多重PCR和间隔区寡核苷酸分型技术应用于不同流行地区的牛结核病研究

目的 在牛结核病监测中联合应用菌株的多重PCR鉴定和间隔区寡核苷酸分型(spoligotyping),快速鉴定分离菌株并分析不同地区流行菌株的特点。方法 分别在牛结核病清净地区和流行地区进行牛型PPD变态反应试验,扑杀阳性牛后进行病理检查,并采集病料分离细菌。获取分离菌株,进行多重PCR鉴定和spoligotyping分型,分析不同地区的菌株特征。结果 结核病清净地区监测到16头牛型PPD阳性牛,扑杀后未见有病变,采集病料分离到4株分枝杆菌,经多重PCR鉴定均为非典型分枝杆菌。流行地区监测牛型PPD阳性23头,扑杀后发现14头有病变,采集病料后共有11头分离到疑似菌,经多重PCR鉴定均为牛型分枝杆菌。用spoligotyping分析共分为4个型,其中2个为未见报道的新型,报英国AHVLA牛结核spoligotyping数据库后获取通用编号SB1903和SB1904。结论 分离菌株中的优势菌株为首次报道的SB1903,但也检出有国际流行菌株SB0140,证实该地区牛结核病的流行是以“独特菌型地域内相互传播为主、输入性感染为辅”为特征。本次监测发现国内有SB0140菌株分布,提示应调查该型菌是否已经传染至我国人间。     

结核分枝杆菌多重感染的初步研究

目的 鉴定结核分枝杆菌多重感染的存在.方法 从上海市疾病预防控制中心结核病参比实验室保存的菌株中,选择1999年至2004年在同一抗结核疗程中前后2次分离菌株的耐药表型改变的患者为研究对象.挑选并活化入选病例的首次分离株,分离培养单菌落.利用可变数目串联重复序列多态性分型(VNTR)方法,对每个分离株的30个单菌落进行基因型分析.结果 在22例入选病例中,2例患者的首次分离株中存在2种不同基因型的菌株.2种不同基因型菌株在单菌落中占的比例分别是24:6和29:1.其余20例患者分离株各自的30个单菌落的基因型相同.结论 上海地区结核病患者中存在结核分枝杆菌的多重感染.     

四川省川南地区结核分枝杆菌Spoligotyping分型研究

目的 了解四川省川南地区结核分枝杆菌基因型构成情况,为结核病防控提供分子流行病学依据。方法 采用间隔区寡核苷酸分型(Spacer Oligonucletide typing, Spoligotyping)方法对四川省川南地区267株临床分离菌株进行基因分型,结果采用BioNumerics(Version 5.10)软件进行分析,并将Spoligotyping分型结果与SpolDB4.0数据库中的菌株进行比对分析。结果 267株结核分枝杆菌表现出66种基因型,其中51株表现为独特基因型,其余216株可聚为10个基因簇。与SpolDB4数据库比对分析发现,267株结核分枝杆菌中,144株为北京家族菌株(53.93%),79株为T家族菌株(29.59%),9株为H家族菌株,3株为U家族菌株,2株为MANU家族菌株,其余30株表现的基因型为数据库中不存在的基因型。结论 四川省川南地区结核分枝杆菌存在较高的基因多态性,北京家族菌株和T家族菌株为主要的流行菌株,应加强对这两类菌株的流行趋势的监测及生物学特性研究。     

IS6110-限制性片段长度多态性和间隔区寡核苷酸分型技术在结核分枝杆菌菌株鉴定中的应用

目的评价IS6110-限制性片段长度多态性（IS6110-RFLP）和间隔区寡核苷酸分型技术（spoligotyping）两种方法在结核病流行病学中的应用，探讨我国各地区的结核分枝杆菌菌株特点。方法收集158株结核分枝杆菌临床分离株，分别应用IS6110-RFLP和Spoligotyping两种方法进行鉴定。结果①IS6110-RFLP的分辨力大于spoligotyping分型。②将本次实验结果与国际spoligotype数据库进行比较。结果有14个类型属于共有类型，其中类型1为流行的类型，分布广泛，即所说的北京基因型。③广东地区与其他地区成簇率和北京基因型所占比例差异有统计学意义（P〈0．05）。广东地区成簇率和北京基因型所占比例均显著低于其他地区。结论同时应用IS6110-RFLP分型和Spoligotyping两种方法进行结核病流行病学调查研究非常有效，在中国不同地区的菌株具有不同的特点。     

波兰肺结核患者耐药结核分枝杆菌分子流行病学研究

目的：描述波兰耐药结核分枝杆菌分离株的特征，估计人群中近期传播的数量。 设计：应用间隔区寡核苷酸分型及IS6110DNA指纹图谱法对2000年波兰251名耐药肺结核患者分离株进行分析。对部分菌株进行rpoB、katG和，或inhA基因调节区测序分析。 结果：应用间隔区寡核苷酸分型BS6110-RFLP相结合的成簇定义，29％的菌株成簇，提示存在近期传播。成簇菌株中某些病例的传播联系得到了流行病学资料证实，多数分离株的突变与利福平和异烟肼耐药相关。年龄、性别、移民身份、用药史和戍簇没有关系，耐多药病例更容易成簇。在波兰，也发现了北京基因型分离株，但频率较邻国偏低。 结论：证实了耐药结核菌的传播及其对波兰发生耐药结核病的作用。     

Spoligotyping对广西地区208株结核分枝杆菌临床分离株的基因分型

目的用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)对广西地区结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型,并分析北京家族菌株与耐药的相关性。方法收集广西地区结核分枝杆菌临床分离株,应用Spoligotyping进行基因分型研究和比例法进行药物敏感性检测。基因聚类分析采用BioNumerics软件。统计分析采用χ2检验。结果共在广西地区收集到208株结核分枝杆菌临床分离株,可分为2个基因群,即北京家族(Beijingfamily)或称北京基因型(Beijinggenotype),和非北京家族(Non-Beijingfamily),分别占55.3%(115/208)和44.7%(93/208),47种基因型,其中36株为独特类型,剩余172株分为11簇。北京家族菌株中,90.4%(104/115)为典型北京家族(TypicalBeijingfamily),非北京家族菌株表现为高度的基因多态性,可分为39个基因型,31株为独特的基因型。有耐药结果的205株菌株中,北京家族菌株,76.25%(76/113)表现为全敏感,而23.75%(37/113)表现为耐药;非北京家族菌株,75%表现为全敏感,而25%表现耐药,经卡方检验(Chi-SquareTests)(表2),两者间的差异无统计学意义(χ2=2.9721,P>0.05)。结论广西结核分枝杆菌存在明显的基因多态性。本研究证实北京基因型与耐药无明显相关性。     

220株结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型研究

目的了解结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型种类和特征,为结核病防治研究提供基础科学依据。评价两种分型方法在北京地区结核病分子流行病学中的应用。方法收集北京市结核分枝杆菌临床分离株,应用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)二种分型方法进行基因分型,结果聚类分析采用BioNu-merics(Version5.0)软件。结果共在北京地区收集到220株结核分枝杆菌临床分离株。采用Spoligotyping分型方法,220株菌可分为2个基因群,即北京家族(Beijing family)和非北京家族(non-Beijing family),20种基因型。其中北京家族含有202株菌,占91.82%。北京家族菌株中,典型北京家族菌株占95.05%(192/202),非典型北京家族占4.95%(10/202)。北京家族菌株的耐药率为22.55%(22/98),非北京家族菌株的耐药率为16.67%(1/6),两者间的差异无统计学意义(fisher analysis,P=0.5835>0.05)。采用MLVA分型方法,202株菌可分成5个基因群59种基因型,主要为Beijing family、China2和China3,分别占91.37%、2.73%和4.55%。结论北京地区结核分枝杆菌具有明显的基因多态性,其主要流行型为北京家族。北京家族菌株与耐药性无明显相关性。     

MLVA技术用于福建105株结核分枝杆菌基因分型的初步研究

目的探讨MLVA技术在福建省结核分枝杆菌基因分型中的应用。方法选取12个分型效果较好的VNTR基因位点。应用聚合酶链反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳,建立检测结核分枝杆菌DNA指纹多态性的方法,分析结核分枝杆菌DNA多态性。结果共对105株结核分枝杆菌的12个VNTR位点进行了检测,根据这些菌株的指纹多态性特征,共分为4个基因型(I型I、I型I、II型I、V型),其中Ⅰ型所占比例最大,为66.7%(70/105),Ⅱ型占20%(21/105),Ⅲ型占9.5%(10/105),Ⅳ型占3.8%(4/105)。结论结果提示福建省结核分枝杆菌的传播是以Ⅰ型菌株为主,应加强此型菌株流行的监控。     

Spoligotyping和MLVA用于71株浙江省结核分枝杆菌临床分离株基因分型的初步研究

目的初步探讨寡核苷酸分型(Spoligotyping)和多位点数目可变串联重复序列分析(MLVA)用于浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株的分型,以初步了解浙江省结核分枝杆菌的基因型特征。方法随机选取浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株,常规培养,收集菌体,提取基因组DNA。采用聚合酶链反应(PCR)扩增整个DR区进行Spoligotyping分型,同时分别扩增15个VNTR位点进行MLVA分型。聚类分析采用BioNumerics软件。统计学分析采用卡方检验。结果对70株菌进行了基因分型,Spoligotyping结果显示,可分为2个基因群,即北京家族(Beijingfamily)和非北京家族(Non-Beijingfamily),分别占70和30,49株北京家族菌株中,89.8为典型北京家族;MLVA结果显示,可分4个基因群,分别为Ⅰ群占8.5,含5个基因型,Ⅱ群占18.3,含13个基因型,Ⅲ群占70.4,含38个基因型,Ⅳ群占2.8,含2个基因型。两种方法对菌株的基因分型结果非常吻合,Spoligotyping分型为北京家族的菌株均分布在MLVAⅢ型中,非北京家族菌株的基因多态性,分属于MLVAⅠ、Ⅱ和Ⅳ型。MLVA将70株菌分为58个基因型(含53个独特基因型),而Spoligotyping只分为18种基因型(含12个独特基因型)。结合对临床一线4种药物的耐药检测结果分析,两种方法的分型结果均显示北京家族菌株中表现为全敏感者71.4(35/49),表现为耐药者为28.6(14/49);而非北京家族菌株中表现为全敏感者为66.7,表现为耐药者为33.3,经卡方检验,两者间的差异无统计学意义(χ2=0.158,P>0.05)。结论初步证实浙江省结核分枝杆菌存在明显的基因多态性,主要流行型为北京家族。北京家族与耐药无明显相关性。MLVA株水平鉴定能力明显高于Spoligotyping,尤其是在鉴别北京家族菌株上具有明显的优势。     

结核分枝杆菌分子分型技术的研究和应用

结核分枝杆菌是引发结核病的病原菌。近年,结核病发病有增加趋势,特别是结核杆菌耐药株增多,这些都提示其分子流行病学特点发生了改变。对不同基因型的结核病患者选取不同的治疗方案,是当今个性化医疗和结核病有效治疗的必然要求。目前广泛使用的结核分枝杆菌基因分型方法主要有插入序列6110限制性片段长度多态性、间隔区寡核苷酸分型法、多位点串联重复序列分析、全基因组测序技术、耐药相关基因突变谱分析、基因芯片分型技术等,这些方法在临床和基础研究中的应用各有利弊。本文对结核分枝杆菌的基因分型技术和应用作一综述,以期为临床工作者和基础研究人员选择适合的分型技术提供理论依据。     

深圳献血员结核分枝杆菌潜伏感染调查研究

目的了解深圳献血员结核分枝杆菌潜伏感染的情况和相关特点。方法使用ELISPOT技术检测结核分枝杆菌特异性IFN-γ来了解1503例合格献血员结核分枝杆菌潜伏感染情况。结果 1503例合格献血员中有148例为结核分枝杆菌潜伏感染阳性,阳性率为9.85%,男性与女性阳性率没有差异,年龄在25岁以下人群阳性率低于年龄在25岁以上人群。结论献血员结核分枝杆菌潜伏感染问题不容忽视。     

基于PCR熔解曲线技术的结核分枝杆菌Spoligotyping基因分型的临床应用研究

目的 利用基于PCR熔解曲线技术的结核分枝杆菌Spoligotyping基因分型方法(McSpoligotyping)对结核分枝杆菌分离株进行基因分型,以评价其在结核病流行病学调查中的应用价值。方法 对广西2017年结核耐药监测点收集的949株结核分枝杆菌,采用McSpoligotyping分型方法对其进行基因分型。首先,通过对其中的361株菌株的McSpoligotyping 分型结果与全基因组测序(WGS)结果的一致性比较来评价McSpoligotyping分型方法。其次,对949株菌株分型数据与SITVITWEB数据库进行比对,获取间隔区寡核苷酸国际型别(spoligotype intemational type,SIT)编号,将分型结果提交到https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces 网站进行聚类分析。结果 McSpoligotyping分型与WGS结果一致率为94.18%(340/361),在结果不一致标本中,出现不一致较多间隔序列在第5间隔。在949株菌株中新发现基因型为121株,已定义基因型为828株;其中已定义基因型共分为84种基因型,主要归属于5种基因家族(BEIJING、T、H、EAI、LAM)和3个家系(Lineage 1、Lineage 2、Lineage 4);5种基因家族主要流行为BEIJING和T基因家族,家系中主要流行为Lineage 2。949株菌株中的822株聚为49个簇(2~528株),最大一簇为Beijing家族SIT1基因型,其余的127株菌表现为独特的基因型。结论 利用PCR熔解曲线技术可快速对MTB进行基因分型,此技术较传统方法操作简便、耗时短,对结核病疫情处置及结核病分子流行病学研究具有重要意义。     

青海省251株结核分枝杆菌Spoligotyping基因型与4种一线药物耐药表型的研究

目的研究青海结核分枝杆菌对4种一线抗结核药物耐药状况及与Spoligotyping基因型的关系,为结核病有效预防提供依据。方法采用常规比例法对分离的251株结核分枝杆菌进行异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)等4种一线抗结核药物的药敏试验,并对菌株进行Spoligotyping分型,对药敏试验和基因分型结果进行综合分析。结果 251株结核分枝杆菌中,总耐药率为56.2%;对INH、RFP、SM和EMB的耐药率分别为43.0%(108/251)、37.1%(93/251)、39.0%(98/251)和27.9%(70/251);耐多药率为31.5%(79/251)。所有菌株经Spoligotyping分型,分为北京基因型185株(73.7%)与非北京型菌株66株(26.3%)。未发现北京型与非北京型结核菌株与耐药存在统计学关联。结论青海流行的结核分枝杆菌耐药率及多耐药率较高,Spoligotyping分型显示北京基因型为主要流行型。     

抗原刺激后外周血单个核细胞γ干扰素释放反应在结核分枝杆菌感染和结核病诊断中的意义

目的 探讨3种结核分枝杆菌抗原刺激后外周血单个核细胞（PBMC）γ干扰素（IFN-γ）释放反应对结核性感染和结核病的诊断意义。方法 获取活动性结核病患者（结核组，57例）、肺癌患者（肺癌组，29例）和健康人（健康对照组，27名）外周血单个核细胞。分别将结核分枝杆菌纯蛋白衍生物（PPD）、结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6000蛋白（ESAT6）和38000抗原与PBMC共培养5d，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测培养上清液中IFN-γ浓度。比较3种抗原PBMC IFN-γ释放水平和PPD皮试（TST）结果。结果 （1）健康对照组：TST反应与BCG接种史及排菌患者接触密切程度经Logistic回归分析显示均呈正相关（P=0．047和P=0．041）；以ESAT6为抗原的PBMC IFN-γ释放水平与结核病患者接触密切程度相关（P=0．005），而与BCG接种史无明显相关性。（2）3组间TST结果差异无显著性。（3）以38000抗原刺激后IFN-1释放水平为观察指标，经受试者操作特性（ROC）曲线分析获得最佳域值为1000pg／ml，以此判断38000抗原刺激后IFN-γ释放水平诊断结核病敏感性为64．9％，特异性为89．3％，准确性为77．0％，阳性预测值为86．0％，阴性预测值为71．0％。结论 ESAT6抗原的IFN-γ释放反应对结核分枝杆菌感染的诊断意义优于TST，38000抗原刺激后IFN-γ释放反应对结核病的临床诊断有辅助意义。     

591株结核分枝杆菌耐药情况分析

目的回顾性分析湖南省结核病医院结核病人中结核分枝杆菌耐药状况并分析耐药形成原因。方法分析2003年5月1日—2007年12月31日间分离培养出并使用噻吩-2羧基肼（TCH）和对硝基苯甲酸（PNB）进行分型确认的591株结核分枝杆菌药物敏感试验结果,包括异烟肼（INH、H）、利福平(RFP、R)、硫酸链霉素（SM、S）、对氨基水杨酸钠(PAS、P)、乙胺丁醇(EMB、E)、卡那霉素(KM、K)、左氧氟沙星（OFLX、O）。7种药物采用绝对浓度法进行药物敏感性检测。结果591株结核分枝杆菌中,至少耐一药为63.6%（376/591）;同时对7种药物耐药率为0.2%（1/591）;耐多药率（MDR）为38.6%(228/591)。结论结核病人耐药情况比较严重,需要更严格的执行结核病控制策略,防止耐药病人及耐药菌株的产生和传播。     

重组结核分枝杆菌11 000蛋白对结核分枝杆菌感染的鉴别作用

目的 研究重组结核分枝杆菌11 000蛋白对结核分枝杆菌感染的鉴别作用.方法 以不同分枝杆菌分别致敏豚鼠,致敏成功后给所有动物皮内注射重组结核分枝杆菌11 000蛋白和结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)或胞内分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD-B),用双盲法记录注射后24 h和(或)48 h注射局部皮肤反应的纵、横径,计算其均值.结果 PPD或PPD-B对所有分枝杆菌致敏豚鼠的皮肤反应均为阳性,局部硬结直径均大于10 mm;重组结核分枝杆菌11 000蛋白对结核分枝杆菌活菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌致敏豚鼠的皮肤试验为阳性,局部硬结直径依次为(14.7±2.0)、(9.3±3.8)、(18.7±2.4)和(14.8±4.2) mm,而对灭活结核分枝杆菌、卡介苗和其他非结核分枝杆菌致敏豚鼠的皮肤试验均为阴性.结论 重组结核分枝杆菌11 000蛋白可有效鉴别结核分枝杆菌活菌感染和卡介苗接种、结核分枝杆菌死菌致敏以及其他非结核分枝杆菌的感染.     

DNA指纹技术检测耐多药结核分枝杆菌的应用研究

目的应用结核分枝杆菌DNA指纹技术,了解耐多药结核分枝杆菌的基因型状况并探讨耐多药结核病的分子流行病学。方法以结核分枝杆菌插入序列IS6110序列为模板,设计一对特异外向引物,建立一种结核分枝杆菌DNA指纹技术方法,对临床标本中分离的220株耐多药结核分枝杆菌进行DNA指纹基因分析。同时对实验数据进行聚类分析,进行耐多药结核病分子流行病学研究。结果根据结核分枝杆菌DNA指纹图谱分析,220株耐多药结核分枝杆菌均产生特征DNA指纹图谱,DNA指纹图谱变异很大。每一菌株DNA指纹的拷贝数介于3至18之间。其中大部分菌株,即205株（93.2%）包含613个拷贝,平均为11个带。这205株DNA指纹图谱中,162株为特异的,提示它们在流行病学上是独立的。有58株（26.4%）指纹图谱组成了15个簇,每簇28株,它们的IDNA指纹图谱相同,可能代表了近期的传播。尤其是在此DNA指纹图谱中,其中分子量为200 bp扩增带频率最大,在220株耐多药结核分枝杆菌均出现。结论结核杆菌DNA指纹技术检测可应用耐多药结核分枝杆菌DNA指纹图谱分型,并可用于耐多药结核病分子流行病学调查。     

应用噬菌体裂解法快速鉴定结核分支杆菌

目的 研究噬菌体裂解试验对结核分支杆菌快速鉴定的意义。方法 应用结核分支杆菌噬菌斑技术快速检测结核分支杆菌、非结核分支杆菌和非分支杆菌及肺结核患者痰标本。结果 结核分支杆菌H37Rv、牛分支杆菌和非洲分支杆菌噬菌体裂解试验均为阳性,10株常见非结核分支杆菌和7株非分支杆菌均为阴性;30株结核分支杆菌临床分离株本法检测结果全部阳性;20份涂阳培阳肺结核患者痰标本,本法阳性19份（95％）;21份涂阴培阳痰标本,本法阳性15份（71％）;19份涂阴培阴痰标本,5份阳性（26％）。结论 噬菌体裂解试验可以快速鉴定结核分支杆菌,用其检测痰标本中的结核分支杆菌具有很高的特异性和较高的敏感性。