PCR试验污染原因分析与对策

PCR反应具有较大扩增能力与极高的灵敏性的特点,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生。1污染原因1.1标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污     

预防PCR检测中的污染初探

作为一种新的检测技术，PCR具有其它传统方法无与伦比的优点：灵敏度高、特异性强、操作简便等。也存在着严重的不足，极微量的污染即可导致假阳性结果。因此，PCR污染问题已引起人们极大的关注，如何防止PCR污染已成为整个实验成功的关键，现就我院PCR实验室二年来采取的预防污染办法介绍如下：PCR检测过程中的污染来源有三：一是标本间的交叉污染；二是实验室中克隆质粒的污染；三是扩增产物的污染，其中以第三种为最主要，因此冠以“残留污染”（Carryover）。PCR污染可能来自标本处理过程中所伴随的阳性质粒，通过空气和气溶胶…     

真菌PCR中的污染问题

近年来从临床标本中扩增真菌DNA的技术已经成功地建立。有五个欧州的研究机构,联合对真菌PCR中由气溶胶和试剂携带污染的危险性和频度作了分析。发现在150次PCR实验中有12次,共2800价标本被真菌污染（3．3％的阴性对照在提取DNA时被污染;4．7％在PCR扩增过程中被污染）,其污染的真菌种类有：烟曲霉菌、酿酒酵母菌以及支顶孢属菌。进一步分析表明,像酵解酶粉或10倍浓缩的缓衡液等市售产品中,可能也含有真菌DNA。总之,如果注意操作,真菌PCR中的污染危险性并不会比其他PCR诊断更高的。真菌PCR中的污染问题…     

防止PCR裂解管盖在沸浴中溅开的方法

聚合酶链反应 ( PCR)技术在基因诊断中以灵敏、特异、快速和简便等特点而被临床实验室广泛应用 ,其存在的最主要的问题是扩增产物的污染和交叉污染等带来结果的假阳性或假阴性。在模板 DNA提取过程中 ,有关键的一步 :标本加裂解液混匀后置 1 0 0°C沸水浴 1 0 min。本实验室在工作中发现 ,按说明书直接将裂解管置 1 0 0°C沸浴过程中 ,有的裂解管盖会突然溅开 (因空气热胀所致 ) ,造成实验室内空气污染和交叉污染 ,且裂解管内很易进入沸水 ,导致实验结果错误。随摸索防止管盖溅开的办法 ,经多次试验 ,已能有效地防止这种情况的发生 ,推…     

聚合酶链反应中污染环节的分析

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,该技术通过重复94℃～95℃变性、37℃～55℃复性、72℃延伸等简单的3个温度,能将靶DNA扩增数百万倍,获得极高的检测敏感性,操作者稍不注意就会造成污染,极微量的污染便可导致假阳性结果,现分别对污染和如何判断污染及污染源的追踪等3个部分进行阐述。1污染为了使读者重视操作堆积化及其重要性,我们将PCR整体绘制成PCR污染示意图,并分别叙述各区的相互关系,图中分为4个区,即污染1区、清洁区、污染2区、交叉污染区等。见图1。     

荧光定量聚合酶链反应直接检测血清中乙型肝炎病毒核酸方法的建立及评价

荧光定量聚合酶链式反应 (FQ PCR)技术灵敏度高 ,速度快[1,2 ] ,已被临床广泛应用。然而 ,尽管该方法采用尿嘧啶糖基酶 (UNG)等防交叉污染措施 ,但由于进行核酸提取时 ,用的是非封闭式人工操作 ,很难实现真正意义上的零污染 (避免假阳性 )。此外 ,在各种核酸纯化方法过程中 ,也很难避免对靶核酸的破坏和丢失 (避免假阴性 )。而将标本直接作PCR定性检测[3 ,4] (如克隆筛选 ) ,则存在共存物可能干扰扩增产物的检测等问题。本研究建立一种运用FQ PCR技术直接检测血清中乙型肝炎病毒DNA含量的方法 (简称“直接FQ PCR”) ,免去了核酸部…     

同型半胱氨酸对腺苷脱氨酶试剂交叉污染的影响观察

目的观察同型半胱氨酸(Hcy)对腺苷脱氨酶试剂交叉污染的影响。方法 350份静脉血经过离心处理后采用全自动生化分析仪、Hcy检测试剂盒(循环酶法)、腺苷脱氨酶(ADA)测定试剂盒(酶比色法)进行检测。比较两种仪器对质控样本和患者标本的检测结果。比较两种仪器对质控样本和患者标本的检测结果,分析、比较交叉污染前后患者标本腺苷脱氨酶试剂空白吸光度;分析比较患者标本交叉污染前后腺苷脱氨酶的检测情况,根据试剂说明书分析导致试剂交叉污染的组份。结果 ADVIA2400的检测结果明显高于AU400,差异有统计学意义(P0.05),意味着试剂存在交叉污染。未发生交叉污染的腺苷脱氨酶试剂在10d的观察期中,未见空白吸光度≥0.2,而发生交叉污染的腺苷脱氨酶试剂在观察期第7d,空白吸光度已0.2。加入试剂1+样本后,交叉污染前后第7点吸光度相当,差异无统计学意义(P0.05);但加入试剂2后,交叉污染前后第22点的吸光度差异显著,交叉污染后的数值大于交叉污染前,比较差异具有统计学意义(P0.05),提示交叉污染可能来源。Hcy试剂盒试剂2中含有5.0KU/L腺苷脱氨酶,按设定顺序检测腺苷脱氨酶试剂时,Hcy试剂中的腺苷脱氨酶致使质控样本和患者标本腺苷脱氨酶含量升高,试剂空白吸光度升高。结论在涉及Hcy试剂、腺苷脱氨酶试剂的检测中应注意控制检测顺序,以避免交叉污染。     

氧化酶法测定血清葡萄糖对无机离子测定结果的影响

生化分析由于仪器长期使用致其冲洗能力下降、比色皿老化后吸附力增加、分析项目次序安排不当等因素的影响,均可造成试剂间的交叉污染而致测定结果偏高或偏低。我们最近发现血清钾(丙酮酸激酶法)和磷测定结果异常偏高,复查后又恢复正常。经排查,发现是试剂交叉污染所致。报道如     

探寻BeekmanLX20全自动生化分析仪试剂交叉污染原因及清洁保养措施

在我们的实验过程中可能有许多问题而不被发现或被一种倾向所掩盖,这是误差误诊的定时炸弹。就交叉污染而言就是我们生化检验中的一项重要课题。是误差误诊非常重要的一个环节。在手工、半自动操作的年代,我们曾进行过标本加样交叉污杂,比色杯污染给试验带来的误差探讨。如今我们采用的先进仪器还应考虑试剂之间交叉污染的状况,同时考虑随着仪器使用时间的累加,仪器性能情况的下降,仪器的不同零部件使用寿命不一样,只有把各方面因素考虑比较周全,采取了有效的办法,才能确保我们所做检验项目的准确性,为临床提供可靠的医疗依据,在此谈几点交叉污染引起的深思和处理意见。     

微波固相吸附法制备临床标本中DNA和RNA

众所周知,PCR技术的应用是当今生物学研究领域的热点。将PCR用于感染性疾病的临床诊断,使医学微生物检验技术产生了新的飞跃。然而,如何保证PCR免受临床样品多样性、复杂性的影响,而获得准确的诊断结果乃是国内外同行正在致力解决的难题。对于临床标本处理好坏的结果是保证PCR质量的前提和基础。采用经典的酚-氯仿方法从临床标本中提取核酸,操作复杂费时,且增加标本间的交叉污染的机会。因此,简化PCR模板制备,探讨一种适用于临床诊断的简便和高效的核酸提取方法具有实际意义。本文根据文献报道建立并改进了微波固相吸附法快速提取核酸…     

日立7150型生化自动分析仪中携带污染的实验观察

我科新近购进的日立7150型全自动生化分析仪，在使用过程中发现个别项目的结果不稳定，是否存在着携带污染的情况。为了弄清携带污染的环节和程度，我们从仪器加样，加试剂及反应杯等的携带污染进行试验。现报告如下：1材料和方法1．1仪器日立7150全自动生化分析仪，200μl半自动加样枪。1．2试剂上海长征试剂，台湾元生试剂。1．3血清采用每日常观测定中病人低值和高值血清．日立7150随机的混和血清（批号109054）。1．4测定参数按各试剂盒说明书而设定的常规检测参数。1．5携带污染率计算公式假设取一份标本．连续测定三次（if，iZ，i3）…     

Wipe Test在HLA组织配型实验室污染监测及预防管理中的应用

目的建立人类白细胞抗原(HLA)组织配型实验室常规DNA污染监测试验体系,预防和消除可能会干扰检测准确性的PCR产物或基因组DNA的污染。方法设计含多种阴阳性对照和各关键监测点的完整反应链,针对HLA-Ⅰ类和Ⅱ类基因扩增区域内的非多态区进行引物特异性PCR,琼脂糖凝胶电泳测定扩增产物;对被污染监测点进行局部灭活处理后对相应监测点重新采样进行灭活验证;同时采取不定期抽查监测与定期全面监测相结合的方式确保实验过程零污染。结果灭活处理及整改后,所监测HLA基因分型实验过程中的核酸抽提区、PCR加样区、PCR扩增区、下游产物处理区4个区域的主要监测点污染监测结果均合格。结论该研究建立的以Wipe Test为核心的DNA防污染监测实验体系能够有效监测和灭活验证可能会干扰检测准确性的PCR产物或基因组DNA的污染,是HLA组织配型实验室质量控制管理程序的重要组成部分。     

关于试剂间交叉污染的探讨

目的 在使用日立7060全自动生化分析仪检测病人标本时，由于可能存在项目间的交叉污染，从而影响检测结果的可靠性。因此有必要通过本实验对可能存在的项目间的交叉污染进行确认，采取相应措施以最大限度避免污染。原理：污染发生的环节主要分为两类。（1）试剂针和搅拌针的污染；（2）比色杯的污染。方法 要消除这两个环节的污染，可以采取两种措施。（1）合理安排检测项目的顺序，在有交叉污染的检测项目中间插入一个或两个非污染项目：（2）使用生化分析仪的试剂针、比色杯清洗程序对试剂针、比色杯进行多次清洗。结果 P对UA、TG、CRE有污染现象。结论 设定用水多次清洗程序后，UA，TG的污染被解除，CRE的污染也得到了很大的改善。     

微波固相吸附法制备临床标本中DNA和RNA

众所周知,PCR技术的应用是当今生物学研究领域的热点.将PCR用于感染性疾病的临床诊断,使医学微生物检验技术产生了新的飞跃.然而,如何保证PCR免受临床样品多样性、复杂性的影响,而获得准确的诊断结果乃是国内外同行正在致力解决的难题.对于临床标本处理好坏的结果是保证PCR质量的前提和基础.采用经典的酚-氯仿方法从临床标本中提取核酸,操作复杂费时,且增加标本间的交叉污染的机会.因此,简化PCR模板制备,探讨一种适用于临床诊断的简便和高效的核酸提取方法具有实际意义.本文根据文献报道建立并改进了微波固相吸附法快速提取核酸(DNA和RNA)的方法.     

几种试剂对镁MTB法自动分析的影响

全自动生化分析仪由于使用同一根针吸取试剂,可能造成试剂间的交叉污染而影响检测结果.为此,我们观察了Trig、ALP、CO2等试剂对镁MBT法测定的影响,结果报告如下.     

利用标准曲线斜率与截距对HBV DNA荧光定量PCR实施质量监控

目前普遍采用TaqMan外标技术对HBVDNA进行荧光定量,其结果受模板浓度及扩增反应体系的批间差异影响。本文应用HBVDNA荧光定量PCR试剂标准曲线的斜率与截距对其实施质量监控,取得了满意的结果。1　材料与方法1 1　试剂与仪器　HBVDNA荧光定量试剂盒为深圳匹基公司产品;LihgtCycler荧光定量PCR仪为瑞士Roche公司产品。1 2　标本　HBVDNA阳性标本为本院门诊和住院的乙型病毒性肝炎病人血清。1 3　方法　用聚乙二醇沉淀、表面活性剂裂解方式提取样本DNA模板,在Roche专用毛细管中分别加入18μl的扩增反应液和2 μl的模板提取液或…     

Beckman CX4生化分析仪交叉污染主要原因及保养措施

目的了解已使用一段时间的Beckman CX4生化分析仪测定时出现交叉污染的主要原因，并采取有针对性的保养措施。方法通过使用双蒸水作为测定标本，了解Beckman CX4生化分析仪使用时交叉污染情况，通过观察吸光度变化．了解交叉污染的主要原因，确定采取有针对性的保养措施。结果通过观察，发现该生化分析仪在加样环节存在较大的交叉污染．及时更换加样侧搅拌棒，交叉污染情况明显好转。结论通过观察不同环节吸光度变化。可以了解比色杯、试剂加样、标本加样等环节存在的交叉污染情况，采取有针对性的保养措施，有效降低交叉污染。     

磷试剂对酶法测定尿酸有携带污染

生化分析仪在长期使用过程中其冲洗能力下降,比色皿老化后吸附功力增加,检测项目次序安排不当等因素的影响,均可造成试剂间的交叉污染而致测定结果偏高或偏低。我科新购一批磷试剂,在仪器上把磷的测定设置在紧靠尿酸测定的前面,结果发现尿酸测定结果明显偏低。当在仪器上改变测     

三酰甘油测定结果空白吸光度高的处理

BECKMAN CX 5CE全自动生化分析仪系美国BECKMAN-COULTER公司产品,共有24个通道,因试剂种类较多,如果仪器维护保养不彻底,或者仪器的机械位置不正常,均可能引起不同试剂间的交叉污染,或者不同标本间的交叉污染。笔者在实际工作中就有遇到因交叉污染引起三酰甘油测定结果空白吸光     

β2-微球蛋白试剂对尿素测定结果的干扰及排除方法

目的探讨尿素测定结果的干扰因素及解决方法。方法将患者标本和高、低浓度的质控血清按单独测定、先测β2-微球蛋白接着测尿素、启用仪器防止交叉污染的程序、调整试剂位置4种方式进行实验,并把怀疑产生交叉污染的试剂当作尿素标本测定。结果β2-微球蛋白的试剂2中含有73．58mmol／L的氨（NH3）,因试剂之间的交叉污染对尿素测定结果产生正干扰。结论自动化分析仪随着使用时间的累加,交叉污染在所难免,应引起高度重视。可启用仪器的防交叉污染程序或调整试剂位置来排除干扰。