耐甲氧西林葡萄球菌中耐氨基糖甙类基因的检测研究

目的研究该院耐甲氧西林葡萄球菌对氨基糖甙类药物耐药的相关基因型的流行情况。方法用MicroScan Auto SCAN4细菌鉴定仪对该院2002年1~12月分离的60株耐甲氧西林葡萄球菌进行鉴定,药敏试验采用K-B法;利用聚合物酶链反应(PCR)法进行aac(6′)/aph(2″)、aph(3′)-Ⅲ、ant(4′,4″)等耐药基因的检测。结果24株耐甲氧西林溶血葡萄球菌(MRSH)中检出aac(6′)/aph(2″)、aph(3′)-Ⅲ、ant(4′,4″)基因分别为21株(87.5%)、8株(33.3%)、7株(29.2%);36株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中检出aac(6′)/aph(2″)、aph(3′)-Ⅲ、ant(4′,4″)基因分别为33株(91.7%)、26株(72.2%)、3株(8.3%)。结论MRSH对氨基糖甙类抗生素的耐药机制主要是携带了aac(6′)/aph(2″)基因,表现在对庆大霉素和妥布霉素高度耐药,并与耐药表型基本相符;MRSA对氨基糖甙类抗生素的耐药机制主要是携带了aac(6′)/aph(2″)和aph(3′)-Ⅲ基因,表现在对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星高度耐药。MRSA对氨基糖甙类抗生素的耐药率比MRSH更高。MRSH和MRSA中的aph(3′)-Ⅲ、ant(4′,4″)基因检出率数据经统计软件处理,差异有统计学意义(P<0.05)。     

屎肠球菌高水平庆大霉素耐药基因研究

目的研究我国临床分离高水平庆大霉素耐药屎肠球菌中庆大霉素耐药基因分类及其水平传递情况。方法采用PCR法检测庆大霉素耐药基因aac（6’）-Ie-aph（2″）-Ia、aph（2″）-Ib、aph（2″）-Ic、aph（2″）-Id和aph（3″）-Ⅲa，采用质粒酶切图谱分析耐药菌同源性，采用液体传递和固体传递法研究庆大霉素耐药基因水平传递情况。结果105株临床分离屎肠球菌中，76．2％（80／105）为高水平庆大霉素耐药，其中aac（6′）-Ie-aph（2″）-Ia基因阳性率为95．0％（76／80），aph（3″）-Ⅲa基因阳性率为78．8％（63／80），aph（2″）-Ib、aph（2″）-Ic、aph（2″）-Id基因皆阴性。这些高水平庆大霉素耐药屎肠球菌间大多无明显同源性。21．1％（16／76）菌株携带的aac（6’）-Ie-aph（2″）-Ia基因在屎肠球菌间固体传递，13．2％（10／76）菌株携带的aac（6’）-Ie-aph（2″）-Ia基因在屎肠球菌间液体环境中水平传递。结论本次研究中屎肠球菌中高水平庆大霉素耐药主要由aac（6’）-Ie—aph（2″）-Ia和aph（3″）-Ⅲa基因介导，这些菌株间没有明显同源性，且该基因可在屎肠球菌间水平传递。     

甲氧西林耐药溶血葡萄球菌糖肽类耐药突变株体外筛选

目的：调查在体外糖肽类选择性压力下,溶血葡萄球菌对糖肽类敏感性的变化。方法：琼脂稀释法检测万古霉素、替考拉宁和苯唑西林对6株溶血葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）,连续浓度梯度法体外筛选万古霉素和替考拉宁耐药突变株。结果：6株甲氧西林耐药溶血葡萄球菌（MRSH）均筛选出替考拉宁耐药突变株（MIC=32～128μg／mL）．未筛选出万古霉素耐药突变株。万古霉素对6株替考拉宁耐药突变株仍保持较好的抗菌活性（MIC=2～4μg／mL）。结论：万古霉素对MRSH抗菌活性稳定,在抗生素压力下不易筛选出耐药株突变株,替考拉宁对MRSH抗菌活性很不稳定,在抗生素压力下极易筛选出耐药株突变株     

溶血葡萄球菌vga（A）LC基因与克林霉素耐药分析

目的调查溶血葡萄球菌vga（A）LC基因与克林霉素耐药特点。方法用琼脂稀释法测定红霉素和克林霉素对63株溶血葡萄球菌的MIC，PCR技术检测vga（A）LC及其他克林霉素耐药相关基因。结果23株受试菌对克林霉素耐药，其中2株对红霉素敏感（MIC均为0．25mg／L），对克林霉素耐药（MIC均为8mg／L），vga（A）LC基因检测均阳性；6株结构型大环内酯类-林可酰胺类-链阳菌素B类（MLSB）耐药，15株诱导型MLSB耐药，均未检出vga（A）LC基因；1株结构型MLSB耐药菌携带ermB基因，5株结构型MLSB和15株诱导型MLSB耐药菌均携带ermC基因；10株克林霉素耐药菌携带linA／linA’基因。结论我院发现携带vga（A）LC基因的溶血葡萄球菌。     

广泛耐药鲍曼不动杆菌氨基糖苷类药物获得性耐药基因研究

目的了解重症监护病房（ICU）患者分离的广泛耐药（XDR）-鲍曼小动杆菌（AB）对氨基糖苷类药物获得性耐药基因情况。方法用phoenix-100全自动细菌鉴定药物敏感性分析仪对AB进行细菌鉴定和药物敏感性试验,gyrA和parC基因扩增测序确定AB。聚合酶链反应（PCR）测定20株XDR—AB的10种氨基糖苷类修饰酶基因、6种16SrRNA甲基化酶基因和外排泵adeB基因,并用DNA测序比对。结果20株XDR—AB中,氨基糖苷类修饰酶基因aac（3）-I、aac（6’）-Ib、ant（3”）-I、aph（3’）-I检出率分别为90．0％、30．0％、95．0％、95．0％,而aac（3）-lI、aac（6’）-Iad、aac（6’）-lI、ant（2”）-I、ant（4’）-I及aph（3’）-VIa基因均未检出。armA型16SrRNA甲基化酶基因和外排泵adeB基因检出率均为100％。结论20株XDR—AB均携带rarmA和adeB基因,同时aac（3）-I、ant（3”）-I和aph（3）-I检出率较高,提示ICU分离的XDR—AB对氨基糖苷类药物高水平耐药可能与携带的耐药基因有关。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌多重耐药基因检测

目的 了解金黄色葡萄球菌（金葡菌）β内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类抗生素耐药基因的分布特点，评估耐药性基因型与表型测定法的相关性。方法 聚合酶链反应（PCR）测定本地分离100株金葡菌的β内酰胺类耐药基因mecA、氨基糖苷修饰酶基因aae（6′）／aph（2″）、aph（3′）-Ⅲ、ant（4′，4″）、大环内酯类23s rRNA甲基化酶基因erm、四环素类核糖体保护蛋白基因tetM的发生率，纸片扩散法测定苯唑西林、庆大霉素、红霉素、四环素的耐药性。结果 100株受试菌中mecA阳性66株（MRSA），最常见的耐药基因是erm＋tetM，存在于89．4％的MRSA中，最少见的是ant（4′，4″），存在于4．5％的MRSA中，MRSA的aae（6′）／aph（2″）、aph（3′）-Ⅲ、erm、tetM检出率分别为97．.％、72．7％、100％、89．4％，明显高于MSSA的11．8％、2．9％、44．1％、8．8％；66株MRSA中，43株（65．2％）同时检出aae（6′）／aph（2″）、aph（3′）-Ⅲ、erm、tetM4种基因，58株（87．9％）同时检出aae（6′）／aph（2″）、erm、tetM3种基因，34株MSSA中，仅2株（5．9％）同时检出aae（6′）／aph（2″）、erm、tetM3种基因；苯唑西林、庆大霉素、红霉素、四环素与其相应的耐药基因mecA、age（6′）／aph（2″）、erm、tetM的符合率分别为96％、99％、96％、84％，81株红霉素表型耐药菌中79株（97．5％）为大环内酯．林可霉素．链霉菌素B（MLS8）结构型耐药。结论耐药基因在金葡菌中均可检出，金葡菌对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类抗生素耐药与苯唑西林耐药紧密相关，大环内酯类主要是结构型耐药，基因型与表型测定有较高的符合率。     

纸片法头孢西丁敏感的青霉素耐药葡萄球菌分析

目的 评估不同检测方法 对纸片法头孢西丁敏感,苯唑西林耐药葡萄球菌耐药性状的检测能力,并对非mecA基因介导苯唑西林耐药的匍萄球菌进行药敏谱分析.方法 收集2007年1月至2009年5月间复旦大学附属华山医院就诊患者呼吸道、尿、分泌物和无菌体液标本中分离得到的255株金黄色葡萄球菌,采用苯唑西林纸片法、苯唑西林MIC法、头孢西丁纸片法、头孢西丁MIC法枪测金黄色葡萄球菌对苯唑西林的敏感性:用苯唑西林MIC法和头孢西丁纸片法检测75株凝固酶阴性萄萄球菌对苯唑西林的敏感性:将所有葡萄球菌进行mecA基因检测,结合试验结果 分析葡萄球菌苯唑西林耐药原因,并对非mecA基因介导的苯唑西林耐药葡萄球菌用MIC法进行抗菌药敏谱分析.结果 255株纸片法头孢西丁敏感、青霉素耐药的金黄色葡萄球菌苯唑西林纸片法检测出6株中介,4株耐药;头孢西丁纸片法、头孢西丁MIC法、苯唑西林MIC法全敏感、mecA基因检测全阴性.75株纸片法头孢西丁敏感、青霉素耐药的凝固酶阴性葡萄球菌,苯唑西林MIC法59株敏感,16株耐药;mecA基因阴性为71株,阳性为4株.12株非mecA基因介导苯唑西林耐药的葡萄球菌庆大霉素敏感为10株,克林霉素8株、环丙沙星11株、红霉素6株、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑11株,头孢菌素类、替考拉宁、万古霉素、哌拉西林/他唑巴坦、四环素12株.结论 金黄色葡萄球菌用头孢西丁检测mecA基因介导的苯唑西林耐药,具有很好的可靠性.凝固酶阴性葡萄球菌最好同时使用头孢西丁纸片法和苯唑西林MIC法检测mecA基因介导的苯唑西林耐药,以提高检出率.非mecA基因介导的苯唑西林耐药,临床可依据实际药物敏感实验结果 选择性使用β内酰胺酶稳定的青霉素、β内酰胺酶抑制剂复合药、头孢类和碳青霉烯类药物治疗.     

烧伤科患者分离金黄色葡萄球菌耐药性和耐药基因研究

目的了解烧伤科住院患者分离的金黄色葡萄球菌的耐药表型和耐药基因分布,指导临床医生合理使用抗菌药物,提高患者治愈率。方法收集2015年1―8月该院烧伤科住院患者分离的金黄色葡萄球菌,菌种鉴定及药敏试验采用法国生物梅里埃公司VITEK-2Compact系统,通过聚合酶链反应(PCR)方法分析其耐药基因mecA、TEM、ermA、ermB、ermC、tetM、tetK、ant6及aac6′/aph2′′的表达。结果 106株金黄色葡萄球菌对万古霉素、利奈唑胺、替加环素和替考拉宁的敏感率均为100.0%,对青霉素G的耐药率为99.1%,对环丙沙星、红霉素、庆大霉素、苯唑西林和利福平的耐药率较高,均大于60.0%。耐药基因的阳性率分别为mecA61.3%、TEM 30.2%、ermA 60.4%、ermB 12.3%、ermC 56.6%、tetM 76.4%、tetK 20.7%、ant6 10.4%、aac6′/aph2′′77.0%。结论烧伤患者分离的金黄色葡萄球菌对多数抗菌药物的耐药率较高,对万古霉素、利奈唑胺和替考拉宁高度敏感;耐药基因以mecA、ermA、ermC、tetM和aac6′/aph2′′为主。     

医院感染的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因分析

目的探讨医院感染的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）耐药基因的存在情况。方法对2006年6至7月临床分离的20株医院感染MRSA进行mecA、tetM、aac（6′）/aph（2″）、aph（3′）Ⅲ、ant（4′4″）耐药基因检测。结果20株MRSA检出m ecA阳性率为100%,aac（6）′/aph（2″）阳性率75%,tetM阳性率70%,aph（3′）Ⅲ阳性率40%、ant（4′4″）阳性率为20%。结论多数MRSA菌株存在耐β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类等多种抗生素耐药基因,与表型一致,表型与遗传学均支持MRSA具有耐多药特征。     

耐甲氧西林溶血葡萄球菌耐药性监测

目的了解耐甲氧西林溶血葡萄球菌（MRSH）临床分布、对常用抗菌药物的耐药状况,指导临床用药。方法用Vitek-32系统对临床分离的120株溶血葡萄球菌（SH）进行菌种鉴定和药敏实验。结果临床分离凝固酶阴性葡萄球菌中SH占35．0％（120／343）,SH中MRSH检出率为75．8％（91／120）,MRSH对万古霉素、呋喃妥因100．0％敏感,对利福平敏感性高,对其余多种抗生素耐药率高。结论MRSH所致感染日趋严重,对多种抗生素耐药,临床应加强监测,MRSH感染的抗菌治疗应首选万古霉素。     

高耐庆大霉素肠球菌多重耐药性与aac （6′）-aph（2＂）基因的相关性研究

目的 探讨aac（6′）-aph（2＂）基因与高耐庆大霉素肠球菌（high-level gentamicin-resistant Enterococcus,HLGRE）多重耐药的相关性.方法 收集8年间临床分离肠球菌,MIC法检测HLGRE及其多重耐药情况;采用PCR-RFLP法检测随机抽样的100株HLGRE和60株非HLGRE中aac（6′）-aph （2＂）基因的分布情况.结果 共分离1615株肠球菌,其中屎肠球菌879株（54.4％）,粪肠球菌631株（39.1％）,其他肠球菌105株（6.5％）;HLGRE 1132株,其中HLGRE屎肠球菌748株（66.1％）,HLGRE 粪肠球菌384株（33.9％）.各标本中分离的肠球菌以尿液中最多,占62.1％.主要分布于干疗科（15.2％）、移植科（12.0％）、肾内科（10.7％）.HLGRE屎肠球菌对奎奴普汀-达福普汀、万古霉素、替考拉宁的耐药率均为0.0％,对利奈唑胺耐药率仅为2.0％,对其他抗生素耐药率均在77.0％以上;HLGRE粪肠球菌对利奈唑胺、万古霉素、替考拉宁的耐药率均为0.0％,对青霉素、氨苄西林的耐药率低于40.0％,对四环素、庆大霉素、高浓度庆大霉素、奎奴普汀-达福普汀的耐药率均为100.0％.随机抽取的100株HLGRE中aac（6′）-aph（2＂）基因检测的阳性率为97.0％（97株）,aac（6′）-aph（2＂）基因同HLGRE有较好的相关性（r=0.6822,P＜0.05）.PCR产物经克隆测序与GeneBank的序列99％～100％一致.结论 HLGRE较非HLGRE分离率高且多重耐药现象严重.aac（6′）-aph（2＂）基因与HLGRE之间具有较好的相关性.     

In vitro susceptibility and molecular analysis of gentamicin-resistant enterococci

Enterococci with gentamicin MICs of 256 to 1,024 μg/mL were evaluated for susceptibility to ampicillin plus gentamicin synergism. Sixteen of eighteen enterococcal isolates were not susceptible to synergistic killing by ampicillin plus gentamicin; 11 possessed aac(6′)-aph(2″), and 4 possessed aph(2″)-Ic. A gentamicin MIC of 512 or 1,024 μg/mL predicted lack of ampicillin/gentamicin synergism, but a gentamicin MIC of 256 μg/mL did not. For six enterococcal strains possessing the gentamicin-resistance gene aph(2″)-Ic, ampicillin plus dibekacin, ampicillin plus netilmicin, and ampicillin plus amikacin produced synergistic killing in five, three, and two strains, respectively.     

European glycopeptide susceptibility survey of Gram-positive bacteria for 1995

In the European Glycopeptide Susceptibility Survey 7078 Gram-positive isolates collected in 1995 from 70 centers in 9 countries of Western Europe were examined, using a standardized, quantitative susceptibility testing method. Of the 7078 isolates, 6824 (96.4%) were tested by the national coordinating centers. Teicoplanin (mode MIC 0.5 μg/mL) was generally twice as active as vancomycin (mode MIC 1 μg/mL) against Staphylococcus aureus (n = 2852). All isolates were susceptible to vancomycin (MIC ≤4 μg/mL) and all but four to teicoplanin (MIC ≤8 μg/mL); these four isolates were of intermediate susceptibility (MIC 16 μg/mL). With coagulase-negative staphylococci (n = 1444), the distribution of MIC of teicoplanin was wider than for vancomycin. Two and two-tenths percent of coagulase-negative staphylococci excluding Staphylococcus haemolyticus required 16 μg/mL teicoplanin for inhibition (intermediate) and 0.4% ≥32 μg/mL (resistant). Among isolates of S. haemolyticus, 4.4% were of intermediate susceptibility (MIC 16 μg/mL) and 3.3% were resistant (MIC ≥32 μg/mL) to teicoplanin. However, this species represented only 6.3% of the isolates of coagulase-negative Staphylococcus spp. Generally, teicoplanin (mode MIC ≤0.12 μg/mL) was four to eight times more active than vancomycin (mode MIC ≤0.5 μg/mL) against the 770 streptococcal isolates. Glycopeptide-susceptible Enterococcus spp. (n = 1695) were generally four times more susceptible to teicoplanin (mode MIC 0.25 μg/mL) than to vancomycin (mode MIC 1 μg/mL). Combined vancomycin and teicoplanin (VanA phenotype) resistance was observed more frequently (9.3%) in isolates of Enterococcus faecium than in Enterococcus faecalis (0.8%). Four isolates of unspeciated enterococci (1.4%) also expressed this resistance phenotype. Four isolates of E. faecium and four of E. faecalis expressed the VanB-type (low-level, vancomycin only) resistance. Spain was the only country not to submit resistant E. faecium strains while resistant E. faecalis isolates came only from Spain and Italy.     

一种快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的评价

目的评价胶体金法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)临床应用价值。方法采用头孢西丁纸片扩散法、PCR扩增mecA基因和胶体金法对临床分离的150株金黄色葡萄球菌(100株MRSA和50株MSSA)、68株溶血葡萄球菌(58株MRSH和10株MSSH)、135株表皮葡萄球菌(97株MRSE和38株MSSE)进行检测并作比较。结果 MRSA、MSSA、MRSE、MSSE、MSSH三种方法检测结果一致。58株MRSH中6株胶体金法检测阴性。结论胶体金法可作为MRSA简便而准确的检测方法,同时也可分析MRCNS。     

甲氧西林耐药溶血性葡萄球菌的基因多态性研究

目的应用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术,对甲氧西林耐药溶血性葡萄球菌（MRSH）进行基因多态性研究。方法对81株MRSH通过RAPD技术进行扩增,电泳条带采用SPSS13.0软件分析,根据树状图分型。结果81株MRSH通过RAPD技术可产生相对固定的6条电泳带,经遗传相关系数分析后可分为8型,其中A型占70.37%,而10株血培养阳性的MRSH中有9株为A型。结论通过RAPD分型研究,可以了解MRSH基因流行型的特性,为该菌的感染控制提供分子流行病学依据。     

Correlation between the resistance genotype determined by multiplex PCR assays and the antibiotic susceptibility patterns of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis

Clinical isolates of Staphylococcus aureus (a total of 206) and S. epidermidis (a total of 188) from various countries were tested with multiplex PCR assays to detect clinically relevant antibiotic resistance genes associated with staphylococci. The targeted genes are implicated in resistance to oxacillin (mecA), gentamicin ?aac(6')-aph(2"), and erythromycin (ermA, ermB, ermC, and msrA). We found a nearly perfect correlation between genotypic and phenotypic analysis for most of these 394 strains, showing the following correlations: 98% for oxacillin resistance, 100% for gentamicin resistance, and 98.5% for erythromycin resistance. The discrepant results were (i) eight strains found to be positive by PCR for mecA or ermC but susceptible to the corresponding antibiotic based on disk diffusion and (ii) six strains of S. aureus found to be negative by PCR for mecA or for the four erythromycin resistance genes targeted but resistant to the corresponding antibiotic. In order to demonstrate in vitro that the eight susceptible strains harboring the resistance gene may become resistant, we subcultured the susceptible strains on media with increasing gradients of the antibiotic. We were able to select cells demonstrating a resistant phenotype for all of these eight strains carrying the resistance gene based on disk diffusion and MIC determinations. The four oxacillin-resistant strains negative for mecA were PCR positive for blaZ and had the phenotype of beta-lactamase hyperproducers, which could explain their borderline oxacillin resistance phenotype. The erythromycin resistance for the two strains found to be negative by PCR is probably associated with a novel mechanism. This study reiterates the usefulness of DNA-based assays for the detection of antibiotic resistance genes associated with staphylococcal infections.     

万古霉素敏感性降低临床凝固酶阴性葡萄球菌的实验室检测

目的了解中日友好医院临床甲氧西林耐药凝同酶阴性葡萄球菌（MRCNS）糖肽类耐药的情况。方法聚合酶链反应（PCR）检测MRCNS;万古霉素耐药确证试验筛选对万古霉素敏感性下降的MRCNS株,E—test试验和最低抑菌浓度（MIC）法检测其MIC及多重PCR检测van基因;脉冲场凝胶电泳（PFGE）检测万古霉素敏感性下降MRCNS株的同源性。结果297株凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）中mecA基因阳性率为89％;264株MRCNS中筛选出3株万古霉素敏感性下降溶血葡萄球菌;此3株溶血葡萄球菌未检出van基因;PFGE结果显示此3株溶血葡萄球菌没有同源性。结论万古霉素敏感性下降MRCNS的实验室检测和医院感染监测对预防和控制其传播非常重要。