细胞周期素依赖激酶摄抑制剂P27^Kip1在兔晶状体上皮细胞增殖过程中的作用

Ｐ2 7Ｋｉｐ1是Ｐｏｌｙａｋ等[1] 于 1994年发现的一种相对分子质量为 2 70 0 0的重要细胞周期素依赖激酶抑制剂 ,其通过抑制细胞周期素依赖激酶的活性 ,可阻止细胞周期进程 ,抑制细胞增殖。目前尚未见有关Ｐ2 7Ｋｉｐ1在晶状体上皮细胞中的表达和在晶状体上皮细胞增殖过程中作用的研究报道。我们以增殖细胞核抗原 (ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ ,ＰＣＮＡ)作为细胞增殖指标 ,采用免疫组化链霉亲合素生物素复合物(ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｂｉｏｔｉｎｃｏｍｐｌｅｘ,ＳＡＢＣ)法对家兔晶状体皮质吸除…     

人晶状体上皮细胞HGF与c-Met的表达对增殖和凋亡的影响

目的：探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在人晶状体上皮细胞(lens epithelial cell,LEC)的表达及其对晶状体上皮细胞的促增殖和抑制凋亡的作用。方法：取原代培养人晶状体上皮细胞,应用RT-PCR,Western blot检测HGF,C-Met的mRNA及蛋白的表达,应用MTT法检测HGF对晶状体上皮细胞增殖的影响,Western-blot检测：Bcl-2的蛋白表达,以揭示其对晶状体上皮细胞凋亡的影响。结果：HGF和c-Met在人晶状体上皮细胞有表达,HGF有促进晶状体上皮细胞增殖的作用,并能抑制凋亡产生。结论：HGF参与人晶状体上皮细胞的增殖代谢过程,与晶状体上皮细胞的增殖相关。     

三氟拉嗪对体外培养人晶状体上皮细胞增殖作用的实验研究

目的研究三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP)对体外培养的人晶状体上皮细胞增殖作用的影响,为三氟拉嗪防治晶状体后囊混浊提供理论依据。方法不同浓度(2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml)的TFP作用于传代培养的晶状体上皮细胞,于作用244、8、729、6 h后,用MTT比色法测定其抑制率;用流式细胞仪分析检测TFP诱导人晶状体上皮细胞的细胞周期的阻断。结果TFP对人晶状体上皮细胞的抑制呈明显的时间剂量依赖性,细胞周期分布显示TFP使细胞阻滞在G0/G1期。结论三氟拉嗪可抑制晶状体上皮细胞的生长增殖,其抑制后囊混浊的可能作用值得进一步研究。     

电场暴露抑制晶状体上皮细胞的增殖

目的 观察外源性电场对晶状体上皮细胞增殖行为的影响并研究其作用机制。方法将培养的晶状体上皮细胞暴露于场强为200mV／mm的直流电场48h，未受电场暴露的细胞作为对照。以细胞的密度、生长率和分裂指数评价其增殖能力，并通过流式细胞仪进行细胞周期分析和蛋白印记分析检测细胞周期调节蛋白的表达。结果细胞的增殖在电场中受到明显抑制，表现为细胞密度、生长率及分裂指数明显下降。电场暴露抑制细胞周期由G1期向S期的过渡，导致G1期阻滞。电场暴露细胞的cyclin—E表达明显降低，但Cdk2的表达不受影响，而cyclin—E／Cdk2复合物的抑制蛋白p27^kipl的表达明显增加。结论电场抑制晶状体上皮细胞的增殖，阻止细胞周期Gl／s期的过渡使细胞周期休止于G1期，这一作用是藉增加p27^kipl的表达和减少cyclin—E的表达而实现。     

bFGF和顺铂、米托蒽醌及阿糖胞苷对兔晶状体上皮细胞的相互作用

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)和顺铂（PDD）、米托蒽醌（Mit)及阿糖胞苷（Ara-C)对兔晶状体上皮细胞（RLECs)的相互作用。方法 分离兔晶状体囊膜行组织细胞培养,传代的2-3代RLECs在96孔板培养24h,然后分别用不同浓度的bFGF,PDD,Mit和Ara-c;以及bFGF合用PDD,Mit及Ara-C作用24h及72h,用（MTT）比色法测定对RLECs的影响。结果 bFGF可明显促进晶状体上皮细胞的增殖,而PDD和Mit明显抑制晶状体上皮细胞的增殖,在bFGF存在的情况下此两种药物仍能抑制晶状体上皮细胞的增殖,在本实验条件下Ara-C单用对兔晶状体上皮细胞无明显影响。而在bFGF存在时则表现出抑制作用。结论 bFGF是促进兔晶状体上皮细胞增殖的重要因子。并不能阻止抑制兔晶状体上皮细胞增殖药物对其的抑制作用。而对z细胞周期特异性药物的作用有增强效果。     

曲尼司特对培养兔晶状体上皮细胞的作用

目的 观察曲尼司特(Tranilast)对培养兔晶状体上皮细胞增殖的作用及其对细胞周期的影响。方法 将传代的兔晶状体上皮细胞用含不同曲尼司特浓度的培养液培养，每天计数，绘制细胞生长曲线，收集细胞做流式细胞仪检查。空白培养液培养的细胞做阴性对照，含0．004％丝裂霉素C(MMC)培养液培养的细胞为阳性对照。结果 用180μmol／L的培养液培养细胞时细胞增殖明显受到抑制，随药物浓度增加，细胞增殖受抑制越明显，细胞生长曲线越低平，细胞形态变化不大。经流式细胞术进行细胞周期分析，随药物浓度增加G0／G1期细胞数增多(67．47％～79％)，而S期细胞数减少(21．19％～4．32％)。阳性对照组细胞于48h全部死亡。结论 曲尼司特具有抑制晶状体上皮细胞增殖的效果，且呈浓度依赖性。曲尼司特将细胞抑制在G1期的限制点内。     

bFGF诱导人晶状体上皮细胞增殖过程中细胞外信号调节激酶的作用

目的:检测细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase,ERK)在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导的人晶状体上皮细胞增殖过程中的表达与活化;检测ERK1/2特异性阻断剂PD98059对人晶状体上皮细胞增殖的影响。方法:人晶状体上皮细胞系SRA01/04体外培养,采用MTT比色法和[3H]-TdR掺入法检测ERK阻断剂PD98059对人晶状体上皮细胞活力和DNA合成的影响;Westernblot法测定bFGF对培养的人晶状体上皮细胞ERK,c-Jun氨基末端激酶(JNK),P38蛋白表达及PD98059对环氧合酶-2(COX-2)表达的影响。结果:10μg/LbFGF能显著刺激人晶状体上皮细胞增生,1μmol/LPD98059即能显著抑制bFGF启动的HLEC增殖,其效应呈浓度依赖性(P<0.01)。10μg/LbFGF可激活ERK信号通路,诱导COX-2蛋白表达,其效应在30min内达到高峰,6h后逐渐减弱,此作用可被10μmol/LPD98059阻断;10μg/LbFGF对非磷酸化ERK,磷酸化和非磷酸化JNK及P38表达无明显影响。结论:有丝分裂原活性蛋白激酶信号传导通路中ERK磷酸化对bFGF启动的人晶状体上皮细胞增殖具有重要的调节作用。     

γ-干扰素对肿瘤坏死因子α促进牛晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的　观察γ-干扰素 (γ- interferon,γ- IFN )对肿瘤坏死因子α(tum or necrosisfactorα,TNF-α)所引起体外培养的牛晶状体上皮细胞增殖的抑制作用。方法　牛晶状体上皮细胞原代与传代培养。第 3代培养细胞中添加 TNF-α,浓度为 10 - 2 ～ 10 4μg· L- 1 ,通过甲基噻唑基四唑 (methyl thiazolyl tetrazolium ,MTT)测定法 ,观察 TNF-α对牛晶状体上皮细胞的影响 ,进一步测定γ- IFN对 TNF-α增殖影响的抑制作用。结果　 TNF-α在体外有促进牛晶状体上皮细胞增殖作用并与 TNF-α有关 ,10～ 10× 10 3μg· L- 1 OD值明显升高 ,并以 10 3μg· L- 1 最为明显 ,而γ- IFN可以抑制这一作用。结论　 TNF-α是促进晶状体上皮细胞增殖、参与后囊形成混浊的一个重要的细胞因子。γ- IFN可抑制 TNF-α促牛晶状体上皮细胞增殖作用 ,因而能抑制后发性白内障的形成     

雷帕霉素对兔晶状体上皮细胞增殖的影响

目的研究雷帕霉素（rapamycin）对培养的兔晶状体上皮细胞增殖的作用及其对细胞周期的影响。方法将传代的兔晶状体上皮细胞用含不同雷帕霉素浓度的培养液培养24h后，用NIT法测定5ng／ml、10ng／ml、20ng／ml、40ng/ml、80ng/ml雷帕霉素浓度组及对照组细胞的增殖情况；用流式细胞仪测定20ng/ml雷帕霉素浓度组及对照组细胞周期的变化情况。结果用5ng/ml的培养液培养细胞时，细胞增殖受到抑制（P〈0．05），随药物浓度增加，细胞增殖受抑制越明显；用10ng/ml的培养液培养细胞时，细胞增殖明显受到抑制（P〈0．01）。细胞周期分析显示，雷帕霉素（20ng/ml）作用后，G0／G1期细胞较对照组增多（由51．72％增加到61．63％），S期细胞较对照组减少（由34．92％减少至10．85％）。结论雷帕霉素具有抑制兔晶状体上皮细胞增殖的作用，且随浓度增加抑制作用增强。雷帕霉素将细胞抑制在G1期的限制点内。     

抗Ⅳ型胶原抗体-金雀异黄素偶联物体外抑制晶状体上皮细胞增殖

目的:研究抗Ⅳ型胶原抗体-金雀异黄素偶联物对人晶状体上皮细胞抗增殖作用.方法:免疫组织化学法检测偶联物与人晶状体囊膜结合的特异性;倒置显微镜细胞形态学观察;丫啶橙染色荧光显微镜观察偶联物作用下细胞形态的变化;MTT法检测偶联物抑制晶状体上皮细胞增殖的作用.结果:偶联物既保持了抗体的免疫活性,又能高效的抑制体外晶状体上皮细胞增殖.结论:通过活性酯法制备的抗Ⅳ型胶原抗体-金雀异黄素偶联物体外具有高效的抑制晶状体上皮细胞增殖的作用.     

Genistein对兔晶状体上皮细胞增殖的影响

目的　探讨染料木黄酮 (genistein)对体外培养的兔晶状体上皮细胞增殖的影响。方法　用不同浓度的 genisteinDMSO溶液处理常规培养的第 3代兔晶状体上皮细胞 ,采用细胞计数法以及MTT法检测对晶状体上皮细胞增殖的影响。结果　 12 .5mg·L-1genistein对晶状体上皮细胞增殖无显著影响 ,genistein在 2 5mg·L-1可显著抑制体外培养的兔晶状体上皮细胞的增殖 ,抑制率为 32 .86 % ,5 0mg·L-1genistein抑制率为 4 9.2 4 % ,10 0mg·L-1genistein抑制作用最强 ,抑制率达 70 .72 % ,且genistein在 2 5～ 10 0mg·L-1其抑制作用呈剂量依赖性。结论　genistein在浓度≥ 2 5mg·L-1时可显著抑制体外培养的兔晶状体上皮细胞的增殖 ,且呈剂量依赖性。提示genistein可能在临床防治后发性白内障中有所帮助。     

碱性成纤维细胞生长因子对兔晶状体上皮细胞增殖的影响

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor ,bFGF)对兔晶状体上皮细胞（rabbit lens epithelia cell,RlECs)的作用。方法：采用bFGF作用于第2－3代培养细胞,用MTT法测定细胞对增殖的影响;电观察细胞形态的变化,流式细胞仪观察细胞周期的变化。结果：bFGF可促进晶状体上皮细胞的增殖,尤其是浓度为10μg.L^-1作用最明显,透射电镜显示细胞增殖活跃,流式细胞仪观察进入S期的细胞明显增加。结论：bFGF是促进培养兔晶状体上皮细胞增殖的重要因素。     

MTT法检测紫杉醇对兔晶状体上皮细胞增殖的影响

目的　研究紫杉醇 (Taxol)对体外培养的兔晶状体上皮细胞生长的影响。方法　取 2～ 3代对数生长期的兔晶状体上皮细胞 ,于 96孔板中培养 2 4 h后 ,用不同浓度的紫杉醇分别作用 2 4及 72 h,MTT比色测定法观察紫杉醇对兔晶状体上皮细胞增殖的影响。结果　我们发现 ,浓度为 0 .312 5 m g· L- 1的紫杉醇作用于培养的兔晶状体上皮细胞 2 4 h对其生长无明显的抑制 ,而作用 72 h则能抑制其生长。 2 4 h的半效抑制量 (ID50 )为 14 .6 81mg· L- 1 ,72 h的 ID50 为 4 .0 0 7mg· L- 1 ,紫杉醇还能抑制细胞贴壁。结论　紫杉醇对传代培养的兔晶状体上皮细胞增殖有明显的抑制作用 ,紫杉醇对预防后囊膜混浊的发生可能有一定作用     

bFGF反义寡核苷酸抑制大鼠实验性晶状体损伤后晶状体上皮细胞的增殖和迁移

目的：探讨bFGF的反义寡苷酸对大鼠实验性、外伤性白内障中晶状体上皮细胞增殖和迁移的作用。方法：用注射器经角膜将大鼠双眼晶状体的前囊膜刺破并刺入皮质中，造成外伤性白内障。然后将12只动物分为3组，前房分别注射生理盐水、0．1％反义寡核苷酸和0．1％正义寡核苷酸，在第3、7、10和14天取出眼球，用10％甲醛溶液固定，行病理切片、HE染色，在显微镜下观察晶状体上皮细胞的增殖、迁移有赤道部细胞和细胞空泡。结果：晶状体的组织学显示，反义寡核苷酸在第3、7天和10天在抑制晶状体上皮细胞增殖及迁移方面的作用在强于生理盐水及正义寡核苷酸。在赤道部细胞活跃方面；生理盐水对照组存在3天，正义寡核酸存在2天，而反义寡核苷酸没有。在细胞空泡:生理盐水对照组有2天存在，而正义寡核苷酸和反义寡核苷酸组则不存在。统计学分析显示，反义寡核苷酸组在抑制晶状体上皮细胞增殖方面的作用显著强于生理盐水组（P＝0．0104）和正义寡核苷酸组（P＝0．0499），在抑制日晶状体上皮细胞向后囊迁移方面显著强于生理盐水组（P＝0．0011），而与正义寡核苷酸组间差异无显著性意义（P＝0．830）。在赤道部细胞活跃（P=0．4317)呼细胞空泡方面（P＝0．6188），三组间差异无显著性意义。结论：碱属成纤维生长因子的反义寡核苷酸对抑制外伤性白内障的晶状体上皮细胞的增殖与迁移有一定的作用。     

r-tPA对兔眼晶状体上皮细胞影响的实验研究

目的　研究体外细胞培养中基因重组的组织纤维蛋白溶解酶原激活物(recombination tissue plasminigen activator,r- t PA)对兔晶状体上皮细胞增殖的抑制作用及有效浓度 ,为晶状体后囊混浊的药物预防提供新线索。方法　首先进行兔晶状体上皮细胞的原代与传代培养。传代培养的兔晶状体上皮细胞分为 6个实验组 ,分别加入 2 mg· L- 1 、4mg·L- 1 、8mg· L- 1 、16 mg· L- 1 、32 m g· L- 1 的 r- t PA,设空白对照组 ,在加药后不同时间进行细胞计数 ,3H- TDR掺入实验 ,研究 r- t PA对晶状体上皮细胞增殖的影响。结果　 r- t PA对体外培养的兔晶状体上皮细胞的增殖有显著抑制作用 ,呈浓度依赖性改变。 4mg· L- 1 r- t PA已有显著抑制作用 ,16 mg· L- 1基本发挥最大作用。结论　 r- t PA能有效抑制体外培养晶状体上皮细胞的增殖 ,通过进一步在体研究 ,可能成为预防后囊膜混浊的理想药物     

成纤维细胞生长因子与后发性白内障的关系

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(base fibfroblast growth factor,bFGF）对白内障术晶状体上皮细胞增生过程中的影响。方法 在培养的牛晶状体上皮中添加bFGF，甲基噻唑基四唑（methyl thiazoly tetrazolium,MTT）法测定细胞增生情况以及流式细胞仪分析细胞周期。结果 bFGF浓度为10^-1－10^-2ng/ml对牛眼晶状体上皮细胞增生有促进作用，且以10ng/ml浓度作用最佳。结论 bFGF与其受体结合后可促进晶状体上皮细胞增生，与白内障术后后囊浑浊中起重要作用。     

儿茶素通过ERK抑制兔晶状体上皮细胞增殖

目的探讨绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抑制兔晶状体上皮细胞增殖时,细胞外信号调节激酶(ERK)信号转导通路所起的作用。方法用组织块培养法获取新西兰白兔晶状体上皮细胞,用噻唑蓝比色法(MTT)研究晶状体上皮细胞增殖作用;用Westernblot法研究ERK的磷酸化和非磷酸化水平。结果预先分别加入25、50μmol/L的ERK特异性抑制剂PD980059孵育1h后,50、100、200μmol/LEGCG对晶状体上皮细胞的抑制率明显大于对照组(P<0.05)。在晶状体上皮细胞,磷酸化的ERK基础水平很高;200μmol/LEGCG组ERK的磷酸化水平最高,随EGCG浓度降低其水平下降;加入EGCG后早期,ERK的磷酸化水平最高,随时间的延长仍保持高水平。各组的非磷酸化ERK水平始终保持不变。结论EGCG可能通过调控ERK的磷酸化水平而抑制晶状体上皮细胞的增殖,并不影响总蛋白浓度。     

TGF-β1对胎儿晶状体上皮细胞增殖的作用

目的 探讨转化生长因子－β1（transforming growth factor-β1,TGF－β1)对胎儿晶状体上皮细胞增殖的作用。方法 用SP免疫对48例人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞进行细胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA),TGF－β1免疫组织化学染色。结果 PCNA，TGF－β1在人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞均表达；免疫阳笥细胞随着胎龄的增加而减少。PCNA阳性细胞核为桔黄色或棕黄色；TGF－β1阳性细胞浆为桔黄色或棕黄色的颗粒状或斑块状；经相关分析：TGF－β1与PCNA呈正相关。结论 PCNA，TGF－β1在人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞均有表达；TGF－β1与PCNA呈正相关，具有促进晶状体上皮细胞增殖的作用。     

细胞周期依赖性激酶抑制剂P27,P21在人角膜上皮的表达研究

目的:探讨细胞周期依赖性激酶抑制剂(CKI)P27,P21 在角膜上皮细胞的表达情况。方法:应用 SP 免疫组化法,检测 P21,P27 等细胞周期依赖性激酶抑制剂和增殖细胞核抗原(PCNA)在角膜上皮不同部位的表达情况。结果:角膜缘上皮区 PCNA 呈阳性表达,主要位于基底细胞层,中央区角膜上皮内未见阳性表达,差异有显著意义(P <0.01);P27,P21 在中央区角膜上皮内呈阳性表达,角膜缘上皮内未见阳性表达,差异均有显著意义(P <0.01)。结论:细胞周期依赖性激酶抑制剂 P27,P21 和 PCNA 在角膜上皮不同部位的表达差异,提示在角膜缘上皮基底层内存在着一群有较高的增殖能力,处于 G1 期的细胞群,即干细胞。     

EGCG抗兔晶状体上皮细胞增殖机制中p38激酶作用的研究

目的:研究p38激酶在绿茶提取物中的表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-Epigallocatechin-3-gallate,EGCG]抗晶状体上皮细胞增殖机制中的作用。 方法:用噻唑蓝比色法(MTT比色法)研究p38的特异性抑制剂SB203580对EGCG抑制晶状体上皮细胞增殖作用的影响;用Western Blot法研究EGCG对p38激酶的磷酸化和非磷酸化水平的影响。 结果:(1)预先加入25μmol/L,50μmol/L的SB203580孵育1h后,100μmol/L EGCG对晶状体上皮细胞增殖的抑制率低于对照组,但这种差别没有统计学上的意义(P>0.05);200μmol/L EGCG组对晶状体上皮细胞的抑制率低于对照组,有统计学的意义(P<0.05);(2)在晶状体上皮细胞,磷酸化的p38基础水平很低。p38的磷酸化水平随EGCG浓度的增加逐渐增加,而非磷酸化的p38的水平与基础水平一样保持不变。以200μmol/L EGCG作用15min来研究其对p38的磷酸化和非磷酸化影响的时-效规律发现,加药后初期,p38的磷酸化水平很高,随后逐渐下降。同时,非磷酸化p38的水平保持不变。 结论:(1)EGCG对晶状体上皮细胞的增殖抑制作用可能通过p38通路;(2)EGCG对p38影响主要在于调节蛋白激酶的磷酸化与去磷酸化水平,不影响总蛋白含量。眼科学报 2003;19:236-238。