用重叠延伸聚合酶链反应制备鸭乙型肝炎病毒基因点突变

目的制备含鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）前核心区终止密码突变的基因片段，以对此基因突变作有关生物学研究。方法用重叠延伸聚合酶链反应（ＯＥ－ＰＣＲ）制备含此人工定向点突变的基因片段；用不对称聚合酶链反应（ａｓｙ－ＰＣＲ）制备单链ＤＮＡ模板作测序。结果凝胶电泳显示ＯＥ－ＰＣＲ产物与克隆ＤＨＢＶＤＮＡ酶切片段位置一致，测序证实该点突变存在。结论用ＯＥ－ＰＣＲ作人工定向基因突变，不需要克隆制备单链模板及筛选阳性克隆，２天内即可出结果，较传统方法简便、快速、有效。     

聚合酶链反应凝胶呈像技术检测乙型肝炎病毒

目的 建立聚合酶链反应（ＰＣＲ）－凝胶呈像（ｇｅｌｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍＧＤＳ）技术,并应用于临床检测乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）核酸ＤＮＡ。方法 用凝胶呈像技术对血清ＨＢＶ－ＤＮＡＰＣＲ扩增产物的电泳凝胶进行摄像,分析,并与紫外灯下的肉眼观察结果相比较,对肉眼未判断出阳性而凝胶呈像分析邮阳性的血清标本,用定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）方法检测ＨＢＶ－ＤＮＡ。结果 通过３８份血清标本的检测,发现     

荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒

目的用荧光定量聚合酶链反应（ＦＱＰＣＲ）方法准确地定量检测血清中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的数量和免疫指标,以指导临床。方法设计合成了ＨＢＶＦＱＰＣＲ诊断试剂盒,以一种完全闭管式的ＰＣＲ和荧光探针杂交技术相结合所产生的实时检测定量ＰＣＲ方法,检测了５３２份临床血清标本。结果经ＦＱＰＣＲ检测,１５８份ＨＢＶ的ｓ抗原、ｅ抗原、ｃ抗体（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｂ）都阳性的标本,其血清标本ＨＢＶＤＮＡ也全部阳性,平均ＨＢＶＤＮＡ拷贝数为１．１×１０８／ｍｌ;９８例ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｂ、ＨＢｃＡｂ都阳性的标本,其阳性率为７３％（７１例）,平均拷贝数为８．６×１０５／ｍｌ,而常规ＰＣＲ只有３３％的阳性率;６７例ＨＢｓＡｂ、ＨＢｅＡｂ、ＨＢｃＡｂ都阳性标本的平均拷贝数为２．３×１０５／ｍｌ。结论能够避免ＰＣＲ后处理导致的假阳性污染,并实现准确定量。ＦＱＰＣＲ可以检测ＨＢＶ的真实感染和复制情况,对于乙型肝炎的临床诊断,治疗方案的选择和疗效考察有较大的指导意义。     

聚合酶链反应凝胶呈像技术检测乙型肝炎病毒

目的建立聚合酶链反应（ＰＣＲ）凝胶呈像（ｇｅｌｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓ,ＧＤＳ）技术,并应用于临床检测乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）核酸ＤＮＡ。方法用凝胶呈像技术对血清ＨＢＶＤＮＡＰＣＲ扩增产物的电泳凝胶进行摄像、分析,并与紫外灯下的肉眼观察结果相比较,对肉眼未判断出阳性而凝胶呈像分析出阳性的血清标本,用定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）方法检测ＨＢＶＤＮＡ。结果通过３８份血清标本的检测,发现用凝胶呈像技术判断的结果比单纯肉眼观察的阳性率高。前者１９份阳性（５０％）,后者１６份阳性（４２．１％）,符合率为９２．１％。经χ２检验（χ２＝０．４７７,Ｐ＞０．０５）,说明两种方法有很好的一致性。凝胶呈像分析为阳性,而肉眼观察阴性的３份血清标本,经定量ＰＣＲ检测为阳性。结论应用凝胶呈像技术比ＰＣＲ产物电泳后紫外灯下肉眼观察的灵敏度高、客观性强,能避免与紫外线接触,并可长期保留检测结果。     

聚合酶链反应检测HBV—DNA技术的改进与应用

目的：建立一种特异、敏感、简便、快速的方法检测血清中的HBV-DNA。方法：采用以强烈蛋白变性剂异硫氰酸胍为主的裂解液与加热变性相结合的方法快速制备血清中HBV-DNA模板，直接进行聚合酶链反应（PCR），并用Southern Blot对PCR的产物刊物特异性分析。结果：对不同含量HBV-DNA的阳性血清测试结果表明本法检测水平达到10^5拷贝/ml，其敏感性与蛋白酶K消化法PCR相当，但较NP40变性法PCR及斑点法高。结论：本法操作简单，不易污染，具有较高的特异性及敏感性，值得临床推广应用。     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测方法的建立及应用

[目的]建立和应用半巢式聚合酶链反应法（PCR）检测慢性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（cccDNA）。[方法]根据HBV基因组DNA正负链上下游缺口序列，设计3个相对保守的引物，建立HBV cccDNA半套式PCR，并用该法检测96例慢性乙型肝炎患者血清中HBV cccDNA。[结果]96例慢性乙型肝炎患者中，35例HBV cccDNA阳性，阳性率为36．5％。HBV cccDNA阳性组的HBeAg、HBV DNA、ALT和AST水平均明显高于阴性组（P〈0．05），但两组的HBsAg水平无显著差异（P〉0．05）。HBV DNA≥10^5组的HBV cccDNA检出率为58．3％（35／60），明显高于HBVDNA〈10^5组（0％，0／36）（P=0．000）；HBeAg阳性组的HBV cccDNA检出率为50．9％（28／55），明显高于HBeAg阴性组（7／41，17．1％）（P=0．001）。[结论]半套式PCR方法简便，可用于测定血清中HBV cccDNA，以评价抗病毒治疗慢性乙型肝炎的疗效。     

聚合酶链反应检测再生障碍性贫血血清中乙型和丙型肝炎病毒

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测了３７例非肝炎相关再生障碍性贫血（ＮＨＡＡ）和１８例肝炎相关再生障碍性贫血（ＨＡＡ）血清中的乙型肝炎病毒ＤＮＡ（ＨＢＶＤＮＡ）、丙型肝炎病毒ＲＮＡ（ＨＣＶＲＮＡ）。结果显示：ＮＨＡＡ的ＨＢＶＤＮＡ检出率为１３．５％（５／３７），ＨＡＡ为２２．２％（４／１８），两者比较Ｐ＞０．０５。ＮＨＡＡ的ＨＣＶＲＮＡ检出率为２．７％（１／３７），ＨＡＡ为３８．９％（７／１８），两者比较Ｐ＜０．０１。丙型肝炎相关再生障碍性贫血的预后较差。提示：ＨＣＶ感染与ＨＡＡ关系密切。     

PCR酶联杂交技术检测乙型肝炎病毒聚合酶基因变异

拉米夫定是核苷类似物的代表性药物,其对慢性乙型肝炎的疗效现已得到充分的肯定。但长期应用拉米夫定可能会使HBVP基因变异,从而产生耐药性。目前已发现的耐药株中P基因变异是多位点的,但相对集中于P基因酪氨酸—蛋氨酸—天门冬氨酸—天门冬氨酸(YMDD)区域,突变为YI(异亮氨酸)DD或YV(缬氨酸)DD犤1犦。我们采用聚合酶链反应(PCR)酶联杂交技术检测YMDD变异,并对检测结果进行分析。1材料和方法1.1标本来源287例慢性乙型肝炎患者来自我院肝科门诊及病房,男237例,女50例,年龄5～68岁。均符合2000年病毒性肝炎防治方案的诊断标准。其中3…     

聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA在围产期诊断宫内感染的应用价值

目的：探讨聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA在国产期早期诊断HBV宫内感染的价值。方法：用该法测定了112例产妇母血和脐血HBV-DNA。结果：43例母血HBV-DNA阳性者中42例脐血HBV-DNA阳性，阳性率97．67％，且在判断HBV宫内感染方面比乙肝两对半指标(HBVm)更敏感。结论：测定母血HBV—DNA可作为HBV宫内感染的早期辅助诊断指标。     

聚合酶链反应检出石蜡包埋肝癌组织的乙型肝炎病毒DNA

传统免疫组织化学方法及分子杂交检测石蜡包埋肝组织乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ灵敏度低，聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法能否检测到石蜡肝癌组织中的ＨＢＶＤＮＡ报道尚不多见。为此，采用ＨＢＶ与丙型肝炎病毒二合一ＰＣＲ试剂盒对１７例肝癌患者的石蜡包埋癌组织进行了ＨＢＶＤＮＡ检测，结果７例阳性，阳性率为４１％，而８例非肝癌对照患者则均阴性。组织ＨＢＶＤＮＡ结果与血清ＨＢｓＡｇ比较显示，该试剂盒有较高的检出率及符合率。这为今后进一步研究大量保存的肝病石蜡包埋组织的ＨＢＶ感染提供了一个可靠灵敏的方法，也为研究其他病毒感染的石蜡包埋材料提供了参考。     

Detection of hepatitis B virus DNA using the polymerase chain reaction technique

The polymerase chain reaction (PCR) technique has been utilized for the detection of hepatitis B virus (HBV) DNA, and several factors related to the selection of primer pairs for the PCR amplification have been demonstrated. The sensitivity of the PCR assay was compared with that of slot-blot hybridization for detecting HBV-DNA. Analysis by the PCR technique with Southern blot hybridization provided a greater than 10(4)-fold increase in sensitivity over the slot-blot hybridization analysis. Also, a rapid and sensitive PCR method for the detection of serum HBV-DNA was developed: HBV-DNA is released from virions by incubating serum with NaOH followed by neutralization with HCl. HBV-DNA sequences are then detected by agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining after PCR amplification with successive sets of primer pairs. In testing serial samples from chimpanzees experimentally infected with HBV, HBV-DNA was detected 2-3 wk before the appearance of hepatitis surface antigen (HBsAg) and continued to be detectable for a short period after the production of antibody to HBsAg. Results from testing of human serum demonstrated that the majority of patients with HBsAg in serum had HBV-DNA as well and that some patients had HBV-DNA in serum in the absence of HBsAg.     

慢性乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA定量检测的临床意义

目的探讨慢性乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（HBV cccDNA）的临床意义。方法选取经肝组织病理学诊断的慢性乙型肝炎患者57例,其中乙型肝炎e抗原（HBeAg）阳性37例,HBeAg阴性20例;肝组织炎症轻度33例,肝组织炎症中度24例。采用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）同时定量检测其血清HBVDNA和cccDNA。结果HBeAg阳性组血清HBV cccDNA对数值和阳性率分别高于阴性组,8.1±1.3vs6.5±1.9,73.0%vs30.0%（均P〈0.01）。肝组织炎症轻度组（G1～G2）血清HBVcccDNA对数值低于中度组（G3）,7.1±0.4vs8.5±0.4（P〈0.01）。血清cccDNA与丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶呈正相关（r=0.612、0.632,均P〈0.05）。结论血清HBVcccDNA为病毒复制的标志物,与肝组织细胞损伤相关。     

PCR测定乙型肝炎病毒DNA弱阳性质控血清的适用性研究

为确定目前国内PCR测定乙型肝炎病毒 (HBV)DNA弱阳性质控血清的浓度水平 ,将已知浓度的 10倍系列稀释的 5份质控血清寄发给全国 91个临床和试剂生产厂家实验室 ,让其以室内常规方法检测 ,回报测定结果由我处统计分析。结果表明 ,目前全国PCR测定HBVDNA灵敏度不高 ,当样品HBVDNA含量低于 5× 10 5拷贝 /ml时 ,大部分实验室 (5 6 0 % )测不出来 ,不同厂家试剂对上述样品的检出差异较大。因此 ,目前国内PCR测定HBVDNA弱阳性质控血清的浓度以 10 5拷贝 /ml为宜     

慢性乙型肝炎患者肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的定量检测

目的 探讨肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV CccDNA)水平与病毒复制、肝组织损伤的关系.方法 应用荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法检测46例慢性乙型肝炎患者肝组织HBV CccDNA水平,同时检测肝组织和血清中HBV DNA、肝细胞乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)表达及肝功能.结果 将肝组织中HBVCccDNA定量水平分为低(＜104copies/mg)、中(104～106copies/mg)、高(＞106 copies/mg)3组,3组中HBsAg阳性表达差异无统计学意义,但105～106copies/mg和＞107copies/mg组HBcAg阳性表达高于＜104 copies/mg组,分别为105～106copies/mg组HBcAg表达14例(63.6%)和＞107copies/mg组7例(77.8%)vs＜104copies/mg组2例(13.3%)(P＜0.01);HBeAg阳性组肝组织中HBV CccDNA和肝组织总HBV DNA均显著高于HBeAg阴性组,分别为肝组织中HBV CccDNAHBeAg阳性组(8.72±1.94)log10 copies/mg vs HBeAg阴性组(6.54±1.56)log10 copies/mg;肝组织中HBV DNAHBeAg阳性组(7.45±1.82)1og10 copies/mg vs HBeAg阴性组(5.27±1.48)log10 copies/mg(均P＜0.01);肝组织中HBV CccDNA与肝组织总HBV DNA、血清HBV DNA呈正相关(均P＜0.05);而与肝组织炎症程度、肝纤维化程度、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)无相关性.结论 肝组织中HBV CccDNA定量能准确反映病毒复制水平,但不能将其视为肝组织损伤的标志.     

荧光定量PCR测定HBV DNA的不确定度评定与应用

目的 对荧光定量PCR（FQ-PCR）测定HBVDNA测量不确定度进行评定，并探讨其应用价值。方法 通过对FQ-PCR检测HBVDNA测量过程的分析，确定并简化测量不确定度的来源；采用不确定度A类评定方法以及不确定度B类评定方法，量化各不确定度分量；确定合成不确定度与扩展不确定度。结果 测量不确定度来源主要有：批内重复性、批间重复性和方法偏倚等因素。FQ-PCR测定HBVDNA的扩展不确定度U=0．62（k=1．96，n=2）；在各不确定度分量中，由方法偏倚导致的不确定度所占比重最大。结论 FQ-PCR测定HBVDNA引入扩展不确定度使结果具有可比性，同时可作为乙型肝炎患者抗病毒治疗疗效判断和质控物浓度选择的依据。     

Functional cure of hepatitis B requires silencing covalently closed circular and integrated hepatitis B virus DNA

Chronic hepatitis B virus (HBV) infection remains a major global health problem. Hepatitis B surface antigen (HBsAg) loss has been accepted as the definition of a functional HBV cure. Recent studies found that while covalently closed circular DNA (cccDNA) is the predominant source of HBsAg in hepatitis B e antigen–positive (HBeAg-positive) patients, integrated HBV DNA (iDNA) is the main source in HBeAg-negative patients. Consequently, achieving a functional HBV cure will require not only silencing of cccDNA but also iDNA. Assays that distinguish the source of HBsAg are needed to evaluate emerging therapies. In this issue of the JCI, Grudda et al. developed a PCR-based assay that differentiated the source of HBsAg and explored the contributing sources of HBsAg in patients on nucleos(t)ide analog antivirals. These findings provide a tool for understanding the contribution of iDNA in HBV infection and may guide therapies toward a functional HBV cure.     

Direct method for detecting small quantities of hepatitis B virus DNA in serum and plasma using the polymerase chain reaction.

Serum components inhibit DNA polymerase, thereby obviating direct detection of serum viral DNA sequences by the polymerase chain reaction (PCR). This has necessitated extraction of nucleic acid from sera before performing PCR and has resulted in loss of sensitivity. By adsorbing virus to a solid surface (microcentrifuge tubes or antibody coated microparticles) followed by proteinase K digestion, as little as three viruses per 200 microliters serum may be directly detected by PCR without nucleic acid extraction. The sensitivity is dependent on the surface area of the adsorptive surface and is increased by having antibodies on the adsorptive surface. The nucleic acid sequence of the amplified DNA fragments may be directly determined by the dideoxy method. Of 24 plasma samples from HBsAg+ volunteer blood donors, HBV DNA was detected in 7 by dot blot assay, 7 by liquid hybridization, and 9 by PCR. PCR detected DNA in every sample that was positive by another assay. Analysis of serial samples of two patients with acute self-limited hepatitis B found detectable HBsAg and pre-S2 antigenemia before HBV DNA by the PCR method. These results suggest that surface antigenemia may precede viremia during acute hepatitis.