河北省1例输入性登革热病例的病毒分离及其分子特征分析

目的从疑似登革热病例血清中分离病毒,获取全基因组数据并分析分子进化特征。方法采集河北省1例由柬埔寨输入的登革热疑似病例的血清样本,用胶体金法检测登革病毒IgM和IgG抗体以及NS1抗原;利用Vero E6细胞从血清中分离登革病毒,并采用Real-time PCR对病毒进行分型;扩增病毒全基因片段,将序列与国内外分离株序列进行比对,构建系统发生树。结果胶体金检测显示该病例血清登革病毒IgM、IgG抗体和NS1抗原均为阳性,从早期血清中分离到登革病毒,鉴定为I型登革病毒,分子进化分析揭示该分离株与东南亚地区毒株最为相似,病毒全基因组和E基因核苷酸序列同源性最高达99.99%,而与近年国内其他地区分离株进化关系较远。结论国内登革热的防控依旧需要加强输入性病例的监测。     

2009年浙江省义乌市登革热暴发疫情实验诊断和病原分子溯源

目的 对2009年浙江省义乌市发生疑似登革热暴发疫情进行实验诊断和病原分子溯源.方法 对40份疑似患者的血清样本同时进行登革病毒抗体、病毒核酸检测和病毒分离.对分离毒株提取病毒核酸后用RT-PCR方法扩增E基因,进行核苷酸序列测定和同源性与进化分析.结果 40份血清样本中登革病毒IgM抗体阳性17份(42.5%),IgG抗体阳性4份(10.0%);核酸阳性34份(85.0%);分离到登革病毒3型(D3)28株(70.0%).选取13株D3分离株测序,E基因全长均为1479个核苷酸(nt),无插入或缺失突变,推导编码493个氨基酸(aa).13株浙江D3分离株之间E基因同源性为100.0%.浙江D3株与2004年沙特阿拉伯分离株(Sandi Arabia/2004)的同源性最高,nt和aa同源性分别为99.3%和100.0%;与原型株(D3/H87/1956)相比同源性分别为93.4%和97.4%;与1980年中国广西D3分离株在该区域的同源性分别为93.6%和97.4%.E基因进化树显示浙江D3分离株在GⅢ进化支上,与浙江株亲缘关系最近的毒株为沙特阿拉伯株,均在同一进化支上.结论 引起2009年浙江省义乌市登革热暴发疫情的病原是登革3型GⅢ亚型,该病毒最有可能来源于沙特阿拉伯.     

2014—2019年东莞市Ⅰ型登革病毒E基因进化特征分析

目的了解东莞市2014—2019年登革热流行情况和血清型Ⅰ型登革病毒(DENV-1)基因型及E基因特征。方法收集2014—2019年东莞市各镇街医院上送的经临床诊断为疑似登革热病例血清样本共962份,其中的729份样本应用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行登革IgM抗体检测,全部962份血清样本采用实时荧光PCR进行检测,核酸阳性样本中的血清型Ⅰ型样本用细胞培养方法进行病毒分离鉴定,并对其E基因序列进行测序及系统进化树分析。结果2014—2019年东莞市登革热7—11月为流行期,9—10月为发病高峰。检出IgM抗体阳性样本261份,阳性率35.90%。962份急性期血清中登革病毒核酸阳性362份,阳性率37.6%,其中DENV-1阳性311份,占85.9%。分离获得35株DENV-1毒株,E基因序列比对和系统进化分析显示,35株DENV-1分离株间核苷酸相似度为89.8%~100.0%,分属基因Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅴ型,分别为29、1和5株。所有35株分离株与广州、浙江等地及越南、菲律宾、印度等东南亚国家当年或往年流行株同源性较高。结论2014—2019年东莞市流行的DENV-1优势型别为基因Ⅰ型。流行方式可能为广州等周边城市及东南亚国家输入病例引起的本地暴发流行。须警惕基因Ⅴ型DENV-1输入引起登革热暴发流行。     

浙江省2013年输入性登革热病例病原分子溯源

目的对2013年浙江省登革热病例进行实验室确诊与病原的分子溯源。方法对患者血清样本同时进行登革热病毒Ig M抗体和核酸检测及病毒分离,阳性分离株采用RT-PCR方法扩增E基因,进行核苷酸序列测定和同源性与进化分析。结果 18例患者发病前均有在境外登革热流行区暴露史,从患者18份血清样本中检测到登革热病毒Ig M抗体阳性15份(83.3%),核酸阳性8份(44.4%),分离到登革热1型病毒6株,4型1株。6株登革热1型株之间E基因核苷酸和氨基酸同源性分别为90.9%~99.7%和96.8%~100%,与浙江省2004年登革热1型株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为91.4%~98.5%和96.6%~99.0%;E基因进化树显示,登革热1型株位于GⅠ、GⅣ和GⅤ基因亚型上,登革热4型株位于GⅠ亚型上,2013年7株登革热病毒与浙江省2004-2009年登革热病毒之间亲缘关系较远。结论证实2013年浙江省登革热病例均为输入性,输入国为菲律宾、安哥拉、斯里兰卡和巴西等;登革热1型株基因亚型分别为亚洲型、南太平洋型和美洲/非洲型,登革热4型株为东南亚型;登革热4型病毒为浙江省首次分离。     

云南中缅边境一起输入性登革热暴发的分子流行病学研究

目的调查云南中缅边境一起输入性登革热流行状况及其流行病毒株的分子流行病学特点。方法采集医院就诊和口岸入境人员中登革热、疑似登革热和不明原因发热患者血清标本并进行流行病学调查,采用ELISA检测登革病毒IgM抗体,RT-PCR检测登革病毒核酸,核酸阳性标本进行登革病毒PrM．C和NS,区的基因核苷酸序列测定和分析。结果2008年7—11月在云南省瑞丽市共采集急性期患者血清标本103份,经登革病毒IgM抗体和核酸检测,49例确诊为登革热。其中除1例为当地感染病例,其余48例均为输入性病例,其中18例来自缅甸木姐市居民,30例为中国居民到缅甸经商或务工返回后发病者。从缅甸输入病例血清中获得2株病毒(RLB61和RLC31)的PrM．C和NS,区基因核苷酸序列,同源性和系统进化分析表明,RLB61株为登革l型病毒,RLC31株为登革3型病毒,与东南亚登革病毒流行株具有较近的亲缘关系。结论经血清学和分子流行病学证实瑞丽市边境地区发生输入性登革热暴发,并间接证实缅甸木姐市2008年存在登革l和3型病毒流行。     

珠海登革病毒分离株的型别鉴定与序列分析研究

[目的]了解珠海市部分人群和入境船员中登革热的流行情况和珠海市流行的登革病毒株的型别和序列特征。[方法]分别采用胶体金快速法、酶联免疫吸附试验(ELISA)对登革热抗体进行检测；采用细胞培养和逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行病毒鉴定,并对其结构蛋白基因序列进行克隆、测序及同源性分析。[结果]来自东南亚国家船舶的船员血清中登革病毒IgM抗体检出率为4．40％,IgG抗体为20．33％,其阳性样本经RT-PCR扩增,结果为阴性。而对本室保存的2001年珠海散发的登革热患者阳性血清,经用C6/36细胞培养分离出1株登革病毒,用登革病毒通用引物和Ⅱ型特异性引物,扩增出相应的片段,证实为登革Ⅱ型病毒；该分离株(DV2-1)的基因序列与其他9株登革Ⅱ型病毒进行系统发育关系的分析,结果显示分离株(DV2-1)与GD08/98株、FJ11/99株、16681株位于相近的分支,其中与1998年广东流行株GD08/98株系统进化关系最近。[结论]2001年珠海地区登革热的散发流行为登革Ⅱ型病毒所致,推测其可能是输入性传染。     

登革2型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研究

目的 为了对2004年浙江省报告的输入性疑似登革热病例查明病因，从分子水平分析流行毒株的生物学特征，追踪传染源，为疾病的预防控制提供实验室依据。方法 对疑似患者血清标本采用ELISA、IFA和荧光RT—PCR方法分别检测登革病毒IgM、IgG抗体和病毒核酸，并用C6／36和BHK-21细胞分离登革病毒。采用RT—PCR方法扩增病毒E基因和NS1基因后分别进行序列测定，并与不同国家和地区的登革热毒株进行同源性和进化树分析。结果 从患者血清中检测到登革病毒IgM、IgG抗体和登革2型病毒核酸，并分离到登革2型病毒；浙江省登革2型病毒分离株（ZJ／01／04）与登革2型国际标准株Jamaica、国内Fujian／10／99株和Saudi／92株在E基因上氨基酸的同源性分别为97．1％、99．2％和99．6％，而与登革1、3、4型毒株相同区域氨基酸同源性分别为68．7％、66．9％和63．6％。基因进化树显示ZJ／OI／04分离株与Saudi／92株亲缘关系最近，在进化树的同一分支上。结论 从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该输入病例是由登革2型病毒引起，该毒株最有可能来源于沙特阿拉伯。     

浙江省衢州市1例输入性登革热病例分子流行病学研究

目的调查浙江省衢州市1例登革热输入性病例流行病学特征及病原体分子溯源,为登革热的防控提供依据。方法对2017年输入性登革热病例进行流行病学调查,采集病例血清进行登革热病毒核酸和抗体检测,提取病毒核酸后扩增E基因并测序,利用生物信息学软件进行多序列比对并构建进化树。结果该病例登革热病毒核酸及IgM抗体检测结果均为阳性,基因序列比对及进化分析,病毒株为登革热病毒1型Ⅰ亚型,与东南亚病毒株(登录号KY586429.1、KJ806941.2)亲缘关系最近,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.1%和99.7%。结论衢州市登革热病毒1型病例可能为来自东南亚的1例输入性病例。     

河南省2018年输入性登革热的病原监测分析

目的 分析2018年河南省输入性登革热的病原监测情况。方法 利用国家传染病报告信息管理系统,收集2018年河南省登革热疑似病例,开展个案调查同时采集血清,检测登革病毒NS1抗原、IgM和IgG抗体以及病毒RNA;对于病毒RNA检测阳性的样本进行荧光PCR分型诊断和E基因序列扩增,阳性扩增产物测序后进行同源性比对和系统进化分析。结果 2018年河南省累计报告登革热病例29例,均为输入性病例,来自东南亚地区(25/27,92.6%)和非洲地区(2/27,7.4%),以<45岁中青年农民为主,男性明显多于女性,输入性病例时间空间分布分散。29例报告病例中NS1抗原和/或IgM检测阳性的22例。8例病例标本进行核酸检测,其中6例阳性且基因分型成功,其中登革病毒1型、2型各3例。1例由马尔代夫输入的2型登革病毒进行了测序和系统进化分析,与2008年柬埔寨2型登革病毒JF730046一致性最高,属于AsianⅠ基因亚型。结论 2018年河南省输入性登革热病例较2017年明显上升,但未引起河南省本地流行。     

中山市2014－2016年6株Ⅱ型登革病毒E基因分子特征分析

目的 分离鉴定中山市2014－2016年Ⅱ型登革病毒,从分子水平进行分析其地域来源和系统进化情况。方法 选取中山市2014－2016年核酸阳性血清6份,用C6/36细胞培养分离登革病毒,RT-PCR扩增毒株E基因并进行序列测定,分析其与不同区域流行株和国际标准株的同源性和系统进化情况。结果 成功分离培养出2株2014年登革Ⅱ病毒、2株2015年登革Ⅱ病毒、2株2016年登革Ⅱ病毒。ZS2014-02、ZS2014-03与2014年广州分离株D14115在进化关系上最近,2014年的3株病毒氨基酸和核苷酸同源性均达到91.3%以上;2015年ZS2015-01与广州分离株D14115在进化关系上最近,2015年2株病毒氨基酸和核苷酸同源性分别为98.8%和92.8%;2016年ZS2016-01与2010年巴布新几内亚分离株JN568270.1进化关系较近,2016年2株病毒氨基酸和核苷酸同源性分别为91.4%和88.8%。结论 6株毒株与国际标准株New Guinea C 登革Ⅱ型比较均存在氨基酸位点的差异。2014年2株毒株为广州输入病例,2015年的2株毒株ZS2015-01为广州输入,ZS2015-02为中山市本地二代病例,2016年的ZS2016-01为巴布新几内亚输入,而ZS2016-02为菲律宾输入病例。     

福建口岸首次截获输入性登革热病例实验室诊断

〔目的〕通过实验室检测发现福建口岸首次截获输入性登革病例,并进行分子追踪溯源。〔方法〕采用实时荧光RT-PCR和RT-PCR检测方法,并对RT-PCR扩增产物进行核苷酸序列分析。〔结果〕从血清样本中检出登革病毒1型核酸,序列分析表明,该病毒株与来自太平洋群岛分离株在系统进化树上最为接近,序列同源性高。〔结论〕福建口岸首次截获输入性登革热病例,病毒株来源于太平洋群岛地区。     

2019年广西7份本地感染登革病毒E基因特征分析

目的 了解2019年广西本地感染登革病毒(Dengue virus,DENV)E基因特性,探索可能的输入来源。方法 采用实时荧光定量PCR（real - time fluorescence quantitative PCR,RT - qPCR）方法对广西本地感染登革热病例急性期血清样本进行病毒核酸检测并分型,扩增登革病毒 E基因后测序,测序结果与不同地区和国家的参考株进行同源性比较和系统进化分析。结果 53份登革热病例血清标本经RT - qPCR分型,结果42份（79.2%,42/53）登革病毒核酸阳性,其中南宁9份、梧州10份、玉林17份、崇左6份,均为DENV - 1型,其余11份为登革病毒核酸阴性,42份DENV - 1型阳性核酸样本经过E基因扩增共得到7份,其中南宁市1份、梧州市1份、玉林市2份、崇左市3份,进化分析结果显示7份样本均为DENV - 1型Genotype Ⅰ基因型,其中DENV1/GXNN/007/2019、DENV1/GXWZ/009/2019、DENV1/GXYL/011/2019、DENV1/GXYL/012/2019与2019年广东株（序列号:MN921500）同源性99.94%～100.00%,DENV1/GXCZ/015/2019、DENV1/GXCZ/016/2019、DENV1/GXCZ/017/2019与 2015年印度尼西亚株（序列号:MG894852）同源性达99.60%,与1945年夏威夷参考株（序列号:AF425619）比较存在12处氨基酸位点变异。结论 2019年广西登革病毒是Genotype Ⅰ基因型,推测病毒从广东和东南亚国家输入导致的本地流行,应加强登革热跨省、跨境传播的防控。     

登革病毒重组膜蛋白抗原的制备与应用

目的在原核系统中表达登革病毒1~4型膜蛋白B区的型特异性抗原,开发登革病毒感染系列酶联免疫诊断试剂盒。方法利用PCR技术从登革病毒标准株扩增膜蛋白B区抗原基因,通过酶切消化后连接到表达载体上,转化大肠埃希菌BL21 StarTM(DE3),经IPTG诱导表达,表达产物用液相层析法纯化;并用Western Blot(WB)及ELISA法对表达产物的抗原性进行检测。用重组抗原制备登革病毒抗体酶联免疫诊断试剂,用该试剂对广东省登革热监测血清库样本的登革病毒抗体测定,并与进口登革IgM抗体检测试剂(澳大利亚PanBio)进行对比分析。结果表达产物具有较高的浓度、纯度和良好的活性。重组抗原对16份登革病毒分离阳性血清中的登革病毒IgM抗体有良好的抗原反应性(A均≥0.29,cut-off值为0.2);对2004年中山市登革热疫情65份患者血清样本的IgM、IgG检出率均达100%(65/65、28/28)。用重组抗原制备的试剂检测了617份登革热疑似病例血清中的登革病毒IgM抗体,阳性率为70.66%,其中对123例临床确诊登革热病例血清的IgM阳性率为90.24%;检测1 675份登革热监测血清样本的IgG抗体,阳性率为9.19%;用该试剂与进口试剂分别对34份临床确诊的登革热病例的血清样本进行检测,两者IgM抗体阳性率分别为91.18%、73.53%。结论制备的登革病毒重组抗原可用于研制登革病毒感染酶联免疫诊断试剂盒。     

2016年-2018年浙江省义乌市输入1型登革病毒分子溯源分析

目的对2016年-2018年义乌市输入1型登革热病例进行实验室检测与分子溯源分析。方法采集登革热病例急性期血清标本进行NS1抗原和核酸检测,用RT-PCR法扩增包膜蛋白(Envelope protein,E)基因,测定核苷酸序列并进行系统进化分析。结果6例登革热病例NS1抗原和核酸检测结果均为阳性。6株毒株之间的E基因核苷酸和氨基酸同源性分别为96.6%~99.3%和98.8%~100%,系统进化分析显示,E基因序列均属于登革病毒1型的GⅠ亚型,与东南亚2003年-2016年分离病毒株亲缘关系最近。结论2016年-2018年义乌市输入登革病毒1型的亚型主要为GⅠ亚型,输入来源主要为东南亚国家。     

贵阳口岸及周边地区人群登革病毒感染情况调查

为了解贵阳口岸及周边地区人群登革病毒感染状况,采用ELISA法对755份血清样本进行登革病毒抗体检测.从中检出登革病毒抗体阳性55例,阳性率为7.28%.贵阳机场工作人员、兴义机场工作人员、册亨县居民登革病毒IgG抗体阳性率分别为7.5%、4.5%和7.2%.不同地区、不同民族、不同年龄组人群登革病毒IgG抗体阳性率差异无统计学意义(这P>0.05).由于存在登革病毒感染,口岸检验检疫机构应加强对口岸地区人群和蚊媒的监测力度,强化登革热的防控措施,密切关注登革热的疫情动态.     

浙江口岸首次发现入境登革热的实验室诊断

目的确证杭州机场截获发热患者为登革热,为口岸卫生检疫提供技术支持。方法分离患者血清,用ELISA试剂盒检测登革热Ig M抗体;同时提取血清中的病毒核酸,采用登革热通用型实时荧光RT-PCR、RT-LAMP及RTPCR法进行检测,并进行核酸分型检测,同时对RT-PCR的扩增产物进行测序分析。将测序结果与Gen Bank中的其他国家或地区的登革1型病毒株进行比对,分析该病毒的来源。结果血清学检测登革热Ig M抗体为阳性,登革1型病毒RT-LAMP检测结果为阳性,经序列分析该病毒株与印度株(JN940920.1)最为接近,同源性最高,达到97%。结论杭州机场截获的输入性发热患者确证为登革1型病毒感染,该患者为浙江口岸首次发现的输入性登革热。     

2010年浙江省输入性登革2型病毒分子特征研究

目的:为确证2010年浙江省输入性疑似登革热病例病因,分析病原的分子特征并进行溯源。方法:对患者血清标本分别检测登革IgM抗体、病毒核酸和病毒分离。对分离株E和NS1基因测序,并进行同源性和进化分析。结果:从血清中检测到登革IgM抗体和登革2型核酸,并分离到登革2型病毒株(ZJ/02/10);浙江登革2型分离株与标准株NGC在E基因的核苷酸(nt)和氨基酸(aa)同源性分别为94.7%和97.6%,而与登革1、3、4型的nt同源性分别为65.3%、64.3%和65.9%。ZJ/02/10株与菲律宾PHI/St68/00株E基因nt和aa同源性最高,进化树显示二者亲缘关系最近。NS1基因进化树结果与E基因相似。结论:从血清学、病原学和分子特征均证实输入性疑似登革病例由登革2型病毒引起,该毒株最有可能来源于菲律宾。     

湖南省2018年登革热本地暴发流行病学和病毒分子特征分析

目的 对湖南省2018年登革热本地暴发疫情进行流行病学及病原学特征研究。方法 对报告的8例疑似登革热病例进行实验室诊断,对病例密切接触者搜索出的186例疑似登革热病例和发热病例开展病原学监测,应用C6/36细胞对病例急性期血清开展病毒分离,对15株登革病毒株E基因测序,分析病毒的血清型别和基因亚型,构建系统发生树,分析可能的传播来源。在疫点开展蚊媒密度应急监测和健康人群回顾性血清流行病学调查。结果 8例疑似病例血清标本,6例登革病毒核酸阳性,4例登革病毒NS1抗原阳性。186例疑似登革热病例,96例病原学检测结果阳性,分离到登革病毒株64株,经鉴定全部为登革病毒2型全球型,来源于广东和浙江省的可能性较大。应急蚊媒密度监测,疫点布雷图指数最高达65,具有极高的登革热传播风险。回顾性调查377名健康人群进行登革热抗体水平监测,IgG抗体阳性率为0.53%（2/377）。结论 现场流行病学调查和分子遗传分析提示,湖南省2018年本地暴发疫情由输入性病例引起,由单一的登革病毒2型全球型引起。     

登革热抗体快速免疫色谱测试卡同步检测登革病毒IgM和IgG抗体的试验

用登革热抗体快速兔疫色谱测试卡检测35份已确诊的登革热急性期患者血清,其中34份IgM抗体阳性,检出率97.14％;而用间接免疫荧光试验(IFA)检测同样的标本,32份IgM抗体阳性,检出率为91.29％,二者检出率无显著性差异(x~2=1.06,P>0.05)。应用登革热抗体快速免疫色谱测试卡检测32份确诊登革热恢复期患者血清,其中32份IgG抗体阳性,检出率为100％;同时用IFA检测,29份IgG抗体阳性,检出率为90.62％,二者检出率无显著性差异(x~2=1.39,P>0.05)。用登革热抗体快速免疫色谱测试卡检测非登革血清94份,其中IgM抗体阳性1份,IgG抗体阳性 3份,检出率分别为 1.06％和 3.19％。此法检测登革病毒 IgM和IgG抗体,操作简便、快速、敏感,可作为登革热筛选试验。     

一起疑似病毒性脑膜炎暴发病原学检测分析

目的 2014年10月浙江省金华市荣光小学发生疑似病毒性脑膜炎暴发疫情,为及时查明病因,分析病原的分子特征并进行病原溯源。方法开展流行病学调查,采集患者脑脊液和咽拭子样本6份,检测人类肠道病毒(HEV)核酸和分离病毒,对HEV分离株VP1基因测序,进行同源性与进化分析。结果在全校328名学生中,发病7例,罹患率2.13%。患者年龄7~8岁;临床症状为发热、头痛、呕吐等;从5例患者6份样本中均检测到HEV核酸,其中3份脑脊液中分离到3株肠道病毒埃可30型(echovirus 30,E30);新分离株与E30原型株之间VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为81.8%和91.8%~92.1%;进化分析显示:新分离株位于E30 G基因亚型分支上,与2013年浙江省CHN/ZJ/RA-72/13株亲缘关系最近。结论引起2014年10月浙江省金华市荣光小学聚集性病毒性脑膜炎暴发疫情的病原为E30 G基因亚型病毒。