pcDNA3.1(+)gpc-5真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建pcDNA3.1（＋）磷脂酞肌醇蛋白5（gpc-5）基因真核表达载体。方法：根据gpc-5基因序列设计一对引物,利用RT-PCR法扩增出gpc-5基因的编码区（CDS）,连接在PGM-T载体上,并进行pcDNA3.1（＋）gpc-5真核表达载体的构建、酶切鉴定以及测序。结果：gpc-5基因的体外扩增目的片段为2 083 bp。所构建的重组体pcDNA3.1（＋）gpc-5经双酶切鉴定,与预期片段大小一致,测序结果与NCB I收录gpc-5基因的CDS序列一致。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）gpc-5,为研究gpc-5基因在原发性肺癌的发生发展中的作用奠定了基础。     

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。     

pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的构建与鉴定

[目的]从人角质形成细胞系HaCaT中克隆NRP1(Neuropilin-1)基因全长cDNA,构建含NRP1基因的重组真核表达载体,为下一步的NRP1基因功能研究奠定基础。[方法]采用RT-PCR法从人角质形成细胞系HaCaT中扩增NRP1基因全长cDNA,扩增产物通过TA克隆连接到pMD18-T载体进行测序鉴定,然后通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),最后得到pcDNA3.1(+)-NRP1重组质粒。[结果]成功克隆NRP1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体。[结论]pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的成功构建可以为NRP1基因功能的进一步研究及其临床基因治疗奠定实验基础。     

小鼠pcDNA3.1/CXCL14真核表达载体的构建、表达及意义

目的 构建小鼠pcDNA3.1/CXCL14真核表达载体,观察其在293T细胞中的表达,为进一步探讨CXCL14对脂肪细胞因子、氧化应激及胰岛素信号转导通路的影响提供工具.方法 从C57/BL胚鼠肝脏组织中抽提RNA,RT-PCR扩增CX-CL14基因片段,并将其插入pcDNA3.1进行测序,鉴定正确构建pcDNA3.1/CXCL14后转染293T细胞,用RT-PCR法和Western blot法分别从mRNA水平和蛋白质水平分别检测CXCL14的表达情况.结果 重构质粒经PCR、限制性核酸内切酶Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切以及DNA序列分析鉴定,表明真核表达载体构建正确;以脂质体法转染293T细胞后,RT-PCR、Western blot能检测到目的蛋白表达.结论 成功构建了小鼠pcDNA3.1/CXCL14真核表达载体并能在真核细胞中进行表达.     

人pcDNA3.1(+)-Cav-1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建pcDNA3.1 (+)-Cav-1真核表达载体,建立稳定转染pcCav-1的6-10B细胞系(6-10B-Cav-1).方法 提取5-8F细胞总RNA,利用RT-PCR获取caveolin-1(Cav-1)开放读码框(Open reading frame,ORF)序列构建Cav- 1/TA亚克隆载体,再将双酶切后的目的片段连入pcDNA3.1(+)真核表达载体并转染6-10B细胞.结果 RT-PCR扩增Cav-1基因ORF序列在783 bp附近见目的条带;质粒酶切鉴定及菌落PCR鉴定分别在783 bp及346 bp附近见目的条带;转染6-10B细胞后,转染组与对照组相比,Cav-1在mRNA水平表达差异具有统计学意义(P =0.027),在蛋白质水平前者比后者高出2倍以上.结论 人Cav-1重组真核表达载体pcDNA3.1( +)-Cav-1构建成功并获得稳定表达Cav -1的6-10B细胞,为进一步检测C av -1在鼻咽癌转移过程的作用奠定基础.     

pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒在Chang Liver细胞中的表达和鉴定

[摘要] 目的 构建pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒并建立人正常肝细胞Chang Liver的稳定表达株。方法 采用RT-PCR法从HepG2细胞中克隆得到UBE2C cDNA全长序列, 将之与pMD18-T载体连接。双酶切和测序鉴定后,再将UBE2C片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。构建好的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将其转入Chang Liver细胞株中,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再用Western blot法检测转染后UBE2C的蛋白表达水平。结果 pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实,目的基因UBE2C的序列完全正确,真核表达质粒成功构建。Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组UBE2C的蛋白表达水平高于转pcDNA3.1(-)组,具有统计学意义（P﹥0.01）。结论 成功构建UBE2C基因的真核表达质粒并建立其稳定表达的Chang Liver细胞株,为下一步研究奠定基础。     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

pIRES2-AcGFP1-sTRAIL真核表达载体的构建及鉴定

目的利用基因工程技术合成sTRAIL（水溶性TRAIL）基因,并以AcGFP为报告基因,构建针对sTRAIL基因的pIRES2-AcGFP1-sTRAIL重组质粒。方法从人胎盘组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增sTRAIL,并加入XhoI和BamHI酶切位点,通过双酶切将其连接于表达载体pIRES2-AcGFP1,通过PCR、酶切及测序鉴定重组质粒构建的正确性,最后用pIRES2-AcGFP1-sTRAIL重组质粒转染Hela细胞利用倒置荧光显微镜直接观察表达情况。结果酶切、PCR及测序结果证实pIRES2-AcGFP1-sTRAIL构建序列正确。结论利用基因工程技术成功构建真核表达载体pIRES2-AcGFP1-sTRAIL,为后续抗肿瘤研究奠定了基础。     

真核表达载体pcDNA3.1（＋）tPA的构建

组织型纤溶酶原激活剂具有高效、特异的溶栓作用,将人ｔＰＡｃＤＮＡ与真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）重组,构建一种无形成美丽及激活原癌基因之虞的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｔＰＡ,以探讨其对纤溶活性的影响。     

t-PA基因克隆及pcDNA3.1t-PA真核表达质粒的构建

目的利用基因工程技术克隆组织纤溶酶原激活物(t-PA)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pcDNA3.1t-PA质粒载体.方法采用高效Trizol试剂快速从人肺组织中提取RNA,RT-PCR获得t-PA cDNA,扩增、纯化、回收t-PA基因片段并将质粒pcDNA3.1和t-PA基因片段分别双酶切,前者纯化回收大片段,后者纯化回收1.9kb片段,再将回收的pcDNA3.1大片段与t-PA基因片段(1.9kb)重组.对重组pcDNA3.1t-PA质粒进行单酶切和双酶切鉴定,并测序.结果成功地从胎儿肺组织中克隆了t-PA基因,并构建了以pcDNA3.1为载体的真核表达质粒载体.结论含t-PA基因新型表达质粒构建的成功将为基因防治血管重建术中局部血栓形成奠定基础.     

pcDNA3.1- Bcl-2真核表达载体构建

目的 克隆大鼠Bcl-2基因（B cell lymphoma）全长cDNA,构建含大鼠Bcl-2基因的重组真核表达质粒。方法 采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体, 测序证实后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒。结果: RT-PCR获得长度为720 bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3. 1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1- Bcl-2构建成功。结论 成功克隆了Bcl-2基因,并构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒,为进一步研究Bcl-2基因的功能及应用Bcl-2进行基因治疗奠定基础。     

pIRES2-EGFP-hIL-10真核表达载体的构建及鉴定

目的构建带有报告基因EGFP的hIL-10真核表达载体。方法通过RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增出IL-10基因,构建IL—10基因和报告基因EGFP基因真核表达载体pIRES2-EGFP—hIL-10,经PCR、酶切、测序等方法进行鉴定,紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度。结果酶切、PCR及测序证实pIRES2-EGFP—hIL-10载体序列正确。结论成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP—hIL-10,可为后续器官移植免疫耐受的研究奠定基础。     

真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1构建及意义

目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1.方法:通过PCR扩增FGFR1目的片段,双酶切纯化PCR产物及pcDNA3.1a,将扩增的FGFR1基因片段插入pcDNA3.1a线性质粒,即构建成pcDNA3.1a-FGFR1真核表达质粒,将质粒转化感受态DH5α菌株,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及测序鉴定.结果:酶...     

pcDNA3.1+-HIF-1α载体的构建和初步表达鉴定

目的克隆和构建带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因真核表达载体pcDNA3.1 -HIF-1α。方法以大肠癌细胞株HT29的总RNA为模板,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),获得HIF-1α的cDNA,克隆入T载体,测序证实后克隆入真核表达载体pcDNA3.1 ,酶切鉴定重组子。将构建好的pcDNA3.1 -HIF-1α用脂质体法转入HEK293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1αcDNA全长,测序结果与Genbank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1 ;建立了稳定的细胞株HEK293/pcDNA3.1 -HIF-1α。结论成功克隆和构建带人HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3.1 -HIF-1α,并证明其能在真核细胞内表达。     

人真核表达质粒载体pcDNA3.1-hOPG的构建及体外表达

目的 构建表达人骨保护素基因（hOPG）的真核表达质粒pcDNA3．1-hOPG,并检测其在体外的表达,为治疗破骨细胞功能异常引起的骨吸收提供实验基础。方法 从MGC：29565上获得hOPG基因片段并用PCR方法扩增,将其连接于真核表达质粒pcDNA3．1（-）,测定序列后,用脂质体包裹转染C2C12细胞,采用免疫组化和骨吸收抑制实验检测OPG的表达及功能。结果 经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染C2C12细胞后可表达功能性OPG蛋白。结论成功构建的pcDNA3．1-hOPG重组质粒能在体外表达OPG蛋白。     

pcDNA3/TCRγV1真核表达载体的构建及表达

目的：构建含TCRγV1基因的真核表达质粒并检测其存小鼠骨骼肌中的表达。方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取RNA,用RT-PCR法扩增含BamH Ⅰ与Hind Ⅲ酶切位点的TCRγV1基因序列,将TCRγV1基因PCR产物插入pcDNA3后转化到大肠杆菌DH5α,阳性克隆酶切鉴定后测序分析。大量提取质粒,股四头肌注射法免疫小鼠,RT—PCR法检测小鼠肌肉巾TCRγV1 mRNA的表达。结果与结论：pcDNA3／TCRγV1重组质粒构建成功,并能在小鼠骨骼肌中表达。     

pcDNA3.1-hTERT真核表达载体的构建及其抗肿瘤效应

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)真核表达载体pcDNA3.1-hTERT,并观察其对荷瘤小鼠的抗肿瘤效应.方法:用RT-PCR方法扩增出带有Hind Ⅲ, BamHⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy克隆载体连接,筛选出阳性克隆,酶切获得目的片段,与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-hTERT表达载体.将真核表达载体pcDNA3.1-hTERT注射移植性H22肝癌模型C57BL/6小鼠,并设PBS组及转染空质粒pcDNA3.1组,观察3组的抗肿瘤效应.结果与结论:成功构建pcDNA3.1-hTERT真核表达载体.该载体中的hTERT基因片段全长为951 bp,可编码相对分子量为37 000、由317个氨基酸构成的多肽.该基因片段与GenBank公布的相应基因进行同源性比较,核苷酸序列的同源性为98.73%,编码产物的氨基酸序列的同源性为99.68%.该真核表达载体免疫荷瘤小鼠后,pcDNA3.1-hTERT组肿瘤生长受到抑制,且该组生存期分别长于PBS组及pcDNA3.1组 (P<0.05);pcDNA3.1- hTERT组的IL-2、IFN-γ细胞因子水平也均高于PBS组与pcDNA3.1组(P<0.05).提示该真核表达载体在受试动物体内可有效地诱导特异性抗肿瘤免疫应答.     

真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1的构建及其对子宫内膜癌HEC细胞增殖的影响

目的:构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1,检测人子宫内膜癌HEC细胞转染pcDNA3.1-Beclin1后,外源性基因Beclin1在蛋白水平的表达,并观察其对HEC细胞增殖的影响。方法:通过RT-PCR和T/A克隆等方法,构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1,并通过脂质体介导的方法将外源性Beclin1基因导入人类子宫内膜癌细胞株HEC中,通过实时PCR检测转染后Beclin1在HEC中表达的情况,并设立实验组(转染pcDNA3.1-Beclin1真核载体)、空质粒对照组(转染pcDNA3.1空载体)、空白脂质体对照组,用Western blot法检测子宫内膜癌HEC细胞中Beclin1的表达情况,MTT法检测Beclin1对HEC细胞体外生长的影响等,研究Beclin1基因与子宫内膜癌的关系。结果:经限制性内切酶鉴定及测序,证明Beclin1基因真核质粒的序列完全正确,将其转染HEC细胞,转染后的HEC细胞在体外能继续增殖,但增殖能力明显下降。结论:Beclin1基因pcDNA3.1-Beclin1真核表达载体构建成功,并能在HEC细胞中表达,转染HEC细胞体外增殖能力明显降低,Beclin1基因用于子宫内膜癌基因治疗具有重要靶向价值。     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ的构建和鉴定

目的 构建恒河猴绒毛膜促性腺激素β亚基(macaca mulatta chorionic gonadotrophin β subunit,rmCGβ)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,并了解该质粒能否在真核细胞中表达.方法 通过PCR扩增rmCGβ的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16/pcDNA3.1(+)-rmCGβ细胞株中rmCGβ全段基因cDNA.结果 经4轮PCR,成功扩增出rmCGβ的cDNA全长基因,酶切和测序证明正确构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,通过RT-PCR方法 证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达.建立了稳定的细胞株B16/pcDNA3.1(+)-rmCGβ.结论 成功克隆和构建了rmCGβ的真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)-rmCGβ,为进一步研究rmCGβ的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

DSS对血管性痴呆大鼠PSD95表达及功能的影响

【立论依据】 血管性痴呆(VD)是一种由于脑血液循环障碍,进而使神经元损伤出现认知功能缺损的综合征,目前尚缺乏疗效肯定的手段。突触后致密蛋白-95(PSD95)在NMDAR和突触膜表面蛋白(如nNOS)之间起连接作用,对兴奋性信号转导进行整合。NMDAR参与了海马突触可塑性诱导及学习和记忆机制。在慢性脑缺血早期,PSD95过表达介导了谷氨酸兴奋毒性对神经元的损伤;缺血晚期PSD95表达过低,则出现LTP诱导障碍及学习和记忆能力下降。本课题组预实验结果表明,DSS可提高局灶性脑缺血(MCAO)再灌注损伤及2VO大鼠学习记忆能力;另外,DSS可降低MCAO再灌注24 h后大鼠皮层PSD95水平。 【设计思路】 本设计拟采用大鼠双侧颈总动脉结扎(2VO)慢性脑缺血模型,通过检测脑缺血不同时间点PSD95 mRNA和蛋白水平、PSD95与NMDAR不同亚型的相互作用,探讨DSS改善VD大鼠学习记忆的可能机制。 【实验内容】 (1)大鼠2VO模型的制备;(2)水迷宫实验;(3)尼氏染色观察海马CA1区神经元丢失情况;(4)Real-time PCR及蛋白质印迹方法观察海马组织PSD95的mRNA和蛋白水平变化;(5)免疫共沉淀方法检测PSD95与GluN2A及GluN2B的相互作用。 【材料】 220~250 g SD大鼠、抗体、PCR及尼氏染色试剂盒等。 【可行性】 (1)理论:文献及前期结果支持DSS通过调节PSD95蛋白表达及其与NMDAR的相互作用改善学习记忆的假设;(2)模型:2VO模型为建立VD的有效模型 (3)设施:实验室具备相关实验仪器 (4)操作:学生掌握实验相关操作技术。 【创新性】 本项目从临床问题出发,在前期研究的基础上,创新性地从调控PSD95表达及功能的角度研究DSS对血管性痴呆大鼠学习记忆功能的改善作用及机制。本研究可为缺血性脑血管病的新药开发以及临床治疗提供理论和实验依据。