人COX-2基因反义真核表达载体对胃癌转移的影响

目的：在成功构建人COX-2基因反义真核表达载体的基础上,研究COX-2基因对人胃癌细胞株SGC-7901转移能力的影响。方法：实验分为COX-2基因反义真核表达载体转染的人胃癌细胞株SGC-7901转染组、COX-2抑制剂SC236处理组（SGC-7901细胞培养基内含100μmol/L SC236）和对照组（SGC-7901细胞）,并分别采用细胞体外侵袭实验,内皮细胞体外迁移实验,观察各组细胞体外转移的情况。采用裸鼠皮下移植瘤抑制实验,用转染和未转染的SGC-7901细胞按每毫升5×10~7个的细胞悬液分别注射于BALB/C-nu/nu无胸腺裸鼠背部皮下,SC236处理组按3mg/（kg·d）剂量于接种SCC-7901细胞10min后,由尾静脉注射,隔日1次。各组6周后处死动物,观察皮下移植瘤的生长情况。并用Western blot法检测各组细胞VEGF及MMP-2蛋白的表达。结果：体外侵袭实验、促内皮细胞体外迁移实验结果显示,与对照组相比,转染组和SC236处理组迁移的肿瘤细胞和内皮细胞均减少（P〈0.01）;裸鼠皮下移植抑制实验结果显示,转染组和SC236处理组荷瘤鼠移植瘤的生长受到抑制;Western blot结果显示,转染组和SC236处理组细胞VEGF及MMP-2蛋白的表达下降。结论：反义COX-2基因能抑制SCG-7901细胞的转移能力,其机制可能与其抑制肿瘤的血管生成、减少MMP-2的表达有关。     

Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 为了特异封闭白血病细胞survivin的表达，抑制其功能，本实验构建了survivin反义核酸载体并导入白血病细胞系中。方法 应用RT—PCR获得survivin的cDNA片段，反向插入pcDNA3质粒载体中；经限制性酶切和测序鉴定所构建的反义核酸是否正确；采用电转染方法将重组体导入HL—60细胞中；RT—PCR技术检测转染细胞survivin表达的变化。结果 经限制性酶切和测序鉴定证明survivin反义核酸已成功构建；RT—PCR产物电泳结果显示，与转染前细胞、空质粒转染细胞相比，转染survivin反义核酸的细胞survivin mRNA水平明显降低。结论 本实验已成功建立了survivin反义核酸真核表达载体，而且在白血病细胞系中发挥了特异封闭作用，为进一步研究survivin反义核酸在白血病治疗中的作用提供了实验基础。     

NS-398对人胃癌细胞系SGC-7901增殖、凋亡和COX-2表达的影响

目的 探讨环氧合酶-2(COX-2)抑制剂NS-398对人胃癌细胞系SGC-7901增殖、凋亡及COX-2表达的影响,并进一步探讨其作用的可能机制.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测NS-398对SGC -7901细胞的杀伤抑制作用;免疫细胞化学法检测SGC-7901细胞内COX-2的蛋白表达情况;ELISA法检测NS-398作用于SGC-7901细胞后PGE2释放水平;流式细胞仪检测SGC-7901细胞的凋亡情况.结果 NS-398对胃癌SGC-7901细胞具有较强的抑制作用,且这种抑制作用随浓度和时间的增加而增强,呈剂量-时间双效应关系(P＜0.05);不同浓度NS-398作用下的SGC-7901细胞中,COX-2的表达明显减弱,且呈剂量梯度下降(P＜ 0.05);NS-398可抑制PGE2释放,并且这种抑制作用呈剂量效应关系,与对照组相比差异有统计学意义(P＜ 0.05);NS-398作用于SGC-7901细胞48 h后,细胞凋亡率升高,且呈剂量效应(P＜0.05).结论 NS-398通过COX-2依赖途径抑制SGC-7901细胞增殖并促进其凋亡.     

Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

恶性肿瘤无限增殖的主要原因是细胞凋亡调控障碍.Survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein,IAP)成员[1],特异性表达人类多种常见肿瘤中,而不存在于正常成人组织,能抑制caspase活性而发挥抗凋亡作用[2].有研究表明[3-4],应用反义策略阻断survivin表达可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,诱导凋亡的发生,已成为肿瘤治疗的新亮点.     

NHE1 基因调控细胞内酸碱平衡对SGC-7901胃癌细胞增殖和凋亡的影响

 Na⁺-H⁺交换泵第一亚型(Na⁺-H⁺ exchanger 1,NHE1)是存在于所有真核细胞的一种跨膜蛋白,是调节细胞内pH值(intracellular pH,pHi),中性或偏碱性的重要膜蛋白 [1,2].近来发现NHE1基因在肿瘤细胞中的活性明显增高,与肿瘤细胞的生长有着密切的关系 [3].为了解NHE1基因在胃癌细胞中的作用,我们利用基因转染技术,构建NHE1反义真核表达载体,将NHE1反义基因转染入SGC-7901胃癌细胞,观察NHE1反义基因对SGC-7901胃癌细胞增殖和凋亡的影响.     

舒林酸、尼美舒利对人胃癌SGC-7901 细胞增殖及COX-2 、NF-κB 表达的抑制作用

 目的 探讨舒林酸、尼美舒利对人胃癌SGC-7901细胞增殖及COX-2、NF-κB表达的影响. 方法 对人胃癌SGC-7901细胞采用细胞培养,MTT法检测不同浓度舒林酸、尼美舒利对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制作用,免疫组化、western blot方法检测药物对COX-2、NF-κB表达的影响. 结果 舒林酸、尼美舒利可以抑制人胃癌SGC-7901细胞生长并具有浓度、时间依赖性;与阴性对照组相比,药物作用48h后尼美舒利100、200μmol/L组,舒林酸0.6、1.2mmol/L组COX-2、NF-κB蛋白表达明显减弱并具有剂量依赖性（P＜0.05）,COX-2、NF-κB之间正相关（P＜0.05）. 结论 舒林酸、尼美舒利可以抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖,抑制NF-κB, COX-2的蛋白表达在二者抑制肿瘤机制中可能具有一定作用.     

NHE1基因调探细胞内酸碱平衡对SGC-7901胃癌细胞增殖和凋亡的影响

0 引言 Na+-H+交换泵第一亚型(Na+-H+ exchanger 1,NHE1)是存在于所有真核细胞的一种跨膜蛋白,是调节细胞内pH值(intracellular pH,pHi),中性或偏碱性的重要膜蛋白 [1,2].近来发现NHE1基因在肿瘤细胞中的活性明显增高,与肿瘤细胞的生长有着密切的关系 [3].为了解NHE1基因在胃癌细胞中的作用,我们利用基因转染技术,构建NHE1反义真核表达载体,将NHE1反义基因转染入SGC-7901胃癌细胞,观察NHE1反义基因对SGC-7901胃癌细胞增殖和凋亡的影响.     

COX-2反义寡核苷酸对胰腺癌PC-3细胞株COX-2 mRNA和蛋白表达的影响

目的探讨环氧合酶(COX)-2反义寡核苷酸(ODNs)对胰腺癌PC-3细胞株COX-2 mRNA和蛋白表达的影响,并进一步阐明COX-2反义ODNs基因治疗胰腺癌的可行性.方法设计和合成COX-2反义ODNs,体外转染胰腺癌PC-3细胞,然后通过荧光显微镜、RT-PCR及Western blotting证实转染效果. 结果转染COX-2反义ODNs后,PC-3细胞COX-2 mRNA和蛋白表达均下降,且体现出一定的剂量和时间依赖性关系. 结论 COX-2反义ODNs转染胰腺癌PC-3细胞株后,可下调细胞中COX-2 mRNA和蛋白表达,COX-2反义ODNs有可能达到胰腺癌基因治疗的效果.     

RT-PCR构建人甲胎蛋白全长基因真核表达载体

目的采用反转录PCR(RT—PCR)构建人甲胎蛋白(Alpha—Fetoprotein，AFP)全长基因真核表达载体，为下一步应用以AFP蛋白为靶点的基因治疗作准备。方法体外培养人肝癌细胞HepG2，Trizol裂解细胞，提取总mRNA。设计含有特定酶切位点BglⅡ，SalⅠ和真核启动元件Kozak序列的RT—PCT正反向引物，采用RT—PCR法克隆AFP全长cDNA，使用BglⅡ SalⅠ双酶切载体pEGFP—C3载体和AFP cDNA，将AFP cDNA连接载体pEGFP—C3，构建新的真核表达载体，命名为pEGFP—AFP。结果通过测序证明pEGFP—AFP真核表达载体含有AFP全长基因：结论：本研究成功构建人甲胎蛋白基因真核表达载体pEGFP—AFP，为进一步的分子试验和基因治疗打下了基础。     

小鼠DOC-1R反义重组载体的构建及表达的研究

背景与目的：DOC－1R（deleted in oral cancer-1 related）基因是一个候选的抑癌基因,它与CDK2特异性结合后,抑制CDK2与cyclin形成复合物,进而对细胞周期进行调控。本研究拟构建DOC－1R反义重组质粒,并研究该基因表达受到抑制后对正常细胞增殖产生的影响。方法：小鼠DOC－1R基因筛选后构建pcDNA3-DOC-1R反义重组质粒,经细胞转染,通过细胞增殖能力测定、软琼脂培养观察DOC－1R对细胞生长状态的影响。结果：小鼠DOC－1R基因转染的NIH3T3细胞较空载体转染的细胞生长速度有较明显的差异。正义重组体pcDNA3-DOC-1R^ 可明显抑制细胞增殖,而反义重组体pcDNA3-DOC-1R^-则促进细胞的增殖。在软琼脂培养中,正义重组体在软琼脂培养基中成集落能力下降,一方面克隆形成率下降,另一方面形成的集落也普遍较小;而反义重组体明显增加了成集落能力,克隆形成率也较正义重组体有明显的增加。结论：小鼠DOC－1R基因可明显抑制细胞的生长速度和成集落能力,这一作用有助于进行正常细胞生长、增殖规律和肿瘤治疗、预防方面的研究。     

人NHE1 反义基因转染对SGC-7901 胃癌细胞增殖和凋亡的影响

 目的 探讨人NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞株增殖和凋亡的影响，探索胃癌治疗的新方法。方法 采用脂质体法将构建好的人NHE1基因反义真核表达栽体转染至SGC-7901胃癌细胞中，比较观察细胞转染前后生长曲线、双层软琼脂克隆形成能力、裸鼠成瘤能力以及细胞周期和细胞凋亡率的变化。结果 NHE1反义基因能使SGC-7901胃癌细胞生长速度减慢，双层软琼脂集落形成能力、体外生长增殖能力降低，细胞凋亡率增加，裸鼠体内成瘤能力显著降低。结论 反义NHE1基因能抑制SGC-7901胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，具有良好的胃癌治疗效果，提示NHE1基因可成为胃癌治疗的新靶点，具有一定的临床应用前景。     

人乳头瘤病毒16型E6/E7基因shRNA真核表达载体构建及其对人宫颈癌SiHa细胞增殖及迁移能力的影响

目的 构建针对人乳头瘤病毒16型E6/E7基因的shRNA真核表达载体,获得稳定表达干扰质粒的人宫颈癌SiHa细胞系并探讨其对SiHa细胞增殖及迁移能力的影响。方法 合成3条特异性干扰HPV16 E6/E7基因的shRNA片段并定向插入psilencer 2.1-U6 hygro载体,构建重组质粒psilencer 2.1-U6hygro-shE6/E7并转染入人宫颈癌SiHa细胞, Real- time PCR检测转染后细胞E6/E7 mRNA的表达,选择沉默效应最好的重组质粒并用潮霉素B稳筛,获得稳定表达重组质粒的SiHa细胞,并用real time-PCR和Western blot方法进行鉴定;分别运用CCK-8细胞增殖实验和细胞划痕愈合实验检测细胞的增殖及迁移能力。结果　测序证实针对HPV16 E6/E7的shRNA真核表达载体psilencer 2.1-U6 hygro-shE6/E7构建正确;转染psilencer 2.1-U6 hygro-shE6/E7的SiHa细胞HPV16 E6/E7表达明显受抑,同时其增殖及迁移能力也明显受抑制。结论 psilencer 2.1-U6 hygro-shE6/E7真核表达载体的成功构建并获得稳定沉默表达HPV16 E6/E7的人宫颈癌SiHa细胞系,证实沉默表达HPV16 E6/E7的SiHa细胞增殖及迁移能力会明显受到抑制,这为进一步研究HPV 16 E6/E7基因在宫颈癌发生发展过程中的功能奠定了实验基础。     

Survivin基因真核表达载体的构建及其在cos-7中的表达

[目的]克隆人survivin基因并在真核细胞中表达。[方法]以人喉癌组织中提取总RNA为模版，采用反转录聚合酶链RT-PCR法获得survivin cDNA。将该基因克隆到pcDNA3．0载体中，构建真核细胞表达载体pcDNA3．0／survivin，将测序正确的survivin基因通过脂质体介导下转染cos-7,Westem blot检测survivin蛋白在cos-7中表达。[结果]DNA测序证明获得了survivin基因，其序列与GeneBank中报道序列完全一致。Western blot检测survivin蛋白获得高效表达，其相对分子质量为16．5kD。[结论]Survivin基因的克隆和表达均获得了成功，为进一步探讨survivin基因在喉癌诊治中应用奠定了基础。     

Construction and Expression of an Eukaryotic Expression Vector Containing the IER3 Gene

Background: More and more research indicate that the immediately early response gene 3 (IER3) is involvedinmany biological provesses, such as apoptosis and immunoreaction, as well as viral infection, tumorigenesisand tumour progression. Methods: Here we describe the construction of an eukaryotic expression vectorcontaining IER3 gene and its expression in A549 cells as assessed through fluorescence microscopyand Westernblotting.Results: Fluorescence detection displayed that GFP in cytoplasm was high during 48 and 72 hourspost-transfection. In addition, Western blotting showed significant increase in IER3 gene expression in thetransfected cells compared with controls. Conclusion: The recombinate plasmid expression vector was constructedsuccessfully, which may provide a basis for further exploration of function of IER3 in lung cancer.     

pVAX-iNOS真核表达载体的构建及其抗肺癌作用研究

背景与目的 iNOS与NO介导的抗肿瘤效应有关.本研究旨在构建pVAX-iNOS载体并转染A549肺癌细胞,检测其基因的表达并初步探讨iNOS基因表达增高后对A549肺癌细胞的抗肿瘤作用.方法 应用RT-PCR方法扩增人iNOS编码序列的CDS片段,构建pVAX-iNOS载体后转染肺癌A549细胞,通过RT-PCR和Western blot方法检测目的基因的表达;采用MTT法、Hoechst 3235染色和划痕实验分别检测iNOS高表达在体外对肺癌A549细胞增殖、凋亡和迁移作用的影响.结果 真核表达质粒载体pVAX-iNOS构建成功,iNOS蛋白在转染后的A549细胞中表达升高.pVAX-iNOS转染A549肺癌细胞后能明显诱导细胞发生凋亡并抑制肿瘤细胞的生长和迁移.结论 本研究成功构建pVAX-iNOS真核表达质粒,高表达iNOS能明显抑制A549细胞的增殖、迁移并促进细胞发生凋亡.本研究有望为临床治疗肺癌提供一个新的有效策略.     

HSU17714基因反义重组质粒的构建及其对人大肠癌细胞生长的影响

我所应用减式杂交方法筛选人大肠癌负相关基因,得到一与已知基因同源性仅50％的cDNA片段,已作为新发现的基因被NCBI收录入国际基因库,我们将此cDNA片段反向克隆至非整合型哺乳动物表达载体pREP9的多克隆位点中,构建了HSU17714基因的反义RNA表达载体,并籍脂质体将之导入人结肠癌SW1116细胞中,双层软琼脂集落培养试验、流式细胞技术分析及MTT比色法等结果分别提示转染该重组体的肠癌细胞的非锚着依赖性生长能力、增殖周期活性和细胞生长速度均受到不同程度的抑制,说明外源重组体pREP9 HSU17714(AS)对肠癌SW1116细胞的生长具有抑制作用。     

Analysis of the Biological Function of ELDF15 Using an Antisense Recombinant Expression Vector

ELDF15, homologous with AT2 receptor-interaction protein 1 (ATIP1), may play an important role in celldifferentiation, proliferation, and carcinogenesis. We aimed to understand the biological function of ELDF15 viaconstruction and transfection of a recombinant expression vector containing antisense ELDF15. Recombinantexpression vectors were successfully constructed and transfected into K562 cells. A stable transfectant, knownas pXJ41-asELDF15, stably produced antisense ELDF15. Compared with K562 and K562-zeo cells, K562-pXJ41-asELDF15 cells showed inhibition of cell proliferation. RT-PCR analysis showed that the expression andprotein level of ELDF15 decreased significantly in K562 cells transfected with pXJ41-asELDF15. Expressionof hemoglobin increased in K562 cells transfected with pXJ41-asELDF15 by benzidine staining. increases NBTreduction activity in K562 cells transfected with pXJ41-asELDF15.Colony forming efficiency in two-layer softagar was clearly inhibited as assessed by electron microscopy. These results suggest that ELDF15 plays a potentialrole in cell differentiation, proliferation and carcinogenesis.     

基因CGI-100真核表达载体的构建及其对K562细胞增殖的影响

目的 构建CGI-100基因的真核表达载体并初步探讨其功能.方法 采用DNA重组技术,将CGI-100基因亚克隆至pIRES2-EGFP真核表达质粒中,重组为pIRES2-EGFP- CGI-100,脂质体转染K562细胞,RT-PCR检测目的 基因CGI-100的表达,采用体外培养技术,通过pIRES2EGFP- CGI-100质粒转染K562细胞前后的生长曲线.结果 pIRES2-EGFP- CGI-100在K562细胞中获得表达,对细胞增殖速度有明显影响.结论 CGI-100表达产物可能是1个与K562细胞增殖有关的功能蛋白质,CGI-100基因可能是1个具有生物学功能的白血病未知基因.