LRP16基因启动子的克隆及荧光素酶报道重组子的构建

目的：克隆LRP16基因启动子及构建LRP16基因启动子－pGL3-Basic载体。方法：（1）以LRP16基因全长作为探针，在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载LRP16基因5′端3kb基因组DNA序列。（2）以健康献血员基因组DNA为模板进行PCR扩增目的片段，将分离纯化的PCR产物用T4DNA连接酶与pGEM-T Easy载体相连，转入JM109感受态化大肠杆菌，筛选阳性克隆并测序，进行Kpn I和BamH I双酶切和巢式PCR鉴定。（3）将LRP16启动子－pGEM-T Easy载体再次酶切，纯化回收鉴定过的目的DNA片段，构建LRP16基因启动子－pGL3-Basic载体。结果与结论：长度为2．7kb的LRP16基因启动子克隆成功，并构建了LRP16基因启动子－pGL3-Basic载体。充分利用因特网上人类基因组数据库的生物信息资源，搜索已知基因的启动子序列，可实现快速、经济和准确地克隆已知基因启动子分子和构建启动子载体的目的。     

小鼠固醇载体蛋白2原核表达载体的构建与表达纯化

目的 构建小鼠固醇载体蛋白2(SCP-2)融合蛋白表达载体,并在原核细胞内表达及纯化获得具有活性的融合蛋白,为进一步研究SCP-2的生物学功能提供基础.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增得到鼠SCP-2编码序列,然后将该编码序列克隆到带有His标记的载体pET14b上,重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性,然后切取分子量正确的条带用SDS-PAGE及质谱技术进行鉴定.结果 重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定证明载体构建正确.融合蛋白表达纯化后获得了分子量约59kD的融合蛋白,符合预期大小,并经质谱分析证明该融合蛋白的表达正确.结论 成功构建了带His标签的SCP-2原核表达载体,并成功表达及纯化出该融合蛋白,为深入研究SCP-2的相关生物学功能提供了一个重要的工具.     

小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建小鼠RelB基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默骨髓树突细胞(DC)的RelB基因表达,为构建骨髓致耐受DC用于自身免疫病的防治提供研究基础.方法 利用Invitrogen公司在线软件设计小鼠RelB基因(NM_009046)shRNA序列,合成、退火形成dsoligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序,得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,转化stbl3感受态细胞,测序鉴定,在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和RelB基因重组慢病毒载体导入293FT细胞,包装成病毒后,收集病毒上清,采用系列稀释法测定病毒滴度.结果 测序结果显示pENTRTM/U6-RelB-shRNA为阳性克隆,将该阳性重组载体与慢病毒载体重组,转化,氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,U6前引物测序鉴定,测序结果 显示该重组慢病毒载体也为阳性克隆,在293FT细胞中进行病毒包装,收集上清并在-80℃贮存.系列稀释法检测病毒悬液的滴度为6×105TU/ml.结论 成功构建出小鼠RelB基因shRNA慢病毒RNAi表达载体,为制备致耐受DC和研究DC在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体.     

小鼠膜联蛋白A1真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建小鼠膜联蛋白A1(annexin-A1,ANXA1)真核表达载体,并检测其在NIH3T3细胞中的表达和定位.方法 采用PCR法从小鼠肝cDNA文库扩增ANXA1基因编码序列,并将其克隆至带有血凝素(HA)标记的真核表达载体pcDNA3-HA上,经PCR、酶切和测序鉴定后,将重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1瞬时转染NIH3T3细胞,采用细胞免疫荧光法检测目的 基因表达情况.结果 菌液PCR、双酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1构建正确,并可在NIH3T3细胞的胞质、胞核和胞膜中广泛表达.结论 成功构建了pcDNA3-HA-ANXA1真核表达载体,该载体中的HA-ANXA1融合基因能在哺乳动物中有效表达并正确定位,为下一步深入研究ANXAl相关的信号通路奠定了基础.     

基因打靶技术研究及其应用

基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的新技术,是一种利用DNA同源重组原理和胚胎干细胞（embryonic stem ceils,ESCs）技术按定向组合的方式改变生物活体遗传信息的实验手段,具有定位性强、打靶后新的基因随染色体DNA稳定遗传的特点,其方法包括基因敲除、基因敲人、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等,相关的基因工程技术包括转基因、基因沉默和基因捕获等。基因打靶技术为生命科学、基因组学和疾病治疗等领域的研究提供了强大的工具。     

长型LRP16基因真核表达载体的构建及在HL60细胞中的表达

目的：构建长型LRP16基因开放阅读框架序列的真核表达载体，并观察其在髓系白血病细胞系HL60细胞中的表达情况。方法：采用RT-PCR方法自1例健康献血员外周血单个核细胞中克隆长型LRP16 cDNA；将长型LRP16 cDNA克隆入pGEM-T载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定；将鉴定过的DNA片段插入真核质粒pcDNA3．1( )，构建真核表达载体pcDNA-LLRP16；脂质体介导法将其转染m60细胞，培养72h后用RT-PCR方法检测转染细胞中长型LRP16基因的表达情况。结果与结论：酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人长型LRP16基因序列；转染实验表明LRP16基因能在HL60细胞中过表达，为进一步研究长型LRP16基因功能奠定了基础。     

辐射诱导表达载体pEgr-p16的构建及其体外蛋白表达的研究

目的构建辐射诱导表达载体pEgr—p16并研究其体外稳定转染联合^60Co．γ射线照射对人宫颈癌HeLa细胞p16蛋白表达变化的影响。方法利用双酶切、粘端连接的方法构建了含有辐射诱导特性的早期生长反应因子Egr-1和p16的pEgr—p16的质粒载体，以脂质体介导的方法，将重组载体导入人HeLa细胞，采用免疫细胞化学和流式细胞术的方法检测照射转染后的HeLa细胞p16蛋白表达的变化。结果经全自动测序证明辐射诱导表达载体pEgr—p16构建正确；稳定转染可见有明显的p16表达增强；5Gy以内p16蛋白表达呈剂量依赖性的增加，在2Gy照射后2hp16蛋白表达水平即开始增高，4h达到最高，12h趋于正常水平。结论本研究成功构建了辐射诱导表达载体pEgr-p16，在HeLa细胞中蛋白表达明显增强。     

小鼠ATP酶β亚单位真核表达载体的构建和细胞内定位研究

目的构建小鼠ATP酶β亚单位(ATPaseβ)真核表达载体,并观察其在哺乳动物细胞中的表达定位情况。方法取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到ATPaseβ编码序列,将其连接到pMD18-T载体上,然后以pMD18-ATPaseβ为模板扩增得到ATPaseβ编码序列,再将其克隆到真核表达载体pcDNA3/HA上。采用脂质体转染法转染NIH 3T3细胞及293细胞,在荧光显微镜下观察结果。结果 PCR、双酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3/HA-ATPaseβ构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要定位于细胞质,细胞膜上也有表达,而在293细胞中只表达于细胞质。结论成功构建了带有HA标签的小鼠ATPaseβ真核表达载体,该载体能够在哺乳动物NIH 3T3及293细胞中有效表达并正确定位,为进一步研究ATPaseβ的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

携带人FIt3—Iigand基因逆转录病毒载体的构建及其在小鼠骨？…

Ｆｌｔ3ｌｉｇａｎｄ(ＦＬ)是近年来新发现的一种细胞因子,属于Ｉ型穿膜糖蛋白,具有膜结合型和分泌型两种不同的表达形式。ＦＬ与ＩＬ3、ＩＬ6、ＳＣＦ及ＧＭＣＳＦ等细胞因子协同刺激造血干/祖细胞增殖,因而在造血干/祖细胞的体外培养中获得了广泛应用。ＦＬ及ＧＣＳＦ协同作用能够动员造血干/祖细胞进入外周血,另外,ＦＬ还具有抗肿瘤的作用。人和小鼠ＦＬ基因在基因组中的结构十分相似,它们在核酸水平上有76%的相似性,在氨基酸水平上有72%的相似性。人ＦＬ可作用于小鼠细胞,产生与小鼠ＦＬ相同的生物学效应。为了研究ＦＬ在造血过程中的作…     

MARCH1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建MARCH1真核表达载体并进行鉴定和纯化,为研究MARCH1在小鼠树突细胞(DCs)中的生物学作用奠定基础.方法 从小鼠尾部提取cDNA作为模板,采用特异的引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增MARCH1cDNA片段,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,连接于载体pMB-HA质粒上,构建重组载体,经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果,转化大肠埃希菌DH5α感受态菌、筛选阳性克隆、抽提质粒并进行纯化.结果 PCR获得与预期大小一致(约3900bp)的cDNA片段,成功构建重组载体pMB-HA-MARCH1,双酶切及测序鉴定证实MARCH1 cDNA片段正确插入该真核表达载体中.结论 成功构建含有MARCH1的真核表达载体,为进一步研究提供了实验基础.     

LRP16基因在肺癌中的表达及其临床意义

目的研究肺癌组织中LRP16基因的蛋白表达水平及其临床病理意义。方法收集54例原发型肺癌患者手术切除的新鲜组织标本和部分临床病理资料,用Westernblot方法检测肿瘤组织及癌旁正常肺组织中LRP16蛋白的表达水平,并分析其与临床病理资料间的联系。以肿瘤组织LRP16蛋白的表达较癌旁正常肺组织高2倍为LRP16过表达的标准。结果54例肺癌标本中有15例LRP16过表达,过表达率约27.8%(15/54)。23例肺腺癌中有11例(47.8%)LRP16过表达,27例肺鳞癌中有4例(14.8%)LRP16过表达,二者比较差异显著(P<0.05)。在2例大细胞癌和2例小细胞癌中,LRP16均呈极低表达或未表达。肿瘤直径>3cm的10例仅2例(20.0%)LRP16过表达,直径=3cm的44例中有13例(29.5%)LRP16过表达,二者比较无显著性差异(P>0.05)。有肺门或(及)纵隔淋巴结转移的20例中有10例(50.0%)LRP16过表达,而无转移的34例中仅5例(14.7%)LRP16过表达,二者比较差异显著(P<0.05)。结论LRP16基因在肺腺癌组与鳞癌组、有淋巴结转移组与无淋巴结转移组表达均有较大差异,提示其不仅是一个肺癌相关基因,而且可能与肺癌的分子分期相关。     

LRP16基因抗紫外线DNA损伤作用的研究

目的根据基因编码序列推测其氨基酸序列，预测LRP16基因编码蛋白的功能并通过实验加以证实。方法利用GeneBank数据库获取LRP16基因序列，然后推测出该基因编码蛋白质的一级结构，对该序列蛋白结构域的同源性进行搜索；将LRP16基因ORF插入pcDNA3．1，构建LRP16基因的真核表达质粒，采用Superfect稳定转染急性粒细胞白血病细胞系HL-60，筛选稳定表达LRP16基因的细胞；以紫外灯照射筛选后有HL-60稳定过表达的HL-60细胞和对照细胞；采用单细胞凝胶电泳技术检测有LRPl6过表达对HL-60细胞增殖及DNA损伤后修复的影响。结果在LRPl6基因理论蛋白序列的第148至315氨基酸残基之间具有与人类组蛋白H2A1C末端相类似的同源序列hismacro、COG2110和A1PP，同源性高达80％以上。LRP16基因的过表达具有抗紫外线引起HL-60细胞DNA损伤和增强损伤后的修复作用。结论LRP16基因编码蛋白可能具有抗紫外线的DNA损伤作用。     

新的白血病相关基因LRP15真核表达载体构建及在K562细胞中的表达

 目的构建LRP15基因开放阅读框架(ORF)序列的真核表达载体,并观察其在K562细胞中的表达情况.方法采用RT-PCR方法自1例白血病患者中克隆LRP15cDNA片段,将目的基因LRP15克隆入pGEM-T载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定.将鉴定过的DNA片段插入真核质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA-LRP15.脂质体介导法将其转染K562细胞,72 h以RT-PCR方法检测转染细胞中LRP15基因的表达情况.结果酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有人LRP15基因ORF序列;转染实验表明LR15基因能在K562细胞中表达.结论成功构建LRP15基因真核表达载体,并在K562细胞中获得表达,为进一步研究LRP15基因的功能奠定了基础.     

新基因LRP15的功能预测及其编码蛋白定位

目的：确定白血病复发相关新基因LRP15编码蛋白的亚细胞定位，利用生物信息学探索网上预测基因功能的新方法。方法：以人类基因组资源(HGR)数据库为基础，进行LRPl5启动子区特征分析。在Prosite数据库中进行有生物学意义的保守性氨基酸修饰位点搜索。通过RPS-BLAST程序预测其蛋白质结构及功能。以增强绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因，利用激光共聚焦显微镜等实验方法验证生物信息学的分析结果。结果：LRP15编码蛋白含有cAMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点及酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，其N端有一个富含亮氨酸重复序列，定位于细胞核内。结论：生物信息学是预测基因功能的有效方法；利用EGFP可以将LRPl5蛋白定位于细胞核内；LRPl5基因可能是一个参与细胞发育调控的新基因。     

小鼠Islet-1基因RNAi慢病毒载体的构建

目的构建高效沉默小鼠Islet-1基因的慢病毒载体。方法针对小鼠Islet-1基因设计3个RNAi靶序列,合成相应的短发卡RNA(shRNA)寡核苷酸序列(oligo):Sh1、Sh2、Sh3,分别插入经酶切后的PLVTHM载体。经PCR和测序方法筛选阳性克隆,抽提阳性克隆质粒经大肠埃希菌扩增后,与其辅助包装质粒共同感染293T细胞制备慢病毒载体,利用斑形成试验测定病毒滴度。感染C3H10T1/2细胞株,以流式细胞仪检测其感染效率、荧光定量PCR检测其干扰效率。结果与正常C3H10T1/2细胞比较,测序及PCR结果显示目的片段插入正确;病毒滴度值为3.87×108TU/ml;慢病毒载体对C3H10T1/2细胞感染效率达90.36%;3个靶点(抑制效率分别为76.8%5、5.1%和11.7%)均有干扰效果,与正常细胞比较,Sh1靶点干扰效果最为显著(76.8%,P<0.05)。结论成功构建高效沉默Islet-1基因慢病毒载体。     

新基因LRP15参与紫外线诱导的DNA损伤的修复作用

目的探讨LRP15基因在K562细胞中对紫外线诱导的DNA损伤的修复作用，以进一步研究该基因的功能。方法利用真核表达质粒pcDNA3．1构建LRP15基因开放阅读框架（ORF）序列的正义及反义重组质粒；两种质粒经阳性脂质体介导法分别转染K562细胞，G418筛选阳性克隆；采用单细胞凝胶电泳（SCGE）技术观察两组细胞对紫外线诱导的DNA损伤的修复作用的差异。结果PCR鉴定证实，正义及反义重组质粒中LRP15基因ORF序列均按预定方向正确插入；SCGE实验表明，经紫外线照射后两组细胞的DNA基础损伤无明显差异（P=0.156）。但经45及90min修复后实验组细胞的DNA迁移长度明显小于对照细胞（P〈0．001）。结论成功构建LRP15基因的正义及反义真核表达质粒；LRP15基因对紫外线诱导的DNA损伤具有修复作用，可能是一个DNA修复基因。     

Sp1介导雌激素上调LRP16基因表达的研究

目的：研究Sp1在雌激素上调LRP16基因表达中的作用。方法：采用ERd，Sp1特异性单抗对雌激素作用不同时间点的MCF-7细胞进行染色质免疫共沉淀，snPCR扩增沉淀DNA上LRP16基因启动子区；化学合成Sp1小干扰RNA，与ps10荧光素酶报告重组子共转染MCF-7细胞，双荧光素酶测定法检测Sp1—SiRNA对LRP16基因表达的抑制作用。结果与结论：染色质免疫共沉淀结果提示Sp1蛋白直接结合于LRP基因-213bp至-24bp区域，雌激素激活的ERa增强其与DNA的结合力上调LRP16基因表达；应用Sp1小干扰RNA有效抑制了LRP16基因的雌激素反应性，明确了Sp1所结合的DNA顺式元件，从反面证实了Sp1蛋白对LRP16基因启动子区域递呈E2转激活活性的增强效应。