结核分支杆菌耐喹诺酮分子机制的研究

目的了解结核分支杆菌耐喹诺酮药物的分子机制，建立快速的药敏的方法。方法通过16S rRNA聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR—SSCP)技术分析77株分支杆菌临床分离株；通过PCR—SSCP和直接测序技术(PCR—DS)分析结核分支杆菌的gyrA基因突变的情况。结果75株为结核分支杆菌复合群。以结核分支杆菌标准菌株H37Rv和卡介苗为对照．30株喹诺酮敏感株的gyrA基因的SSCP图谱均泳动正常，测序分析与对照株相同。45株耐喹诺酮的菌株中，34株(75．6％)gyrA基因SSCP图谱泳动异常；测序证实10株为90位密码子的突变，24株为94位密码子突变，所有gyrA突变株的氧氟沙星4μg／ml≤MICs≤32vg／ml，左氧氟沙星2μg／ml≤MICs≤16vg／ml。结论gyrA基因突变，尤其90位和94位密码子突变是结核分支杆菌耐喹诺酮的主要分子机制，PCR—SSCP可能成为测定部分结核分支杆菌喹诺酮耐药基因型的简便、快速的方法，并有望直接用于临床标本喹诺酮敏感性试验。     

单管半套式PCR-SSCP用于结核分支杆菌rpoB基因突变的研究

目的 ①证明单管半套式聚合酶链反应(PCR)是检测结核分支杆菌的特异性方法;②研究结核分支杆菌rpoB基因突变与利福平耐药性的关系。方法 设计三条针对结核分支杆菌的特异性引物,采用单管半套式PCR-单链构象多态性(SSCP)方法对结核分支杆菌、其它分支杆菌和富含GC碱基的细菌进行分析。结果 ①结核分支杆菌标准菌株H_(37)Rv和55株临床分离株均扩增出一条193bp片段,其特异性为100％,敏感性约为10pgDNA;15株非结核分支杆菌和8株富含GC的细菌均未得到扩增;②55株结核分支杆菌临床分离株193bp扩增片段SSCP图谱特点:以H_(37)Rv为对照,15株利福平敏感株均无区别;40株耐药株除6株外其余34株SSCP图谱有明显区别,检测阳性率为85％。结论 单管半套式PCR检测结核分支杆菌简便、敏感、特异,结合SSCP可检出耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变,此突变与利福平耐药关系密切。     

结核分支杆菌耐药基因检测结果分析

目的 分析肺结核患者结核分支杆菌获得性耐药情况,比较两种耐药性检测方法的检测效果.方法 用药敏试验(绝对浓度法)检测结核分支杆菌株对利福平(RFP)、异烟肼(INH)、链霉素(SM)、吡嗪酰胺(PZA)和乙胺丁醇(EMB)的耐药情况,采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测结核分支杆菌耐药rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变.结果:400例肺结核耐药患者常规药敏试验耐药316例(79.8%);耐药基因检测耐药株288株,突变率72.0%.RFP耐药例数和耐药率明显高于SM、PZA和EMB(耐药例数:F=2.45,2.56,2.69,P＜0.05;耐药率:F=2.55,2.66,2.79,P＜0.05),rpoB突变株和突变率明显高于katG、rpsL、pncA和embB(突变株:F=2.28,2.46,3.19,3.33,P＜0.05～0.01;突变率:F=2.36,2.61,3.25,3.45,P＜0.05～0.01),高浓度药物耐药菌株的突变株和突变率显著高于低浓度药物耐药菌株,随着不规律用药时间的延长,耐药率和突变率均逐渐上升(耐药率:F=2.77,2.88,P＜0.05;突变率:F=2.72,2.85,P＜0.05).结论 PCR-SSCP是一种快速检测结核杆菌rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变敏感、特异的方法.     

结核分支杆菌耐乙胺丁醇分离株embB基因测序

目的 探讨结核分支杆菌对乙胺丁醇(EMB)产生耐药性的分子机制，建立直接快速检测结核分支杆菌EMB药物敏感性的实验方法。方法 采用PCR扩增技术对5株耐乙胺丁醇结核分支杆菌进行PCR扩增，扩增产物经纯化后，直接在ABI 377型全自动测序仪上进行DNA测序分析。结果 5株EMB耐药株的embB基因测序有4株发现点突变，其中Met(ATG)→Lle(ATA)1例，Met(ATG)→Lle(ATC)1例，Met(ATC)→Lle(ATT)1例，Met(ATG)→Val(GTG)1例，另外1株EMB耐药株的embB基因测序未发现突变位点。结论 embB 306位氨基酸Met被置换是结核分支杆菌对乙胺丁醇产生耐药性的重要机制，测序分析可确认耐药基因的突变位点，是快速检测耐乙胺丁醇结核菌的有效方法。     

结核病临床分离株及痰标本中embB基因型的快速测定

目的建立快速测定结核病耐乙胺丁醇(EMB)分离株和痰标本中结核分枝杆菌EMB耐药基因型的方法，以期为患者提供及时、有效地化验结果。方法应用16S rDNA聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)和PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)对11株耐EMB分离株和46例结核病痰标本进行分子菌种鉴定和embB基因突变的部位与性质分析。结果以结核分枝杆菌H37Rv标准株为对照，11株耐EMB分离株和46例临床痰标本经16S rDNA PCR-SSCP分析电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同；限制性内切酶NlaⅢ消化embB基因扩增产物显示，11株耐EMB分离株中4株(36．4％)不被NlaⅡ消化；46例结核病痰标本中10例(21．7％)不被NlaⅡ消化。结论部分结核分枝杆菌耐EMB是由于embB基因突变所致。采用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法可直接快速测定结核病耐EMB分离株和痰标本中结核分枝杆菌耐EMB基因型。     

结核分枝杆菌katG和inhA基因突变的研究

为了解结核分枝杆菌耐异烟肼（ＩＮＨ）分离株ｋａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列的突变情况，探讨其在ＩＮＨ耐药性中的可能作用。应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＰＣＲ－单链构象多态性（ＳＳＣＰ）方法对６２株结核分枝杆菌临床分离株的ｋａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列进行分析。ＰＣＲ分析结果显示：ｋａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列的敏感性为１～１０ｐｇＤＮＡ；其引物ＰＣＲ扩增都具有较高的特异性。以Ｈ３７Ｒｖ标准株为对照，１３株敏感株中，１２株ｋａｔＧ基因扩增产物ＳＳＣＰ泳动正常，１株ｋａｔＧ异常；２４株耐非ＩＮＨ抗结核药物株中，８株ｋａｔＧＳＳＣＰ异常；上述２７株的ｉｎｈＡ调节序列ＳＳＣＰ均泳动正常。２５株耐ＩＮＨ株中，３株ｋａｔＧ基因ＰＣＲ扩增阴性，２２株ｋａｔＧ扩增阳性，其中１６株ＳＳＣＰ泳动异常；４株ｉｎｈＡ调节序列ＳＳＣＰ泳动异常，其ｋａｔＧ基因ＳＳＣＰ也异常。结果表明，某些结核分枝杆菌ＩＮＨ耐药性可能是由于其ｋａｔＧ基因完全缺失、ｋａｔＧ基因或ｉｎｈＡ调节序列突变所致，但某些菌株也可能与其无关，是其它耐药基因所致或存在多种机制，尚需进一步探讨。     

江门市1994年—1999年结核分支杆菌初始耐药性观察

目的 了解江门市1994年－1999年结核分支杆菌初始耐药性。方法 采用绝对浓度法进行4种抗结核药物的耐药性测定。结果 耐SM、INH、EMB和RFP率由1994年的19．4％、15．3％、15．3％、13．3％和6．1％下降至1999年的10．9％、8．6％、7．0％和4．7％;总耐药率由25．5％下降至14．1％;耐1种药、2种药、3种药和4种药的耐药率分别由9．2％、7．1％、6．1％和3．1％降至4．7％、3．9％、3．1％和2．3％;同时耐INH和RFP率,1994年为4．1％,1999年为3．1％。结论 江门市结核分支杆菌初始耐药性6年来呈下降趋势,但耐多菌株仍占一定比例。     

结核分支杆菌耐药结果分析

结核病是国家重点控制的传染病之一,尤其是耐多药结核病的出现已成为结核病疫情上升和难以控制的一个重要原因。随着结核病的蔓延,人们越来越重视其治疗,了解和掌握结核分支杆菌的耐药性是保证治愈结核病的一个关键问题,而实验室的药物敏感性试验数据给临床提供了有力的证据,对治疗结核病,治愈结核患者起着重要的作用。     

结核分支杆菌rpoB基因突变与耐利福平的临床应用

目的：研究结核分支杆菌耐利福平（RFP）分离株rpoB基因突变情况并评价其应用价值。方法：采用聚合酶链反应一单链构象多态性（PCR—SSCP）方法对355株结核分支杆菌临床分离株（其中敏感株109株，耐RFP或含耐RFP株246株）rpoB基因进行检测，并对其中17株耐药株用双氧末端终止法进行测序分析。结果：以结核分支杆菌H37RV为对照，109株药物敏感株的rpoB基因均无突变，特异性100％；246株耐药株中，225株rpoB基因SSCP图谱异常，其敏感性91．5％。17株耐药株（其中SSCP异常11株，正常6株）PCR扩增产物经测序证实，11株在531位密码子TCG-TTG，4株在526位密码子CAC-TAC，1株在516位密码子GAC—GTC，1株未改变。结论：rpoB基因突变是耐RFP结核分支杆菌耐药性的主要分子机制；其最常见的突变位点是531位色氨酸和526位组氨酸，应用PCR—SSCP技术可快速检测结核分支杆菌对RFP的耐药性。     

结核分支杆菌耐药基因的杂交检测

目的采用PCR-反向斑点杂交检测结核分支杆菌中rpoB基因、KatG基因和rpsL基因突变。评价该方法检测结核分支杆菌利福平（RFP）、异烟肼（INH）和链霉素耐药性,探讨直接检测结核患者痰标本的可行性。方法用PCR-反向斑点杂交技术分析对75株临床分离株和45例肺结核患者涂阳痰标本进行rpoB、rpsL和KatG基因突变的检测。结果临床耐药株分离株进行rpoB、rpsL和KatG基因突变的检测,其突变率分别为83.9%、62.5%、57.1%。肺结核患者涂阳痰标本中耐药株突变率分别为81.0%、60.0%、52.9%。结论rpoB基因、KatG基因和rpsL基因突变与结核分支杆菌耐利福平、异烟肼和链霉素密切相关,应用PCR-反向斑点杂交技术可快速检测结核分支杆菌对异烟肼、链霉素和利福平耐药性。PCR-反向斑点杂交技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一。     

结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分子机制的研究

目的　了解结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分子机制 ,建立快速分子药敏试验方法。方法　通过聚合酶链反应 (PCR) -单链构象多态性 (SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性 (RFL P)和 PCR-直接测序 (DS)技术分析 10 7株结核分枝杆菌临床分离株 emb B基因。结果　以 H3 7Rv标准株为对照 ,10 7株结核分枝杆菌临床分离株的 16 S r DNA SSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准相同。 38株药物敏感株的 emb B基因、SSCP均泳动正常 ,RFL P和 DS分析与对照株相同。 6 9株耐乙胺丁醇 (EMB)分离株中 ,2 5株 (36 .2 % ) emb B基因 SSCP泳动异常 ;8株 RFL P分析异常 ;DS分析 2 5株均为 30 6位密码子突变 ,其中 1株合并有 2 74位 CGC→ CCC突变 ,其 EMB MICs均≥ 2 0 μg/ml;8株为 30 6位 ATG→ATA或 ATT突变 ,17株为 ATG→GTG或 CTG突变 ,后者 EMB MICs均≥ 30μg/ml。结论　部分结核分枝杆菌耐乙胺丁醇是由于其 emb B基因 (尤其是 30 6位密码子 )突变所致 ,PCR- SSCP技术可能成为测定部分结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因型的简便、快速的方法     

幽门螺杆菌PCR—RFLP分型的研究

目的：建立幽门螺杆菌PCR检测及RFLP分型方法。方法：用PCR扩增幽门螺杆菌（HP）尿素酶C基因，扩增产物用HindⅢ酶切分析。结果：35株HP分为4种酶切谱型：I型19株（54％），Ⅱ型11株（31％），Ⅲ型4株（11％），Ⅳ型1株（3％）。结论：该方法重复性好，分辨力高，可有效地对HP作出鉴定并将其分型。对HP感染的传染源、传播途径及复发原因的探讨具有重要意义。     

A family study of compound variants of flavin-containing monooxygenase 3 (FMO3) in Japanese subjects found by urinary phenotyping for trimethylaminuria

Phenotype–gene analyses and the increasing availability of mega-databases have revealed the impaired human flavin-containing monooxygenase 3 (FMO3) variants associated with the metabolic disorder trimethylaminuria. In this study, a novel compound variant of FMO3, p.[(Val58Ile; Tyr229His)], was identified in a 1-year-old Japanese girl who had impaired FMO3 metabolic capacity (70%) in terms of urinary trimethylamine N-oxide excretion levels divided by total levels of trimethylamine and its N-oxide. One cousin in the family had the same p.[(Val58Ile); (Tyr229His)]; [(Glu158Lys; Glu308Gly)] FMO3 haplotype and had a similar FMO3 metabolic capacity (69%). In a family study, the novel p.[(Val58Ile); (Tyr229His)] compound FMO3 variant was also detected in the proband 1's mother and aunt. Another novel compound FMO3 variant p.[(Glu158Lys; Met260Lys; Glu308Gly; Ile426Thr)] was identified in a 7-year-old girl, proband 2. This novel compound FMO3 variant was inherited from her mother. Recombinant FMO3 Val58Ile; Tyr229His variant and Glu158Lys; Met260Lys; Glu308Gly; Ile426Thr variant showed moderately decreased capacities for trimethylamine N-oxygenation compared to wild-type FMO3. Analysis of trimethylaminuria phenotypes in family studies has revealed compound missense FMO3 variants that impair FMO3-mediated N-oxygenation in Japanese subjects; moreover, these variants could result in modified drug clearances.     

结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG点突变的快速检测

目的：探讨快速检测结核分枝杆菌异烟肼（INH）耐药基因型的分子药敏方法。方法：用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测了30株INH敏感菌株及30株耐药株的katG基因，随后用SSCP方法鉴定扩增产物有无突变，以结核分枝杆菌H37Rv作对照。结果：所有INH敏感株均观察到katG基因扩增产物，30株INH耐药株中28株观察到katG基因扩增产物。以H37Rv标准株为对照，30株敏感株SSCP带谱与对照相同；28株INH耐药株中13株与对照相同，15株有不同程度的差异。与药敏试验比较，PCR－SSCP检测INH耐药结核菌的敏感性为57%，特异性为100％。结论：多数结核分枝杆菌耐INH是由于katG基因突变所致，用PCR－SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分枝杆菌INH耐药基因型的目的。     

鲍曼不动杆菌及其耐药基因的检测

目的：探索一种检测鲍曼不动杆菌及其耐药基因的新方法。方法首先对近几年医院内鲍曼不动杆菌的耐药情况进行分析,选择临床上治疗鲍曼不动杆菌的首选药,再采用聚合酶链反应对鲍曼不动杆菌及其突变株进行检测。结果鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率最低,为9.37%,OXA-51基因扩增结果与细菌培养相符,OXA-23基因扩增与鲍曼不动杆菌耐亚胺培南的结果相符。结论采用PCR法对OXA-51基因扩增可以检测是否存在鲍曼不动杆菌,采用PCR法对OXA-23基因扩增可以检测鲍曼不动杆菌是否存在亚胺培南耐药性。从而快速检测鲍曼不动杆菌及其耐药基因,指导临床用药。     

复合PCR-膜芯片技术对结核分枝杆菌链霉素耐药性的快速检测

目的　应用复合聚合酶链反应 (复合 PCR) -膜芯片技术快速检测结核分枝杆菌对链霉素 ( SM)的耐药性。方法　设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐 SM基因 rps L和 rrs的寡核苷酸探针制作膜芯片 ,与结核分枝杆菌分离株生物素标记的 rps L和 rrs基因复合 PCR产物进行反向斑点杂交 ,并与 PCR-单链构象多态性 ( PCR- SSCP)和 PCR-直接测序 ( PCR- DS)结果比较。结果　 5 2株结核分枝杆菌临床分离株中 ,9株敏感株rps L和 rrs基因的 SSCP图谱、膜芯片杂交结果与标准株完全相同 ;4 3株耐 SM菌株中 ,33株存在 rps L 基因4 3位密码子 AAG→ AGG突变 ,5株有 rrs基因 5 13位 A→C突变 ,1株有 rrs基因 5 13位 A→ T突变 ,突变率为 90 .7%。结论　膜芯片技术检测结核分枝杆菌耐 SM基因型灵敏度高、特异性强、简便、快速 ,可用于临床耐药性检测