人CCL5基因RNA干扰慢病毒载体的构建

目的 构建人CCL5基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体.方法 根据人CCL5基因信息,构建4个携带RNAi序列的pGCSIL-GFP质粒,与pHelper 1.0、Helper 2.0质粒一起利用293T细胞进行慢病毒包装.用CCL5 RNAi慢病毒载体感染人宫颈癌细胞(Hela),使用RT-PCR方法验证其干扰效率.结果 4个靶点中有3个靶点(a1、a2、a3)在Hela细胞上对CCL5基因的表达都有非常显著的敲减效果,敲减效率均达到95%以上.结论 构建的CCL5 RNAi慢病毒载体在Hela细胞中有较高的敲减效率,提示RNAi技术能够使细胞CCL5基因沉默.     

人碱性成纤维生长因子基因重组慢病毒载体的构建

目的 构建携带人碱性成纤维生长因子(bFGF)基因的重组慢病毒表达载体.方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法钓取人源性的bFGF和FGF4两个目的 基因片段,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU[含绿色荧光蛋白(GFP)]中,得到pGC FU-FGF4-bFGF,通过PCR、酶切、测序和对比验证bFGF后,通过Lipofectamine 2000的介导把pGC FU-FGF4-bFGF质粒和包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染至包装细胞293T,经同源重组产生重组慢病毒pGC FU-FGF4-bFGF,pGC FU-FGF4-bFGF在293T细胞内大量扩增,应用实时定量PCR法鉴定和测定滴度.结果 克隆得到500bp目的 bFGF全长基因,经过PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,bFGF基因成功克隆到慢病毒载体中,可实现bFGF基因的表达,且病毒滴度为2.0×109 TU/ml.结论 成功构建表达人bFGF基因的慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够高的病毒滴度,可作为后续基因治疗研究工作的基因转染工具.     

人分化抑制蛋白1慢病毒干扰载体的构建、筛选及其沉默效应的鉴定

目的探索以小干扰RNA（si RNA）慢病毒干扰载体组建的慢病毒对人Hep G2细胞分化抑制蛋白1（Id1）基因的沉默效应。方法构建4种针对Id1基因不同干扰靶点的Id1-siRNA慢病毒干扰载体（pCGSIL-GFPId1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3及pCGSIL-GFP-Id1-4）,将其转染至293T细胞,以筛选出针对Id1基因的最有效的RNA干扰（RNAi）靶序列。再以沉默效果最优的干扰载体进一步构建慢病毒（Id1-RNAi-LV）,感染人HepG2细胞后,采用实时定量PCR法和Western blot法分别检测其Id1 mRNA及其蛋白的表达水平。结果与pCGSIL-GFP-Id1-1组、pCGSIL-GFP-Id1-2组及p CGSIL-GFP-Id1-3组比较,pCGSIL-GFP-Id1-4组的Id1蛋白表达水平最低（P〈0.05）,沉默效果最优。以pCGSIL-GFP-Id1-4干扰载体组建慢病毒后,测得慢病毒的病毒滴度为2.0×10^9 TU/mL。与空白对照组和阴性对照组比较,以组建的慢病毒感染人HepG2细胞后,人HepG2细胞中Id1m RNA及其蛋白的表达水平均降低（P〈0.05）。结论本实验构建的特异性慢病毒可稳定地介导Id1基因的沉默。     

肺癌相关基因SLC35F2 RNA干扰重组慢病毒载体的构建和鉴定

目的 针对肺癌相关基因SLC35F2构建RNA干扰(RNAi)重组慢病毒质粒并进行慢病毒包装,建立SLC35F2表达稳定抑制的H1299肺癌细胞株,并探讨SLC35F2基因的功能.方法 应用pGCSIL-PUR慢病毒载体构建针对SLC35F2的ShRNA载体,转染包装293T细胞,收集病毒上清转染肺癌细胞株H1299,经嘌呤霉素(puromycin)筛选并扩大培养得到稳定克隆;实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot检测癌细胞内SLC35F2的表达;CCK-8比色法检测细胞增殖;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡.结果 成功构建SLC35F2-ShRNA慢病毒载体(SLC-siRNA)及SLC35F2表达稳定抑制的肺癌细胞株,经过检测证实SLC-siRNA慢病毒载体对SLC35F2的抑制效率达81.8%;CCK-8检测显示SLC-siRNA稳定转染的H1299细胞株生长抑制率达16.3%,稳定转染株凋亡细胞百分比较阴性对照组明显升高(14.88%比3.16%,P＜0.05).结论 慢病毒载体介导的靶向SLC35F2的RNAi可有效抑制SLC35F2表达,降低肺癌细胞的增殖能力,增加其凋亡比例.

Abstract：

Objective To investigate the possibility of SLC35F2 inhibition by lentiviral vector-mediated RNA interference (RNAi) and the influence on cell proliferation and apoptosis in lung cancer cell line,and to set up a lung cancer cell line in which SLC35F2 is stably suppressed.Methods The lentiviral vector of siRNA targeted against SLC35F2 (SLC-siRNA) was constructed and transfected into the packaging cells 293T,and the viral supernatant was collected to transfect H1299 cells.After selection by puromycin and culture expansion,the stable cell clones were attained.Quantitative real-time fluorescent polymerase chain reaction (PCR) and Western blotting were used to detect the expression of SLC35F2.The effect of SLC35F2 silencing by RNAi on cell proliferation was quantified by CCK-8 assay.Annexin V-FITC/PI staining was employed to examine the apoptosis.Results Lentiviral vector SLC35F2-shRNA was constructed successfully.As compared with control group,the SLC35F2 expression was decreased to 81.8% in RNA and protein levels.CCK-8 revealed that the inhibition rate of H1299 cells transfected with SLC35F2 was 16.3%,and the apoptosis rate was significantly increased as compared with negative control group ( 14.88% vs 3.16% ,P ＜0.05 ).Conclusion Lentiviral vector-mediated RNA interference targeting against SLC35F2 can effectively inhibit SLC35F2 expression and cell proliferation.The lung cell line in which SLC35F2 gene was stably suppressed was successfully established.     

人VEGF基因慢病毒介导RNA干扰有效靶点的设计及筛选

目的:设计并筛选人血管内皮生长因子(VEGF)有效RNA干扰片段,构建VEGF慢病毒表达载体。方法:对人VEGF基因编码区分析,筛选序列3条,阴性对照序列l条,通过连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测干扰效果。结果:测序证实3个VEGF基因RNAi慢病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度分别为3.23×109、3.30×109、3.73×109TU/mL。3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L后,VEGF基因在mRNA水平受到抑制,其中miR-200序列效果最佳,对VEGF基因表达的干扰效率可达72%。结论:成功构建并筛选了人VEGF基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究VEGF基因与抗肿瘤药物药效关系提供实验基础。     

人FoxA1基因重组慢病毒载体的构建和鉴定

【摘要】 目的 构建叉头盒蛋白A1(Forkhead-boxA1,FoxA1)的重组慢病毒表达载体,为探究其功能和作用机制奠定基础。方法〓设计基因引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增出FoxA1的cDNA序列,然后将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经PCR、双酶切反应及DNA测序鉴定,将阳性重组FoxA1表达载体、pCMV-VSV-G 和pCMV-dR8.91包装质粒共转染到HEK-293T细胞进行病毒包装收集病毒浓缩液,然后再感染293T细胞,通过观察绿色荧光蛋白来计算病毒滴度,最后用病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞(HFFs),通过实时荧光定量PCR检测FoxA1 mRNA的表达水平。结果〓重组慢病毒表达载体FoxA1经PCR扩增、酶切及测序鉴定正确,并得到滴度为1×108 TU/mL的病毒液,病毒感染人皮肤成纤维细胞后表达显著增强。结论〓成功构建了人FoxA1重组慢病毒载体,并可在HFFs内高效表达,为后续FoxA1的功能和机理研究奠定了实验基础。     

大鼠Smad6慢病毒干扰载体的构建与鉴定

目的 构建大鼠Smad6基因的慢病毒干扰载体,并在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)中验证其基因沉默效率.方法 针对大鼠Smad6基因设计、合成两对Smad6-shRNA干扰序列,并将其重组到pLKO.1质粒载体中.测序验证后在HEK293T细胞内组装慢病毒.最后体外分离培养大鼠BMSC,通过慢病毒感染将Smad6干扰序...     

下调TPH2重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建色氨酸羟化酶(TPH)-2基因小干涉RNA的重组慢病毒载体.方法 在TPH-2 mRNA序列中选择1个特异性靶序列,体外合成对应发卡样DNA片段,经退火后,将其定向克隆入siRNA载体,获得重组质粒pU6 -MCS-CMV-TPH2-shRNA,后者与慢病毒试剂共转染293细胞,同源重组产生Lentivirus-TPH2-siRNA.经聚合酶链反应(PCR)鉴定目的基因的表达并测定病毒滴度.结果 PCR表明Lentivirus-TPH2-siRNA构建正确,病毒滴度为3×108 TU/rnl.结论 获得的Lentivirus-TPH2-siRNA可以用于转基因瘙痒治疗的实验研究.     

Tie2基因RNAi慢病毒载体的构建及其干预恶性黑色素瘤细胞的体外研究

目的 构建携带酪氨酸蛋白激酶受体2-小干扰RNA(Tie2-SiRNA)慢病毒载体,观察其对恶性黑色素瘤细胞的干扰作用.方法 将pSilencer 1.0-U6启动子-酪氨酸蛋白激酶受体2-小干扰RNA(pSilencer 1.0-U6-Tie2-siRNA)重组质粒经Xba Ⅰ酶切电泳鉴定后,与经Xba Ⅰ酶切电泳鉴定的带有加强绿色荧光蛋白的转移质粒(pNL-EGFP)载体连接,产生加强绿色荧光蛋白的转移质粒-u6启动子-酪氨酸蛋白激酶受体2-Ⅰ(pNL-EGFP-U6-Tie2-Ⅰ)、pNL-EGFP-U6-Tie2-Ⅱ慢病毒转移质粒,电泳筛选阳性克隆,测序鉴定.用连接成功的慢病毒转移质粒,分别与水疱性口炎病毒G蛋白(pVSVG)包膜质粒和pHelper包装质粒组成慢病毒三质粒转染系统,再共转染293T细胞,产生pNL-EGFP-U6-Tie2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Tie2-Ⅱ慢病毒.收集病毒上清,测定病毒滴度.将收集的病毒上清感染恶性黑色素瘤细胞,通过实时荧光定量RT-PCR测定抑制Tie2基因表达的效率.结果 酶切电泳与测序鉴定证实成功构建了Tie2-SiRNA慢病毒载体,293T细胞测定病毒原液滴度为8.8×103/ml.实时荧光定量RT-PCR结果显示:Tie2-SiRNA慢病毒载体感染恶性黑色素瘤细胞,抑制了恶性黑色素瘤细胞中Tie2基因的表达,其中较高者可达68.55%,并且2种慢病毒载体之间差异无统计学意义(t=0.362,P＞0.05).结论 成功构建了Tie2-SiRNA慢病毒载体,体外研究显示其能抑制Tie2 mRNA的表达,为下一步进行抑制肿瘤生成的动物实验研究奠定了基础.

Abstract：

Objective To construct lentivector carrying Tie2-Small interfering RNA(SiRNA),so as to study its influence on malignant melanoma cells.Methods Recombinant plasmid pSilencer 1.0-U6-Tie2-siRNA and plasmid pNL-EGFP were digested with Xbal.ligated a target lentiviral transfer plasmid of pNL-EGFP-U6-Tie2-Ⅰ or pNL-EGFP-U6-Tie2-Ⅱ,and then the electrophoresis clones was sequenced.Plasmids of pNL-EGFP-U6-Tie2-1 and pNL-EGFP-U6-Tie2-Ⅱ were constructed and combined with pVSVG and pHelper,respcectively,to constitute lentiviral vector system of three plasmids.The Lentiviral vector svstem was transfected into 293T cell to produce pNL-EGFP-U6-Tie2-Ⅰ and pNL-EGFP-U6-Tie2-Ⅱ lentivirus.Then the supernatant was collected tO determine the titer.Malignant melanoma cells were infected by both lentiviruses and identified by Realtime RT-PCR to assess inhibitory efficiency. Results The recombinant lentiviral vectors of Tie2-RNAi were constructed successfully which were analyzed with restriction enzyme digestion and identified by sequencing.And the titer of lentiviral vector was 8.8×103/ml,which was determined by 293T cell.The results of Reahime RT-PCR demonstrated that the lentiviral vectors of Tie2-RNAi could infect malignant melanoma cells and inhibit the expression of Tie2 genes in malignant melanoma cells(P＜0.01).There was no significant difference in the expression level (P＞0.05)between the two lentiviral vectors of Tie2-RNAi.Conclusions Lentivector carrying Tie2-SiRNA can be constructed successfully and inhibit the expression of Tie2 gene in vitro significantly.The study will supply the theory basis for the further research on the inhibition of tumor growth in vivo.     

小干扰RNA沉默Y盒结合蛋白-1基因对肺腺癌A549细胞株表皮生长因子受体表达的影响

目的 观察Y盒结合蛋白-1(YB-1)小干扰RNA (siRNA)对肺腺癌A549细胞株表皮生长因子受体(EGFR)的影响.方法 针对YB-1 mRNA设计特异性siRNA及Control siRNA序列转染至A549细胞株,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测空白组、单纯Lipofectamine 2000处理组、Control siRNA组及YB-1 siRNA组细胞中YB-1和EGFR在mRNA和蛋白水平的表达;通过噻唑蓝(MTT)、侵袭实验观察各组细胞的生物学行为变化.结果 RT-PCR和Western blot结果显示实验组YB-1与EGFR的mRNA和蛋白表达降低(分别为0.3820±0.0094、0.4690±0.0032和0.1820±0.0073、0.4210±0.0049),与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).MTT检测转染72 h后YB-1 siRNA组吸光度值为1.34 ±0.11,同时转染48 h后YB-1 siRNA组侵袭能力较对照组明显降低(P＜0.05).结论 YB-1 siRNA能抑制肺腺癌A549细胞株中EGFR的表达,影响肿瘤增殖和侵袭能力.     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Wip1基因对人脑胶质母细胞瘤细胞生长的影响

目的 构建人Wip1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默人胶质瘤U251细胞的Wip1基因并观察其对细胞生长的影响.方法 设计并合成3条Wip1基因特异性RNAi靶序列,构建到慢病毒pFU-GW-iRNA载体中.慢病毒包装转染HEK293T细胞,获得病毒上清并测定其滴度;感染U251细胞,实时定量聚合酶链反应(PCR)及Western blot鉴定RNA干扰效率;筛选出基因沉默效率最高的慢病毒感染U251细胞,CCK-8法检测细胞的增殖,Western blot检测RNA干扰后的bcl-2蛋白表达.结果 PCR扩增和测序表明成功构建Wip1慢病毒干扰载体,病毒载体包装获得的病毒上清滴度在3×10~8～8×10~8 TU/ml.可以有效地沉默U251细胞中Wip1基因的表达,构建的RNAi慢病毒载体感染U251细胞后Wip1基因的mRNA表达量同对照组比较分别为36.3%、32.9%、23.8%.稳定Wip1 RNA干扰后的U251细胞4 d后细胞增殖能力下降35.1%.结论 慢病毒介导的RNA干扰可以高效稳定地沉默基因表达,Wip1基因促进了U251细胞的增殖.     

转化生长因子-β1反义RNA腺病毒载体的构建

目的构建含转化生长因子β1(TGF-β1)反义RNA的重组腺病毒重组体。方法将TGF-β1的cDNA5＇端630bp片段反向插入穿梭载体pAdTraek-CMV,构建为TGF-β1反义RNA的重组体(pAdTrack-antiTGFβ1),将重组体pAdTrack-antiTGFβ1与包装质粒pAdEasy-1共转染BJ5183细菌。用选择培养基筛选同源重组的阳性克隆,同源重组的腺病毒载体转染293细胞,在荧光显微镜下观察细胞中的绿色荧光蛋白(GFP)及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果构建了含rGF-β1反义RNA的重组腺病毒,其滴度为2.4×10     

人白介素-8 shRNA慢病毒载体的构建和鉴定

目的:构建携载人白介素-8(IL-8)shRNA的慢病毒并鉴定其对MDA-MB-231细胞该基因的沉默效率。方法:设计两个IL-8基因特异性siRNA靶点,与pMagic7.1慢病毒载体质粒重组,经PCR鉴定并测序,通过293T细胞实现慢病毒包装,DNA定量试剂盒分别检测两种慢病毒滴度。将这两种慢病毒分别以最佳感染复数感染MDA-MB-231细胞,通过Real-time PCR检测IL-8沉默效率。结果:PCR鉴定阳性的shRNA重组质粒测序正确,包装后两种病毒滴度分别为1.93×109 IU/mL和1.89×109IU/mL;分别以MOI=40感染MDA-MB-231细胞后,IL-8沉默效率分别为80%和90%。结论:成功构建IL-8 shRNA慢病毒并达到较高的沉默效率,为下一步研究沉默靶基因后细胞生物学功能变化提供实验基础。     

靶向人VEGF165的SiRNA慢病毒的构建和鉴定

目的：构建靶向VEGF基因的SiRNA慢病毒载体,并包装病毒。方法：针对已经筛选确定的SiRNA有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,经双酶切后与PGC SIL-GFP慢病毒载体连接,构建慢病毒载体PGCSIL-SiVEGF,以293T细胞包装得到干扰病毒LV-SiVEGF,根据细胞表达绿色荧光蛋白水平计算病毒滴度;病毒感染人脐静脉内皮细胞HUVEC,通过定量RT-PCR检测VEGF的mRNA表达。结果：测序结果表明,靶向人VEGF的SiRNA慢病毒载体构建成功,包装后的慢病毒滴度为2×109 ifu/μl;感染HUVEC细胞后,实验组和对照组相比VEGF mRNA表达水平显著降低。结论：成功构建人VEGF SiRNA慢病毒LV-SiVEGF。     

表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体.方法 根据大鼠Cdh1基因的核苷酸序列,合成目的基因片段并亚克隆到慢病毒表达载体pGC-FU的Age I酶切位点间,命名为pGC-FU-Cdh1.对pGC-FU-Cdh1进行PCR扩增及测序鉴定.将293T细胞按完全随机法分为实验组(每组3只)及对照组(每组3只),分别将pGC-FU-Cdh1及空质粒pGC-FU以脂质体法转染至293T细胞,倒置荧光显微镜观察后,Western blot法检测Cdh1-GFP的表达情况,慢病毒载体LV-Cdh1的包装浓缩及滴度测定. 结果 重组慢病毒表达载体pGC-FU-Cdh1经PCR扩增鉴定及测序鉴定均显示有特异性基因片断,证明大鼠Cdh1基因正向插入慢病毒表达载体pGC-FU中;转染293T细胞后,Western blot法检测到实验组有外源性融合蛋白Cdh1 -GFP的表达(每组3只),对照组无Cdh1-GFP的表达(n=0)(P=0.014);慢病毒载体LV-Cdh1包装浓缩后,Reahime PCR法测定滴度为2E+8 TU/ml. 结论 成功构建表达大鼠Cdh1基因的重组质粒pGC-FU-Cdh1,并包装为慢病毒,为进一步研究Cdh1功能及基因治疗奠定了基础.     

小鼠高迁移率族蛋白B1基因短发卡RNA的构建及干扰效果检测

目的 构建有效靶向小鼠高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)基因的短发卡RNA(shRNA)载体.方法 针对小鼠HMGB1序列设计4条HMGB1干扰序列的shRNA载体:pYr-1.1-musHMGB1-sh1～4以及与哺乳动物基因组无同源性序列的shRNA作为对照(NC)组,Xho Ⅰ酶切鉴定其序列.然后利用质粒转染小鼠肝癌细胞株Hepal-6,实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测干扰效率.结果 经酶切凝胶电泳证实shRNA构建正确;质粒筛选结果表明,转染48h后,pYr-1.1-musHMGB1-sh1～4及NC组的荧光表达率为85％、78％、75％、70％、60％;FQ-PCR显示pYr-1.1-musHMGB1-sh1～4组及NC组转染Hepal-6细胞48h后相对表达量分别为0.52±0.05、0.59±0.08、0.61±0.08、0.57±0.21、1.02±0.21.结论 成功构建表达靶向HMGB1的4条shRNA重组质粒载体,其中pYr-1.1-musHMGB1-sh1质粒对HMGB1基因的抑制作用最强,为研究HMGB1的功能提供实验基础.     

神经生长因子β腺相关病毒穿梭质粒的构建和鉴定

目的构建能够表达神经生长因子β(nerve growth factorβ,NGF-β)的重组腺相关病毒(adenoassociatedvirus,AAV)穿梭质粒,为进一步包装AAV奠定基础。方法利用高保真酶分别扩增pAAV-多克隆位点(multiple cloning site,MCS)的结构元件和pGenesil-1.1的功能元件,连入T-easy载体,限制性核酸内切酶酶切并回收目的片段,DNA连接酶连接,得到含U6和CMV双启动子的重组AAV穿梭质粒pAAV-U6/CMV-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP),用该质粒转染293细胞,观察有无绿色荧光表达;培养人Miapaca-2细胞,提取总RNA,进行RT-PCR得到NGF-β基因,插入T-easy载体,得到T-easy-NGF-β;将NGF-β插入pAAV-U6/CMV-EGFP,构建NGF-β重组AAV穿梭质粒pAAV-U6/CMV-NGF-β,将该质粒送基因测序。结果双酶切pAAV-U6/CMV-EGFP可见4 250、800 bp条带,质粒转染293细胞后可见绿色荧光表达;质粒T-easy-NGF-β双酶切可见3 015、736 bp条带,测序显示基因序列正确;双酶切pAAV-U6/CMV-NGF-β可见4 250、736 bp条带;质粒pAAV-U6/CMV-NGF-β测序显示载体中的基因序列正确。结论成功构建NGF-β重组AAV穿梭质粒,为进一步深入研究脊髓损伤的基因治疗提供了实验基础。