辅助设计ERα特异性siRNA，体外合成siRNA基因，并将其定向克隆入pSilencer4．1-CMV质粒中，构建真核表达载体。采用PCR扩增、酶切分析鉴定。结果双酶切法鉴定重组质粒后，RT-PCR法鉴定ERasiRNA载体可特异地抑制人成骨样细胞株MG63细胞中ERα的表达。结论ERα亚基特异性siRNA表达载体被成功构建，为进一步研究雌激素受体在骨代谢中的作用机制提供了实验素材和依据。     

真核生物RNA聚合酶Ⅱ的研究进展

真核生物的基因表达是一个复杂的过程,参与转录的RNA聚合酶和一些因子起主要作用.在真核生物的3种RNA聚合酶中,又以RNA聚合酶Ⅱ的作用最大,它负责转录生成hnRNA和mRNA,对生物的多样性及生命的存在均有重要的意义.     

真核生物RNA聚合酶II的研究进展

真核生物的基因表达是一个复杂的过程,参与转录的RNA聚合酶和一些因子起主要作用。在真核生物的3种RNA聚合酶中,又以RNA聚合酶II的作用最大,它负责转录生成hnRNA和mRNA,对生物的多样性及生命的存在均有重要的意义。     

雌激素受体α亚基基因小干扰RNA表达载体的构建

目的 探讨构建雌激素受体α(ERα)亚基基因小干扰RNA(siRNA)表达载体的方法,为建立基因敲除ERα亚基突变株提供素材和依据.方法 利用计算机辅助设计ERα特异性siRNA,体外合成siRNA基因,并将其定向克隆入pSilencer 4.1-CMV质粒中,构建真核表达载体.采用PCR扩增、酶切分析鉴定.结果 双酶切法鉴定重组质粒后,RT-PCR法鉴定ERαsiRNA载体可特异地抑制人成骨样细胞株MG63细胞中ERα的表达.结论 ERα亚基特异性siRNA表达载体被成功构建,为进一步研究雌激素受体在骨代谢中的作用机制提供了实验素材和依据.     

负链RNA病毒——流感病毒基因表达载体的研究进展

随着流感病毒核糖核蛋白复合体转染系统的建立,负链RNA病毒用作基因表达载体的研究已取得重大突破,能诱导针对HIV的体液和细胞免疫反应的嵌合体流感病毒已构建成功并显示出用作疫苗的巨大潜力。     

人FcεRIα亚基的细胞外区的克隆表达和抗血清的制备及功能

为获得有生物活性的FcεRIα亚基细胞外区及多克隆抗体 ,并探知其功能 ,构建FcεRIα亚基的细胞外区的原核表达载体PBAD/gIIIA/FcεRIα,经表达、纯化后用斑点杂交法检测其活性。纯化制品免疫兔子获得抗血清 ,并研究抗血清对FcεRI的作用。结果发现 ,经原核表达出的FcεRIα亚基的细胞外区能与IgE结合 ;获得具有特异性抗FcεRI的抗血清 ,可能抑制嗜碱粒细胞脱颗粒。实验提示原核表达系统能产生有生物学活性的FcεRIα亚基的细胞外区 ,用其制备的抗血清能够识别FcεRIα亚基的细胞外区 ,可能抑制嗜碱粒细胞脱颗粒 ,为研究FcεRIα表达调节、对其的封闭作用及研究过敏性疾病的发病机制奠定物质基础     

聚合酶链反应法检测结核菌及小RNA病毒阳性对照物的选择

应用聚合酶链反应(ＰＣＲ)法对病原体进行检测时,往往需要病原体菌株或含有病原体的标本作为阳性对照物。过去我们曾使用结核菌株和开放性肺结核患者的痰液作为检测结核菌的阳性对照物;使用脊髓灰质炎病毒株作为检测小ＲＮＡ病毒的阳性对照物。这几种对照物存在着一些缺点,因此,经过探索,我们分别以卡介苗和脊髓灰质炎疫苗代替上述对照物,取得了较好的效果。一、方法将冻干卡介苗一支以1ｍｌ蒸馏水溶解,移至2ｍｌ的塑料离心管内,放入沸水中加热10ｍｉｎ灭活,可按1∶50～1∶100稀释,-18℃保存。扩增时向反应体系内加入3μｌ即可。同时提取并…     

大鼠Desert Hedgehog基因的克隆和表达

目的克隆大鼠Desert Hedgehog（DHH）基因,构建其真核表达载体并转染TP67细胞;同时制备DHHcRNA正义及反义探针用于检测其在细胞中的表达。方法提取SD大鼠睾丸总RNA,RT-PCR法扩增DHHcDNA片段,连接于pGEM—TEasy载体,经测序后构建真核表达载体pLXSN／DHH并转染PT67细胞;重组质粒经限制性内切酶NotⅠ和NcoⅠ酶切、回收后,进行转录标记反应,原位杂交检测DHH在嘶7细胞中的表达。结果RT-PCR扩增得到1220bp的片段;成功构建了真核表达载体pLXSN／DHH;制备DHH正义及反义探针浓度分别为150mg／L和80mg／L;DHH在PT67细胞中有表达。结论克隆的DHH基因与大鼠Sertoli细胞的DHH基因相同,成功标记了特异、敏感的DHHcRNA探针,转染的DHH基因能够在PT67细胞中表达。     

依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅲ与基因表达和基因治疗

依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅲ (polⅢ )能催化 5SrRNA、tRNA、U6SnRNA等一些小的、稳定的RNA的合成。文章综述了依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅲ的启动子和转录复合物 ,并介绍了RNA聚合酶Ⅲ的转录在基因表达和基因治疗 (核酶、反义核酸、RNA干扰技术等 )研究中的应用价值。