杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达

目的：构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（alllastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin，并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法：提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA3．1（＋）中，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin。以pcDNA3．1-amastin转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光染色法和RT-PCR分别鉴定pcDNA3．1-amastin的瞬时表达和稳定表达。结果：在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光，表明pcDNA3．1-amastin成功地转入NIH3T3细胞，并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后，用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因，表明获得了稳定表达。结论：成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒，并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。     

人细胞间黏附分子-1的真核细胞表达与鉴定

目的 构建人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)真核表达载体PcDNA3.1(-)-ICAM-1,并在真核细胞COS-7中表达.方法 设计特异性引物,用PCR方法扩增ICAM-1全编码区基因片段,将其连接人真核表达载体pcDNA3.1(-),并通过酶切进行鉴定.用脂质体转染法将真核表达载体pcDNA3.1(-)-ICAM-1转染COS-7细胞,通过免疫荧光和Western印迹分析人ICAM-1蛋白在COS-7细胞中的表达情况.结果 PCR扩增得到人ICAM-1的cDNA片段大小为1800 bp,重组质粒经酶切鉴定和DNA序列分析确定得到真核表达载体peDNA3.1(-)-ICAM-1.荧光显微镜下可见转染重组质粒的COS-7细胞膜上存在荧光分布,而转染空质粒的细胞未见荧光分布.Western印迹检测发现转染重组质粒的细胞存在外源性的人ICAM-1表达,而转染空质粒的则未见ICAM-1表达.结论 成功构建了人ICAM-1真核表达载体,ICAM-1高效表达在转染的真核细胞COS-7表面,为进一步建立稳定表达ICAM-1的COS-7细胞株以及研究ICAM-1及其受体的生物学功能提供了条件.     

赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究

目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS-7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础.方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1-LipL32.脂质体转染法将重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot检测目的基因的表达.结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中获得瞬时和稳定表达.结论:赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据.     

过表达人细胞S期激酶相关蛋白2(Skp2)促进MCF-7乳腺癌细胞生长及S期细胞增加

目的构建带FLAG标签的细胞S期激酶相关蛋白2(Skp2)基因真核表达载体pc DNA3-FLAG-Skp2并检测其对MCF-7乳腺癌细胞生长及细胞周期的影响。方法采用反转录PCR从MDA-MB-231乳腺癌细胞中扩增Skp2基因,构建重组真核表达载体pc DNA3-FLAG-Skp2。酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至MCF-7乳腺癌细胞中。采用Western blot法检测FLAG-Skp2的表达,Alamar blue比色法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞周期。结果 PCR扩增片段与预期片段大小相符,测序结果与Gen Bank结果一致。Western blot结果显示质粒转染48 h后,细胞成功表达融合蛋白FLAG-Skp2。过表达Skp2的MCF-7乳腺癌细胞较对照组生长速度明显加快,S期细胞显著增多。结论成功构建人Skp2真核表达载体pc DNA3-FLAG-Skp2。过表达Skp2的MCF-7细胞生长加快,S期细胞增多。     

人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答

探索人β防御素2 (h BD- 2 )和前列腺特异性膜抗原(PSMA)共表达重组核酸疫苗针对前列腺癌的免疫治疗。研究以pc DNA3.1为载体,构建重组质粒pc DNA3.1/PSMA和pc DNA3.1/h BD- 2 - PSMA,通过RT- PCR和免疫组化检测其表达。免疫小鼠后,进行血清中抗体检测,CD4 、CD8 T淋巴细胞数目测定及CTL 特异性杀伤作用检测。结果显示构建的质粒转染COS- 7细胞后能表达目的基因,免疫小鼠后能在体内持久表达,可以诱导产生特异性抗体,能有效的刺激T细胞增生,诱导特异性CTL 反应。当以h BD- 2作为免疫佐剂时,CTL 活性更强。本研究成功的构建了含PSMA的表达质粒,免疫小鼠可以诱导出有效的体液和细胞免疫,为前列腺癌的免疫治疗奠定了一定的实验基础     

结核分枝杆菌脂蛋白G在HEK293T细胞中的表达及纯化

目的构建含结核分枝杆菌(MTB)脂蛋白G(Lpr G)基因的真核表达载体pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG,并在HEK293T细胞中表达和纯化Lpr G融合蛋白。方法以MTB H37Rv基因组DNA为模板,用PCR法扩增Lpr G基因,并通过DNA重组构建真核表达载体pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG,酶切鉴定并测序。将重组质粒转染HEK293T细胞后,应用Western blot法检测His-Lpr G-FLAG融合蛋白的表达。利用Ni-NTA金属亲和层析柱从细胞上清和细胞裂解液中纯化融合蛋白His-Lpr G-FLAG,并用SDS-PAGE和Western blot法检测纯化后的蛋白。结果成功构建了pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG的真核表达载体,Western blot结果表明转染质粒后,HEK293T细胞裂解液中检测到目的蛋白,相对分子量(Mr)为27 000。经Ni-NTA金属亲和层析柱纯化后得到高纯度的融合蛋白His-Lpr G-FLAG。结论成功构建并在HEK293T细胞中表达和纯化了His-Lpr G-FLAG融合蛋白。     

pTARGET-TCR Vβ5.2真核表达质粒的构建及表达

目的 构建含大鼠TCR Vβ5.2基因的重组真核表达质粒.方法 以RT-PCR法扩增Lewis大鼠脾脏淋巴细胞的TCR Vβ5.2基因片段,将目的基因直接克隆到真核表达载体pTARGET中,构建重组质粒pTARGET-TCR Vβ5.2.连接产物转化E.coli JM109细胞后进行蓝白斑筛选,并经菌落PCR和DNA测序进行鉴定.将重组质粒以肌注法免疫Balb/c小鼠,用RT-PCR和免疫组化方法分别检测重组质粒在注射部位的转录和表达.通过脂质体介导,将重组质粒转染COS-7细胞进行瞬时表达,用免疫细胞化学染色法检测目的基因在真核细胞内的表达.结果 测序鉴定证实,TCR Vβ5.2基因已被正确插入到pTARGET载体中,并检测到肌肉组织和COS-7细胞内目的蛋白的表达.结论 成功构建了重组真核表达质粒pTARGET-TCR Vβ5.2,为进行TCR VβDNA疫苗对胶原诱导性关节炎大鼠保护作用的研究提供了基础.     

人Plk3基因真核表达载体的构建及蛋白表达和定位

目的构建hPlk3真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法提取工具细胞Hela的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPlk3基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。然后将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Westernblot检测其表达。最后利用激光共聚焦扫描显微镜观察pEGFP-hPlk3在COS-7细胞内的定位。结果hPlk3基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为1941bp,并测序成功。Westernblot检测到了GFP-hPlk3融合蛋白表达,分子量约为98kDa。pEGFP-hPlk3在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。结论成功构建了hPlk3基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-hPlk3蛋白在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。     

人Arresten基因的真核表达及其对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的: 真核表达人Arresten蛋白，并研究其对体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖和迁移的影响。方法: 用脂质体介导，将含有人Arresten基因的重组质粒pSecTag2-AT转染COS-7细胞；应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染细胞目的基因mRNA表达；收集转染48h后上清液，浓缩后Western blotting分析检测目的蛋白的表达。用转染细胞上清液处理平滑肌细胞后,CCK-8法检测细胞增殖；Transwell小室法检测细胞迁移。结果:RT-PCR结果显示转染Arresten基因的COS-7细胞基因组中存在有目的基因特异性片段（449 bp），表明基因转染成功；Western blotting结果表明转染细胞上清液中有目的蛋白表达。细胞体外增殖分析显示Arresten蛋白可显著抑制血管平滑肌细胞的增殖作用(F=40.154,P<0.01)；Transwell小室法检测显示经对照细胞，载体DNA转染及重组质粒转染的COS-7细胞培养上清液处理的平滑肌细胞迁移数为(28.70±3.97)个、(26.10±4.53)个、(14.00±3.33)个（F=38.915,P<0.01）。结论: 真核表达的人Arresten蛋白能有效抑制体外培养的血管平滑肌细胞的增殖和迁移。     

人幽门螺杆菌外膜蛋白18000 DNA疫苗的构建及表达

目的：构建含人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H-pylori)18000外膜蛋白编码基因的真核重组载体，并在COS-7细胞中表达，为核酸疫苗的开发奠定基础。方法：从原核表达质粒pET32a( )／528中，酶切H-pylori 18000外膜蛋白编码基因片段，将目的基因与同样进行酶切、纯化的载体pcDNA3．1进行连接，而后转化并筛选含有目的基因的重组载体pcDNA3．1／528，并在COS-7细胞中表达，以RT-PCR，Western法检测其表达产物。结果：经单、双酶切证实插入的基因片段为H-pylori 18000外膜蛋白编码基因；采用RT-PCR方法，能够从转染的COS-7细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段，Western法等检测显示，该重组质粒能够在COS-7细胞中表达目的蛋白，而且具有生物活性。结论：成功地构建了核酸疫苗pcDNA3．1／528，并在COS-7细胞中表达，为H-pylori核酸疫苗的研制奠定了良好的基础。     

pcDNA3.1/hIL-18真核表达载体的构建及表达

目的 :构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并在哺乳动物细胞COS 7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达。方法 :从含hIL 18基因的中介载体 pGEM TEasy( pGEM T/hIL 18)中 ,以限制性内切酶酶切方法获得目的片段 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1( )中。以脂质体法转染COS 7和Rlc310细胞 ,用RT PCR检测IL 18mRNA的水平 ,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果 :构建了hIL 18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达 ,获得了可稳定表达hIL 18基因的Rlc310细胞株。结论 :pcDNA3.1/IL 18的构建及表达 ,为IL 18抗肿瘤作用的研究奠定了基础     

人胰岛素样生长因子1的真核细胞表达及其鉴定

目的 构建人胰岛素样生长因子１（ＩＧＦ－１）的真核细胞表达质粒。方法 用ＰＣＲ方法从人的肝细胞ｃＤＮＡ文库中克隆出ＩＧＦ－１ｃＤＮＡ,然后定向插入真核细胞表达载体ｐｃＤＮＡ３中,并用脂质体方法转染ＣＯＳ７细胞。用ＥＬＩＳＡ法和人胚肺纤维母细胞以及ＮＩＨ３Ｔ３纤维细胞增殖法分别测定转染细胞上清液中ＩＧＦ－１的含量和生物活性。结果 重组的真核细胞表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＩＧＦ－１所含的ＩＧＦ－１ｃＤＮＡ序列和插入方向均正确,其转染的ＣＯＳ７细胞分泌较高浓度的ＩＧＦ－１,并且具有明显促进纤维细胞增殖的能力。结论 本实验所构建的重组真核细胞表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＩＧＦ－１能够高效表达有活性的ＩＧＦ－１,对进一步研究ＩＧＦ－１体内表达的生理和病理作用有一定意义。     

HBsAg S与GM—CSF融合基因在L929细胞中的表达

将乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）主蛋白的编码基因Ｓ与人ＧＭ－ＣＳＦ基因融蛤 后,插入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ１中,经质粒酶切鉴定及ＤＮＡ序列分析证明,目的基因插入ｐｃＤＮＡ１的ＣＭＶ启动子下降。以获得的重组质粒ｐＳＧＭ转染Ｌ９２９细胞,经ＲＴ－ＰＣＲ及细胞原位杂交证实目的基因的转录。     

C端带Myc和多聚组氨酸双标记的重组人β-防御素-2在COS-7细胞的转染表达

本研究旨在探索建立能有效表达和分泌人类β-防御素 - 2 (h BD- 2 ) ,其表达产物又易于被检测和分离纯化的哺乳类动物细胞表达系统的可能性及技术路线。将 h BD- 2的全长 c DNA片段插入编码双重报告基因 Myc和 6个多聚组氨酸 (His)的真核表达质粒 pc DNA3.1/Myc- His(+) ,构建出 C端带 Myc和 6× His的 rpc DNA3.1/Myc-His(+) /h BD- 2。用脂质体转染法将此重组真核表达载体导入 COS- 7细胞 ,分别从 m RNA和蛋白质水平分析 h BD-2的表达情况并同步检测细胞可溶性蛋白及培养上清的抗菌活性。采用 RT- PCR法从被转染的细胞中扩增出一条约 2 4 0 bp的片段 ,其大小与预测相符。采用 Western blot法 ,用抗 His抗体检测到细胞可溶性蛋白在约 10 Kd处有强反应条带显示 ,其大小与该重组质粒结构中由 p CMV启动子驱动的基因片段有可能表达成肽链的分子量 (10 .1)相符。双层肉汤琼脂平板扩散法结果显示 :分别与正常细胞可溶性蛋白和培养上清比较 ,转染重组质粒的 COS- 7细胞的可溶性蛋白及培养上清在金黄色葡萄球菌的平板上均形成明显抑菌环。这些结果提示 :所建立的 h BD- 2哺乳类动物细胞表达系统能有效表达和分泌活性 h BD- 2。     

鼠β-防御素2(mBD2)真核表达质粒的构建及稳定表达株的鉴定

目的：对小鼠β防御素-2（mBD2）基因进行克隆,构建其真核表达载体,筛选出稳定表达细胞株,并研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤机制。方法：通过向BALB/c小鼠腹腔注射内毒素（LPS）,建立小鼠急性时相反应,取其肺组织提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增小鼠mBD2基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1（＋）真核表达载体,对其进行酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/mBD2转染SiHa细胞,采用G418进行稳定表达株的筛选,用免疫荧光染色和RT-PCR鉴定细胞内mBD2蛋白表达情况。结果：提取小鼠肺组织总RNA,采用RT-PCR方法扩增了250bp左右的产物,通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,构建了真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/mBD2。SiHa被该质粒转染后,在100mg/LG418浓度下筛选20d,得到了稳定表达mBD2的细胞株,用免疫荧光染色显示mBD2蛋白在胞质中有大量表达,RT-PCR反应扩增到了mBD2的mRNA。结论：成功地构建了pcDNA3.1（＋）/mBD2真核表达质粒,mBD2蛋白在SiHa细胞中能稳定表达,这些结果为进一步深入研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤的作用奠定了基础。     

CVB3VP1/pcDNA3真核表达质粒的构建及免疫效果观察

用ＲＴ ＰＣＲ从ＣＶＢ３ 感染细胞中扩增出ＶＰ１ 片段,重组入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３ 中,转化大肠杆菌Ｃ６００,扩增后的质粒经ＣｓＣｌ 密度梯度离心纯化,体外转染ＣＯＳ ７ 细胞,用ＳＤＳ ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测表达产物;并经胫骨前肌注射小鼠,每鼠１００μｇ／ 次,隔４ 周加强一次,共３ 次。免疫后不同时间检测抗体、淋巴细胞增殖反应等免疫指标。结果显示重组质粒体外转染真核细胞表达ＶＰ１ 蛋白,免疫小鼠后产生了特异性抗体和淋巴细胞增殖反应。表明ＣＶＢ３ ＶＰ１ ＤＮＡ疫苗获得初步有效结果。     

赖型钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL41基因真核表达质粒的构建及表达

目的：构建赖型钩端螺旋体LipL41基因的真核重组表达质粒、并对其表达进行检测。方法： 以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板PCR扩增目的基因，克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1上。测序分析后酶切，并连接至真核表达质粒pcDNA3上，构建真核重组表达质粒LipL41-pCDNA3。利用脂质体介导转染COS7细胞，提取细胞总RNA，RT-PCR检测其表达。结果： PCR扩增出1 011 bp大小的目的片段，序列分析显示它与Leptospira kirschneri的LipL41基因成熟肽序列同源性高达98%。酶切鉴定证实真核重组表达质粒LipL41-pCDNA3构建成功，RT-PCR检测显示，LipL41-pCDNA3转染组在大约1kb处出现特异的扩增带，而空质粒组无此条带。结论：LipL41的真核重组表达质粒构建成功，并可在哺乳动物细胞中表达。     

大鼠GLUT1真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的：构建大鼠葡萄糖转运体1（GLUT1）的真核表达载体。 方法： 以RT-PCR方法从大鼠脑组织中获取GLUT1全长cDNA片段，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Glut1，随后用lipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞，以RT-PCR法检测重组质粒在mRNA水平的表达，以免疫组化的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。 结果： 以构建的重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Glut1转染293细胞后，在基因及蛋白表达水平均检测到了葡萄糖转运体1的表达。 结论： 成功构建了携带大鼠葡萄糖转运体1的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Glut1，且证实其可在293细胞中成功表达目的基因，为进一步研究外源性GLUT1表达对缺血缺氧脑细胞的保护作用奠定了基础。