反相离子对高效液相色谱法测定血浆吗啡及其代谢物M3G的含量

目的:建立反相离子对高效液相色谱法测定血浆吗啡及其代谢物3-葡萄糖醛酸吗啡(M3G)的浓度。方法:血浆样品以乙酸乙酯提取,以纳洛酮为内标。应用HPLC-UV方法测定吗啡浓度,分析柱DiamonsilTMC18(250mm×4.6mm),流动相为0.01mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液(含0.5mmol·L-1的十二烷基磺酸钠)-乙腈(71:29),检测波长210nm,流速0.65ml·min1。血浆样品经β-葡萄糖醛酸苷酶水解测定其代谢物含量。结果:吗啡标准曲线线性范围宽(10-4000μg·L-1),线性关系良好;最低检测限10μg·L-1;高、中、低浓度的回收率在85·3%以上。血浆M3G在250-8250μg·L-1浓度范围内与水解增加吗啡浓度呈线性关系。结论:本法简单,快速,血浆中杂质不干扰样品的测定,满足生物样品分析要求。     

大鼠肝细胞色素P4503A活性测定及其孵育条件的优化

目的:测定大鼠肝微粒体中细胞色素P4503A(CYP3A)的活性,并对其体外孵育条件进行优化。方法:采用1’-羟基咪哒唑仑的生成量表示肝中CYP3A的活性,高效液相色谱法测定肝微粒体中1’-羟基咪哒唑仑的浓度,用单因素试验法对其体外孵育条件进行优化,用线性Lineweaver-Burk双倒数作图法研究肝CYP3A酶促动力学。结果:1’-羟基咪哒唑仑在18.20~1 820.00μg.L-1范围内线性关系良好;体外优化的孵育条件为5μmol.L-1咪哒唑仑、0.102mg肝微粒体、孵育15min;肝CYP3A酶促动力学参数Km为1.67μmol.L-1,Vmax为95.15pmol.min-1.mg-1。结论:HPLC法操作简便、灵敏、快速,适用于肝微粒体中1’-羟基咪哒唑仑的浓度测定,肝CYP3A孵育条件及其酶促动力学研究为研究经CYP3A代谢的药物相互作用及其他物质对CYP3A酶的影响提供理论依据。     

雷公藤多苷对大鼠与人肝微粒体CYP3A酶活性的体外抑制作用

目的:建立液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定大鼠和人肝微粒体中1′-羟基咪达唑仑的含量,研究雷公藤多苷对体外大鼠与人肝微粒体细胞色素P45(0CYP)3A酶活性的抑制作用。方法:将不同质量浓度的雷公藤多苷(0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/ml)分别与大鼠和人肝微粒体(0.4 mg/ml)共同孵育20 min后终止反应,采用LC-MS/MS法测定孵育液中咪达唑仑的代谢产物1′-羟基咪达唑仑的浓度以评价CYP3A酶活性并计算酶活性抑制率,采用Graph Pad Prism 5.0软件进行拟合并计算半数抑制浓度(IC50)。色谱柱为Agilent Eclipse XBD-C18,流动相为水-甲醇(梯度洗脱),流速为0.3 ml/min,柱温为30℃,进样量为2μl。采用电喷雾电离(ESI),定量离子为m/z 342.01→324.1(1′-羟基咪达唑仑)、m/z 383.01→337.2(内标氯雷他定)。结果:1′-羟基咪达唑仑检测浓度在0.01~3μmol/L范围内与其和内标物峰面积比值呈良好线性关系;精密度试验RSD均小于10%,提取回收率为97.92%~101.65%,方法回收率为96.70%~104.10%,稳定性试验RSD均小于10%。雷公藤多苷对大鼠和人微粒体中CYP3A的IC50分别为(48.610±1.32)μg/ml和(4.754±1.12)μg/ml;在0.5~100.0μg/ml范围内雷公藤多苷对CYP3A酶活性有抑制作用,且与质量浓度呈正相关。结论:所建立的LC-MS/MS法可用于检测大鼠和人肝微粒体中1′-羟基咪达唑仑的含量。雷公藤多苷对体外大鼠和人肝微粒体药物代谢酶CYP3A均存在抑制作用,且对人肝微粒体CYP3A的抑制作用明显强于大鼠。     

水飞蓟宾非对映异构体在大鼠肝微粒体中葡萄糖醛酸化代谢的酶动力学比较研究

目的比较水飞蓟宾A(silybin A,sa)和水飞蓟宾B(silybin B,sb)在大鼠肝微粒体中葡萄糖醛酸化代谢的酶动力学特性。方法将系列浓度的水飞蓟宾(sa和sb的质量比为45∶53)加入到大鼠肝微粒体孵育液中进行孵育,采用HPLC法分别测定β-葡萄糖苷酸酶水解前和水解后孵育液中sa和sb的浓度,据此计算sa和sb的葡萄糖醛酸结合物的浓度,绘制酶动力学曲线,并计算酶动力学参数。结果 sa和sb的最大反应速率(vmax)分别为(2.80±0.14)mmol·min~(-1)·kg~(-1)和(4.21±0.31)mmol·min~(-1)·kg~(-1),米氏常数(Km)分别为(36.66±7.52)μmol·L-1和(89.78±23.08)μmol·L-1,内在清除率(Clint)分别为76.38 L·min~(-1)·kg~(-1)和46.89 L·min~(-1)·kg~(-1)。结论水飞蓟宾在大鼠肝微粒体中的葡萄糖醛酸化代谢具有立体选择性,sb的代谢速率快于sa。     

高效液相色谱法测定肿节风药材中异秦皮啶与山柰酚-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量

目的建立肿节风药材中山柰酚-3O-葡萄糖醛酸苷与异秦皮啶的含量测定方法。方法色谱柱为Kromasil ODS-1（4．6mm×250mm,5μm）,流动相为乙腈-0．1％磷酸水溶液,梯度洗脱,流速为1．0mL·min^-1,检测波长为344nm,柱温为25℃。结果山柰酚-3-O-葡萄糖醛酸苷在0．2006～4．012μg线性关系良好,相关系数r=0．9999．平均回收率为100．1％,RSD=1．8％;异秦皮啶在0．4352～8．704μg线性关系良好,相关系数r=0．9999．平均回收率为99．8％,RSD=1．5％。结论所用方法简便、准确,重复性好,在同一高效液相色谱条件下可同时测定山柰酚-3-O-葡萄糖醛酸苷和异秦皮啶的含量,提供了更好的控制肿节风药材质量的方法。     

肌肉素对胰岛素诱导大鼠分化的成肌细胞摄取葡萄糖过程中PI3K和AKT的干预作用

目的:研究肌肉素(musclin)对胰岛素诱导大鼠分化的成肌细胞摄取葡萄糖过程中PI3K和AKT的干预作用。方法:大鼠P3成肌细胞诱导分化后,分成不含胰岛素时的对照组(A组,25 mmol.L-1D-葡萄糖)和肌肉素处理组(B组,25 mmo.lL-1D-葡萄糖 肌肉素0.5μg.mL-1),以及含有胰岛素时的对照组(C组,25 mmol.L-1D-葡萄糖 10 mU.mL-1胰岛素)和肌肉素处理组(D组,25 mmol.L-1D-葡萄糖 10 mU.mL-1胰岛素 肌肉素0.5μg.mL-1);B和D组在加入肌肉素后继续孵育5 h,C和D组在此基础上加入胰岛素再继续孵育30 min。用3氚标记-葡萄糖(3H-G)检测葡萄糖的摄取,半定量RT-PCR检测葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT/PKB)mRNA的表达。结果:与A组比较,B组成肌细胞对葡萄糖的摄取量、PI3K mRNA及AKTmRNA的表达水平均降低约50%(P<0.01);与C组比较,D组成肌细胞对葡萄糖的摄取量、PI3K mRNA及AKTmRNA的表达水平均降低约50%(P<0.01);与B组比较,D组成肌细胞对葡萄糖的摄取量、PI3K mRNA及AKTmRNA的表达水平均上升约30%(P<0.05);但4组GLUT4 mRNA的表达水平均无统计学改变。结论:肌肉素可抑制大鼠P3成肌细胞对葡萄糖的摄取,作用机制可能与其抑制PI3K/AKT信号转导通路有关。     

高效液相色谱法测定木鳖子中3-O-6''''-O-甲基-β-D-葡萄糖醛酸丝石竹苷的含量

目的:运用高效液相色谱法测定木鳖子中3-0-6'-0-甲基-β-D葡萄糖醛酸丝石竹苷的含量。方法:ECONO-SPHERE C_(18)色谱柱,以甲醇-水(80:20)为流动相,流速0.8mL·min~(-1),检测波长210nm。结果:3-0-6'-0-甲基-β-D-葡萄糖醛酸丝石竹苷线性范围0.612～3.672μg,r=0.999 9;平均加样回收率98.8％;RSD=0.36％(n=5)。结论:该法灵敏、准确,可作为衡量木鳖子质量的依据。     

山姜素在人肝微粒体的葡萄糖醛酸化反应研究

目的研究体外肝微粒体孵育体系中山姜素的葡萄糖醛酸化代谢情况,鉴定参与山姜素葡萄糖醛酸化代谢的UGT亚型。方法用体外肝微粒体孵育体系,用HPLC-UV检测方法,检测山姜素的葡萄糖醛酸化代谢情况。将代谢产物进行纯化后,用质谱(MS)和核磁共振(NMR)法进一步鉴定其结构。用商业化重组表达的UGT单酶,鉴定代谢产物的结构和归属可能参与山姜素葡萄糖醛酸化代谢反应的葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)亚型。结果山姜素葡萄糖醛酸代谢产生一个代谢产物,经结构鉴定为山姜素-氧-单葡萄糖醛酸化产物。人肝微粒体代谢山姜素的动力学行为,符合米方程且动力学参数:Vmax=(101.9±3.0)nmol·min-1·mg-1·pro,Km=(40.6±3.6)μmol·L-1。UGT1A1、UGT1A3、UGT1A9和UGT2B15均参与了山姜素的葡萄糖醛酸化反应。结论山姜素在人肝微粒体孵育体系中会被代谢成为一个单葡萄糖醛酸化产物,且归属了参与的UGT酶。     

HPLC法测定大鼠UGT1A6的酶活性及体外动力学分析

目的:建立灵敏、稳定的高效液相色谱法,以对硝基酚为探针底物,评价体外大鼠肝微粒体中UGT1A6酶活性。方法:色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为20 mmol.L-1磷酸二氢钾缓冲液-甲醇(50∶50,V/V),流速0.8 mL.min-1,柱温30℃,检测波长280 nm。对硝基酚与大鼠肝微粒体在37℃共同孵育一段时间后,加入冰乙腈终止反应,于4℃下12000 r.min-1离心15 min后,吸取上清进行HPLC分析,以双倒数作图法计算酶动力学参数。结果:对硝基酚保留时间为8.95 min,线性范围为0.5～100μmol.L-1,回归方程为Y=5973.12X+571.58(r=0.9999),最低检测限(LOD)为0.1μmol.L-1(S/N≥3),最低定量限(LLOQ)为0.5μmol.L-1,回收率为104.5%～105.5%,日内、日间RSD均小于10%,温孵体系中其他内源性物质不干扰测定;计算酶动力学参数Km为24.63μmol.L-1,Vmax为18.87 nmol.min-1.mg.protein-1。结论:该方法灵敏度高、稳定性好,适合体外对硝基酚的测定,可用于大鼠体外UGT1A6酶活性的评价及酶动力学研究。     

液相色谱-串联质谱法测定人血浆中染料木素及其葡萄糖醛酸代谢物

目的建立液相色谱-串联质谱联用法测定人血浆中染料木素(雌激素类药物)及其葡萄糖醛酸代谢物(GGS)并研究其在健康人体中的药代动力学。方法10例健康受试者空腹口服染料木素50 mg,血浆加入内标物地塞米松后,经液-液萃取,色谱柱为Capcell Pak C8(2 mm×150 mm,5μm),流动相为:甲醇-5 mmol.L-1乙酸铵-乙腈(70∶20∶10),以ESI源正离子MRM模式测定染料木素的血药浓度,GGS先酶解为原形后间接测定,用DAS 2.0程序计算药代动力学参数。结果线性范围为0.3~500.0μg.L-1(γ=0.9983),回收率在92.9%~104.9%,绝对回收率在74.2%~89.2%,日内、日间变异(RSD)均<15%。染料木素和GGS的主要药代动力学参数:tmax分别为(5.0±1.3),(6.0±2.4)h,Cmax分别为(10.1±6.3),(218.7±68.6)μg.L-1,AUC0-t分别为(31.2±10.3),(3344.0±1635.0)μg.h.L-1,AUC0-∞分别为(33.9±11.4),(3703.0±2031.0)μg.h.L-1。结论测定方法灵敏、准确...     

液相色谱-串联质谱法测定人血浆中阿普唑仑及其代谢物的浓度

目的 建立同时测定人血浆中阿普唑仑(抗焦虑药)及其代谢物α-羟基阿普唑仑、4-羟基阿普唑仑浓度的液相色谱一串联质谱方法.方法 用Asi-lent Zorbax SB C_(18)(2.1 mm×30 mm,3.5μm)色谱柱,流动相为25 mmol·L~(-1)甲酸-乙腈(58:42),流量为0.2 mL·min~-,柱温40℃,进样量50μL,正离子电离、多离子反应监测进行定量分析.结果 阿普唑仑和2个代谢物线性范围分别为0.5～50.0 ng·mL~-(γ=0.9960),0.05～2.00 ng·mL~(-1)(γ=0.9961,0.9922).3者的提取回收率为75.0%～87.3%(RSD<10%).结论 本方法灵敏、准确、快速,可用于临床上阿普唑仑及其代谢产物血药浓度监测和药代动力学研究.     

高效液相色谱-串联质谱法同时测定奈韦拉平、拉米夫定、司他夫定、齐多夫定和依非韦伦的血药浓度

目的建立高效液相色谱串联质谱技术(HPLC-MS/MS)同时检测奈韦拉平、拉米夫定、司他夫定、齐多夫定和依非韦伦(均为抗艾滋病药)的血药浓度方法。方法用蛋白沉淀法提取,色谱柱为EclipseXDB-C18(4.6mm×150mm,5μm),流动相为(甲醇+0.3%甲酸)-(水+0.3%甲酸)=80∶20,流量为0.5mL·min-1,用质谱多反应监测方法(MRM)检测。结果齐多夫定与拉米夫定的线性范围为25～3200μg.L-1,奈韦拉定与依非韦伦的线性范围为50～6400μg.L-1,最低检测限均为1μg.L-1;司他夫定的线性范围为100～3200μg.L-1,最低检测限为5μg.L-1,γ均大于0.99。高、中、低3个浓度的日内精密度小于10%,日间精密度小于15%,绝对回收率均大于50%。结论用HPLC-MS/MS法能同时快速、准确测定血浆中这5种药物。     

离子色谱法测定氨甲环酸注射液中依地酸二钠的含量

目的:建立氨甲环酸注射液中依地酸二钠的含量测定方法。方法:采用离子色谱法测定。使用Ionpac AS14A阴离子分离柱,Ionpac AG14A保护柱,淋洗液为含5 mmol.L-1碳酸钠、1 mmol.L-1碳酸氢钠的混合溶液,流速为1.0 mL.min-1,ASRS-ULTRA 4 mm自动抑制循环模式,抑制电流为50 mA,电导检测池温度为35℃,进样量为25μL。由依地酸二钠标准工作曲线直接测得氨甲环酸注射液中依地酸二钠含量。结果:依地酸二钠浓度在5.226～209.0μg.mL-1范围内呈良好的线性关系(r=0.9981);平均回收率(n=3)为97.4%～100.1%。结论:本方法简单、快速,可以用于氨甲环酸注射液中依地酸二钠含量的测定。     

芍药苷对MPP~+所致大鼠黑质脑片多巴胺能神经元损伤的保护作用

目的研究芍药苷(paeoniflorin,PF)对MPP+所致大鼠黑质脑片多巴胺能神经元损伤的保护作用,并观察PF对α-synuclein(α-syn)mRNA表达水平的影响。方法离体培养SD大鼠黑质器官型脑片,培养的d10给予不同浓度的MPP+(0.1、0.5、1.0mmol·L-1)处理24h,并在0.5mmol.L-1MPP+处理的基础上,给予1μmol·L-1或10μmol·L-1的PF进行干预。免疫组化法计数黑质致密部酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性细胞数,定量RT-PCR法检测α-syn mRNA的表达丰度。结果MPP+(0.1、0.5、1.0mmol.L-1)处理导致黑质致密部TH+细胞数较正常对照组减少,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);MPP+(0.5mmol.L-1)使α-syn mRNA的表达水平明显升高(P<0.01)。PF(10μmol·L-1)有效增加了TH+细胞的数量(P<0.01),并明显下调了α-syn mRNA的表达(P<0.05)。结论PF能有效拮抗MPP+导致的多巴胺能神经元受损死亡,其机制可能与下调α-syn的表达有关。     

LC-UV法测定大鼠血浆中依达拉奉及其药动学研究

目的:建立测定大鼠血浆中依达拉奉的HPLC-UV法,并研究经灌胃给药后的依达拉奉在大鼠体内的药动学特征。方法:经乙酸酸化的血浆样品以高氯酸直接沉淀后,进行LC-UV法分析,色谱柱为Symmetry Shield C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-50 mmol.L-1醋酸铵水溶液(40∶60),流速为1.0 mL.min-1,检测波长为240 nm,柱温为30℃。测定灌胃给药后大鼠血浆中依达拉奉的浓度,并计算主要药动学参数。结果:依达拉奉浓度在0.2～100.0μg.mL-1范围内线性关系良好,低、中、高3种浓度的日内日间精密度均小于10%。药动学参数:Cmax为(40.7±3.5)μg.mL-1;tmax为(0.22±0.11)h;AUC0～10为(41.6±6.1)μg.h.mL-1;AUC0～∞为(42.4±6.3)μg.h.mL-1;t1/2为(2.5±0.6)h。结论:该方法简单、灵敏,可用于依达拉奉在大鼠体内的药动学研究。     

黄芩苷及三七总皂苷配伍脑脊液药代动力学研究

目的建立大鼠脑脊液中黄芩苷的HPLC-MS/MS测定方法,研究黄芩苷及配伍三七总皂苷的大鼠脑脊液药代动力学变化。方法大鼠尾静脉注射黄芩苷和黄芩苷-三七总皂苷配伍溶液,采集脑脊液样品,利用LC-MS/MS测定脑脊液中黄芩苷的含量。色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为乙腈:1 mmol·L-1乙酸铵(含0.1%甲酸):0.1%氨水梯度洗脱;质谱检测离子为m/z 445/269(黄芩苷[M-1]-),m/z 237/194(卡马西平[M+1]+)。结果在5～200μg·L-1范围内,黄芩苷与内标卡马西平的峰面积比值与浓度的线性关系良好,回收率为87.15%～92.73%。黄芩苷在单独给药组和三七总皂苷配伍组的药代动力学参数分别为:Cmax为(189.67±20.13)、(237.00±51.86)μg·L-1,AUC0-t为(6612.96±1023.65)、(5466.63±267.06)μg·min·L-1,AUC0-∞为(6930.43±1060.41)、(5682.13±412.79)μg·min·L-1,T12为(108.84±45.67)、(102.54±38.37)min,CL为(15.39±2.60)、(18.32±0.88)L·min-1·kg-1。结论建立的HPLC-MS/MS测定方法能够准确灵敏地测定脑脊液中的黄芩苷。黄芩苷能够透过血脑屏障进入大鼠脑脊液,合用三七总皂苷后黄芩苷的药代动力学参数无明显变化,说明三七总皂苷对黄芩苷的脑脊液代谢没有明显影响。     

RP-HPLC测定拉米夫定的人体血药浓度及生物等效性研究

目的：建立人血浆中拉米夫定的HPLC测定法,研究拉米夫定片在健康中国志愿者体内的药动学特征及相对生物利用度。方法：20名健康男性志愿者采用随机分组、双交叉给药方案,分别单剂量口服0．3g的拉米夫定国产制剂与进口制剂,采用RP—HPLC法测定血药浓度,色谱柱为Kromasil C18柱（250mm×4．6mm ID,5μm）,流动相为甲醇：25mmol／L磷酸二氢钾（含体积分数为1％的三乙胺,pH3．3）（10：90）,流速1mL／min,检测波长UV280nm。应用DAS2．1软件处理数据,计算两组的药代动力学参数及相对生物利用度。结果：拉米夫定在25～7500μg／L内线性良好（r=0．9992）,血浆中低、中、高3种质量浓度（50、500、5000μg／L）的相对回收率在100．09％～103．36％之间,批内RSD≤2．2％,批间RSD≤7．8％。口服0．3g拉米夫定试验制剂（国产）及参比制剂（进口）后的主要药代动学参数如下：Cmax分别为（2835±734）和（2868±726）μg／L;tmax分别为（1．2±0．6）和（1．0±0．8）h;t1／2分别为（2．68±0．32）和（2．58±0．41）h;AUC1-14h分别为（10994±1839）和（10593±1654）μg·L^-1·h;AUC0-∞,分别为（11330±1908）和（10884±1734）μg·L^-1·h。试验制剂（T）的相对生物利用度为（104．80±15．56）％。结论：本法简便、灵敏、准确、稳定,可用于体内药物分析。国产拉米夫定片与进口片剂具有生物等效性。     

金丝桃苷对新生大鼠神经细胞缺氧/再给氧损伤的保护作用及其机制

目的探讨金丝桃苷(hyperin,Hyp)对新生大鼠脑细胞缺氧/再给氧损伤的保护作用及其机制。方法将分离的新生大鼠脑细胞缺氧30min或缺氧30min后再给氧40min造成细胞缺氧或再给氧损伤模型,测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)水平的变化,用Fura2-AM方法测定脑细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的变化。结果脑细胞缺氧时,细胞培养上清液中LDH从(62.0±13.0)U·L-1(Sham组)增高到(116.0±16.6)U·L-1(Control组,P<0.01),再给氧时,LDH和MDA分别从(45.6±9.2)U·L-1和(9.1±0.9)μmol·L-1(Sham组)增高到(106.0±17.4)U·L-1和(16.4±2.7)μmol·L-1(Control组,P<0.01)。Hyp在1.0～16.0μmol·L-1范围内,明显地抑制缺氧及再给氧损伤诱导的上述LDH和NO增高,并呈一定的浓度依赖性。1.0～16.0μmol·L-1的Hyp不仅可明显地抑制缺氧诱导的细胞培养上清液中NO和脑细胞内[Ca2+]i的增高(P<0.05或P<0.01),也可明显地抑制再给氧时NO和脑细胞内[Ca2+]i的升高(P<0.05或P<0.01),16.0μmol·L-1的Hyp可将再给氧时NO和[Ca2+]i分别从(34.4±6.3)μmol·L-1和(640±94)nmol·L-1(Control组)降至(25.0±5.1)μmol·L-1(P<0.05)和(331±56)nmol·L-1(P<0.01)。结论Hyp对神经细胞缺氧/再给氧损伤保护作用可能与抑制NO的释放、钙超载及自由基脂质过氧化有关。