两种人羊膜细胞的表型鉴定和分化潜能测定(英文)

本研究旨在分离、培养和表型鉴定两种人羊膜细胞并分析其多向分化潜能。羊膜中可分离出来源于外胚层的羊膜上皮细胞和来源于中胚层的羊膜间充质细胞。用流式细胞术和免疫荧光法对其进行表型鉴定,同时用免疫荧光法分析其多向分化潜能。结果表明:两种人羊膜细胞阳性表达HLA-A,B,C和间充质干细胞的标志(CD29,CD73,CD44,CD59,CD90,CD105,CH166),不表达造血干细胞的标志(CD31,CD34,CD45,HLA-DR),弱表达协同刺激分子(CD40,CD40L,CD80,CD86),且这些表型的表达量在第3-7代都维持稳定。免疫荧光法显示羊膜上皮细胞表达角蛋白19,不表达波形蛋白,而羊膜间充质细胞则相反。对其多向分化潜能测定显示,羊膜间充质细胞更好地向心肌细胞分化,而羊膜上皮细胞更好地向神经细胞分化。结论:从羊膜中可分离出羊膜上皮细胞和羊膜间充质细胞,两种细胞的表型相似,多向分化潜能却不同。羊膜上皮细胞具有更好的外胚层分化潜能,而羊膜间充质细胞更好地向中胚层分化。此结论对细胞治疗有很好的指导作用。     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性

背景:研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞.目的:研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性.方法:取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达.结果与结论:人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性.结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞.     

人羊膜间充质干细胞在大鼠受损肝组织中分化为肝细胞

背景:羊膜间充质干细胞在体外适当的诱导条件下可分化为肝细胞样细胞,而在受损肝脏原位是否可分化为肝细胞值得探讨。目的:观察人羊膜间充质干细胞在大鼠肝损伤原位植活及分化情况。方法:采用胰酶-胶原酶二酶消化法从羊膜组织中分离人羊膜间充质干细胞。采用腹腔注射D-氨基半乳糖建立大鼠肝损伤模型,随机分为2组,人羊膜间充质干细胞移植组造模后注射L-DMEM悬浮的人羊膜间充质干细胞悬液,对照组注射等量L-DMEM。结果与结论:①FCM分析结果显示,所分离的人羊膜间充质干细胞表达CD29、CD44和CD166;免疫荧光染色显示人羊膜间充质干细胞表达波形蛋白,不表达CK19。②与对照组比较,人羊膜间充质干细胞移植后肝病理无明显差异,均呈急性肝坏死病理改变。③免疫荧光双染色结果显示,人羊膜间充质干细胞移植后1周主要定植于肝小叶且表达CK19,至2周表达CK18,至3周表达Alb。结果表明,人羊膜间充质干细胞在大鼠受损肝组织中能被植活,且可分化为肝细胞,提示人羊膜间充质干细胞移植在临床肝病的治疗方面可能具有潜在应用价值。     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性

背景：研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。目的：研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性。方法：取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达。结果与结论：人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性。结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。     

人羊膜间充质干细胞在大鼠受损肝组织中分化为肝细胞

背景：羊膜间充质干细胞在体外适当的诱导条件下可分化为肝细胞样细胞,而在受损肝脏原位是否可分化为肝细胞值得探讨。目的：观察人羊膜间充质干细胞在大鼠肝损伤原位植活及分化情况。方法：采用胰酶-胶原酶二酶消化法从羊膜组织中分离人羊膜间充质干细胞。采用腹腔注射D-氨基半乳糖建立大鼠肝损伤模型,随机分为2组,人羊膜间充质干细胞移植组造模后注射L-DMEM悬浮的人羊膜间充质干细胞悬液,对照组注射等量L-DMEM。结果与结论：①FCM分析结果显示,所分离的人羊膜间充质干细胞表达CD29、CD44和CD166;免疫荧光染色显示人羊膜间充质干细胞表达波形蛋白,不表达CK19。②与对照组比较,人羊膜间充质干细胞移植后肝病理无明显差异,均呈急性肝坏死病理改变。③免疫荧光双染色结果显示,人羊膜间充质干细胞移植后1周主要定植于肝小叶且表达CK19,至2周表达CK18,至3周表达Alb。结果表明,人羊膜间充质干细胞在大鼠受损肝组织中能被植活,且可分化为肝细胞,提示人羊膜间充质干细胞移植在临床肝病的治疗方面可能具有潜在应用价值。     

体外诱导羊膜来源间充质干细胞分化为血管内皮细胞

背景：羊膜来源间充质干细胞植入机体不同类型组织后是否可以分化为相应组织靶细胞呢？目的：检测血管内皮细胞生长因子在体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性。方法：分离培养羊膜间充质干细胞,鉴定其表面抗原表达,用含体积分数2%胎牛血清以及50μg/L血管内皮生长因子的条件培养基诱导,诱导后细胞通过内皮细胞标志物血管内皮生长因子受体2以及v-WF染色鉴定。结果与结论：羊膜间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性。诱导后细胞形态明显改变,内皮细胞标志物血管内皮细胞生长因子受体2以及v-WF染色结果阳性。提示羊膜间充质干细胞在体外具有分化为血管内皮细胞的能力。     

体外诱导羊膜来源间充质干细胞分化为血管内皮细胞

背景:羊膜来源间充质干细胞植入机体不同类型组织后是否可以分化为相应组织靶细胞呢?目的:检测血管内皮细胞生长因子在体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性.方法:分离培养羊膜间充质干细胞,鉴定其表面抗原表达,用含体积分数2%胎牛血清以及50 μg/L血管内皮生长因子的条件培养基诱导,诱导后细胞通过内皮细胞标志物血管内皮生长因子受体2以及v-WF染色鉴定.结果与结论:羊膜间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性.诱导后细胞形态明显改变,内皮细胞标志物血管内皮细胞生长因子受体2以及v-WF染色结果阳性.提示羊膜间充质干细胞在体外具有分化为血管内皮细胞的能力.     

人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化

背景:国内外的研究多采用细胞因子诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞,而较少用人羊膜与骨髓间充质干细胞共培养的方法进行诱导分化。目的:观察人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞分化的可行性。方法:体外分离培养、扩增人骨髓间充质干细胞,选用第5代人骨髓间充质干细胞与健康人羊膜共培养12d进行诱导分化。结果与结论:人骨髓间充质干细胞贴壁生长,呈长梭形,流式细胞仪检测表达CD29,CD44的阳性细胞数分别为96.6%,94.6%。人羊膜与人骨髓间充质干细胞共培养12d,人骨髓间充质干细胞渐变为扁平的表皮样细胞,免疫组化染色显示CK19散在阳性,广谱CK为弥漫阳性。说明人羊膜可诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。     

人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化

背景：国内外的研究多采用细胞因子诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞,而较少用人羊膜与骨髓间充质干细胞共培养的方法进行诱导分化。目的：观察人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞分化的可行性。方法：体外分离培养、扩增人骨髓间充质干细胞,选用第5代人骨髓间充质干细胞与健康人羊膜共培养12d进行诱导分化。结果与结论：人骨髓间充质干细胞贴壁生长,呈长梭形,流式细胞仪检测表达CD29,CD44的阳性细胞数分别为96.6%,94.6%。人羊膜与人骨髓间充质干细胞共培养12d,人骨髓间充质干细胞渐变为扁平的表皮样细胞,免疫组化染色显示CK19散在阳性,广谱CK为弥漫阳性。说明人羊膜可诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。     

羊膜上皮细胞的体外培养及干细胞特性研究

目的:体外分离培养人羊膜上皮细胞(hAECS)并探讨其生物学特性。方法:取足月产胎儿胎盘,无菌条件下将胎盘的羊膜层与绒毛膜层分离。将洗净的羊膜组织用眼科剪剪成约1mm×1mm大小,加入0.05%的含有0.53mMEDTA4Na的胰酶制备羊膜上皮细胞并进行培养。用免疫荧光、Westernblot等方法检测干细胞相关表面标记物(0CT-4、Nanog、SSEA-4)等的表达情况。结果:根据免疫荧光组织化学,Westernblot的结果显示,羊膜上皮细胞0CT-4、Nanog、ssea-4、Nestin表达阳性。结论:羊膜上皮细胞表达类似胚胎干细胞的表面标志物,可以作为干细胞的新来源。     

人羊膜组织细胞的神经干细胞特性形态学研究

目的:利用形态学研究方法,探讨神经干细胞特异性标志蛋白的表达和增殖分化特性,鉴定人类羊膜组织中神经干/前体细胞的存在。方法:利用免疫组织化学法,检测人类羊膜组织和培养人类羊膜细胞中nestin、musashi-1、vimentin和PSA-NCAM等神经干细胞特异性标志蛋白的表达,利用BrdU掺入实验鉴定羊膜组织来源神经干/前体细胞的增殖分化能力。结果:免疫组织化学检测证实人羊膜组织表达nestin、musashi-1、CD133和vimentin等神经干细胞特异性标志蛋白,主要分布于羊膜组织的间质层。培养羊膜细胞的免疫荧光化学染色显示nestin、musashi-1、vimentin和PSA-NCAM阳性细胞的存在。BrdU掺入的组织形态学实验显示培养羊膜细胞中存在BrdU标记阳性细胞,其中具有BrdU与nestin、musashi-1、vimentin双标阳性细胞,显示羊膜细胞中存在具有增殖活性神经干细胞标记蛋白表达阳性细胞;而BrdU与β-tubullinIII、TH和GFAP双标阳性细胞的存在,表明神经元和胶质细胞是由培养羊膜细胞增殖分化的。结论:羊膜组织中存在神经干细胞特异性标记蛋白Nestin、Musashi-1、CD133、PSA-NCAM和Vimentin表达阳性细胞,BrdU掺入的组织形态学结果不仅证实羊膜细胞中Nestin、Musashi-1、Vimentin阳性细胞具有增殖活性,而且其中存在已分化的神经元和胶质细胞,提示羊膜组织细胞内存在神经干/前体细胞。     

大鼠羊膜上皮细胞体外诱导可分化为类神经干细胞

背景：以往研究发现修复神经损伤的细胞来源主要有许旺细胞、嗅鞘细胞、神经干细胞、激活的巨噬细胞等,但这些细胞存在着来源困难、有成瘤性、异体排斥等缺点.而羊膜上皮细胞不存在以上缺陷,且具有多向分化潜能,经诱导后可向心肌样细胞、神经干细胞、肝细胞、成骨和软骨细胞等分化.目的：体外培养大鼠羊膜上皮细胞,并诱导其向类神经干细胞方向分化.方法：取妊娠晚期大鼠,采用胰酶消化法获得羊膜上皮细胞,用无血清的神经干细胞条件培养基对细胞进行诱导分化,并用免疫细胞化学法和RT-PCR对诱导前后的细胞相关标志物进行鉴定.结果与结论：形态学观察结果显示,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞胞体回缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构,这些突起可交织成网状,细胞贴壁牢靠.免疫细胞化学检测结果显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞中巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白荧光强度较强,而特异性胚胎抗原4、波形蛋白荧光强度较弱.RT-PCR检测显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞的巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白 mRNA 的表达增强,而平滑肌22α、Sox-2及Nanog mRNA的表达减弱.说明体外诱导的大鼠羊膜上皮细胞可成功分化为类神经干细胞.     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人羊水间充质干细胞

背景：以间充质干细胞为载体的基因治疗新方法具有广阔的应用价值。目的：利用慢病毒感染方法将肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体导入人羊水来源的间充质干细胞,以期获得稳定表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的人羊水间充质干细胞。方法：首先利用多位点Gateway技术构建慢病毒表达载体pLVpuro／EFlet．肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体,将该表达载体与慢病毒包装质粒同时转染293FT细胞,从而获得携带肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒颗粒。利用重组慢病毒颗粒感染人羊水间充质干细胞,并通过抗生素筛选的方法获得稳定表达目的基因一肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的羊水间充质干细胞,并对其稳定性进行鉴定。结果与结论：酶联免疫吸附法和Westernblot检测结果表明,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在感染的人羊水间充质干细胞内呈高表达,其表达量可达到72μg／L。说明实验成功制备了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人羊水间充质干细胞。     

Turner综合征羊水干细胞的分离及特征

背景：羊水干细胞的分离培养及生物学特性相关研究取得了明显进展,但未见45,X／46,XX（Turner综合征）羊水细胞建系的报道。目的：建立体外培养人羊水来源干细胞的方法,初步探讨羊水干细胞的生物学特性。方法：孕中期羊膜腔穿刺获得1例染色体核型异常（45,X／46,XX）羊水标本,采用梯度稀释后低密度种植的方法获得羊水干细胞,体外传代培养,倒置显微镜观察细胞的贴壁生长情况,细胞染色体检查确认核型,流式细胞仪检测羊水干细胞特异性表面标志和细胞周期,进行成骨诱导分化及碱性磷酸酶染色和茜素红染色鉴定。结果与结论：羊水干细胞在体外培养体系中增殖迅速,核型为45,X／46,XX,流式细胞仪检测羊水干细胞表达CD29、CD44、CD90和CD105间充质干细胞表面标志,不表达造血干细胞标志CD45和CD34：大部分细胞处于G1期,增殖能力强。羊水干细胞经成骨诱导分化后,碱性磷酸酶染色和茜素红染色阳性。结果可见该实验成功分离获得45,X／46,XX（Turner综合征）羊水干细胞,其增殖能力强,表现间充质干细胞的特性。     

人羊膜上皮细胞分泌神经营养因子诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化:可能性验证

背景:课题组前期实验已证实人羊膜上皮细胞条件培养液可以诱导人脐血间充质干细胞分化为多巴胺能神经元样细胞,在此过程中人羊膜上皮细胞分泌的神经营养因子及其受体可能起到了重要作用.目的:探讨人羊膜上皮细胞分泌的神经营养因子对人脐血间充质干细胞神经分化的作用.方法:将P1代人脐血间充质干细胞按2×10~8 L~(-1)密度接种,分为3组:对照组加入HG-DMEM培养基;诱导组加入人羊膜上皮细胞条件培养液;阻断剂组预先加入阻断剂K252a工作液,36 ℃孵育40 min后更换为羊膜上皮细胞条件培养液.免疫荧光化学检测诱导后人脐血间充质干细胞神经元特异性烯醇化酶及多巴胺转运体的表达,实时定量PCR法检测诱导后人脐血间充质干细胞中神经元特异性烯醇化酶、多巴胺转运体及酪氨酸羟化酶的表达.结果与结论:人羊膜上清中有神经生长因子和脑源性神经营养因子的表达,且P1代人脐血间充质干细胞表达神经营养因子高黏附性受体Trka及Trkb.诱导48 h后与对照组比较,诱导组及阻断剂组神经元特异性烯醇化酶、多巴胺转运体阳性细胞数均明显增加(P < 0.05),且诱导组阳性细胞数最多(P < 0.05).诱导组、阻断剂组神经元特异性烯醇化酶、多巴胺转运体及酪氨酸羟化酶mRNA含量均显著高于对照组(P < 0.01),且诱导组各基因mRNA含量明显高于阻断剂组(P < 0.01).结果证实人羊膜上皮细胞分泌的神经营养因子对人脐血间充质干细胞的神经分化有重要作用,其促神经分化作用是通过酪氨酸激酶受体介导的.