人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B中RASSF1A基因的甲基化及其表达

目的:研究Ras相关结构域家族1A基因(RASSF1A)启动子区域在子宫内膜癌细胞株HEC-1-B中的甲基化状态及其与RASSF1A基因表达的关系。方法:采用甲基化特异性PCR(Methylation specialPCR,MSP)技术检测HEC-1-B细胞RASSF1A基因甲基化状态;采用逆转录PCR(RT-PCR)技术检测HEC-1-B细胞RASSF1A mRNA表达;并观察去甲基化药物5-杂氮脱氧胞苷(5-Aza-CdR)作用后RASSF1A基因甲基化状态和RASSF1A mRNA表达。结果:子宫内膜癌细胞株HEC-1-B存在RASSF1A高甲基化,RASSF1A mRNA表达缺失或低表达。结论:子宫内膜癌细胞株HEC-1-B中的RASSF1A基因启动子区域DNA存在高甲基化,可能在子宫内膜癌的发生发展中起作用。     

两株子宫内膜癌细胞中mTOR信号通路激活的研究

目的：探讨PTEN缺失Ishikawa和PTEN完整HEC-1A细胞中mTOR信号通路的激活。方法：激光共聚焦显微镜检测Ishikawa和HEC-1A细胞中PTEN蛋白表达;RT-PCR和western blot法从mRNA和蛋白水平分别检测mTOR mRNA和下游磷酸话靶蛋白S6K1和4E-BP1表达。结果：Ishikawa细胞中PTEN蛋白表达缺失,HEC-1A细胞PTEN蛋白表达显著 (P<0.01);两株细胞中均存在mTOR mRNA表达,而Ishikawa细胞中表达水平要高于HEC-1A细胞(P<0.05);Ishikawa细胞中S6K1和4E-BP1蛋白的磷酸化要明显高于HEC-1A细胞(P<0.05)。 结论：2种子宫内膜癌细胞中均存在mTOR信号通路的激活,这种激活水平与PTEN相关,PTEN缺失Ishikawa细胞的激活水平较高。 【关键词】子宫内膜癌;雷帕霉素靶蛋白;PTEN;Ishikawa细胞;HEC-1A细胞     

人胃癌细胞株CDX2基因表达与其启动子区甲基化的关系

目的:探讨人胃癌细胞株CDX2基因表达与其启动子区甲基化的关系.方法:不同浓度5-aza-CdR处理MKN45细胞株,甲基化特异性PCR(MSP)检测用药前后CDX2启动子甲基化状态;实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测CDX2和DNMT1 mRNA和蛋白表达.结果:MKN45细胞株CDX2基因启动子区域高甲基化,CDX2 mRNA表达极低,蛋白不表达;经3种浓度5-aza-CdR处理MKN45细胞72 h后,细胞中CDX2 mRNA和蛋白表达均出现上调,而DNMT1表达出现下调.结论:CDX2基因表达下调与其启动子CpG岛高甲基化有关,DNMT1可能参与该过程的调节.     

5-Aza-CdR对子宫内膜癌中RASSF1A基因甲基化的作用

目的 探讨去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧脱苷（5-Aza-CdR）对子宫内膜癌中Ras相关区域家族1A（\RASSF1A）基因甲基化的作用。方法 取子宫内膜癌细胞株HEC-1-B细胞随机分组,用不同浓度（1.0×10^\-6,3.0×10^\-6,10.0×10^\-6 mol/L)的去甲基化药物5-Aza-CdR处理后,采用甲基化特异性PCR、实时定量PCR、Western blot、TUNEL等技术,分析空白对照组及实验各组子宫内膜癌细胞株HEC-1-B中\RASSF1A基因启动子区域甲基化情况、mRNA表达水平、蛋白表达和细胞凋亡的情况。结果 人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B 细胞中\RASSF1A基因启动子区存在高甲基化,mRNA、蛋白低表达,以及细胞凋亡失控。不同浓度的5-Aza-CdR可逆转\RASSF1A基因高甲基化状态,恢复mRNA、蛋白表达量,并可抑制HEC-1-B 细胞的生长及诱导凋亡。结论 子宫内膜癌异常甲基化\RASSF1A基因作为治疗靶点,去甲基化药物5-Aza-CdR是基因治疗的有效途径。     

子宫内膜癌腺体及间质细胞中基质细胞衍生因子1及其受体CXCR4的表达

目的:检测基质细胞衍生因子1(SDF-1)及其受体CXCR4 mRNA和蛋白在子宫内膜癌细胞系及组织中的表达.方法:应用免疫组织化学和RT-PCR技术,检测子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞,44例子宫内膜癌组织,26例非典型增生子宫内膜、单纯增生子宫内膜和正常子宫内膜组织中SDF-1和CXCR4 mRNA和蛋白表达水平.结果:HEC-1A和Ishikawa细胞均表达CXCR4 mRNA;Ishikawa细胞中SDF-1 mRNA弱表达,而HEC-1A细胞中SDF-1 mRNA未见表达.CXCR4和SDF-1在正常和良性病变的子宫内膜组织腺体细胞中的阳性表达率为100%,在子宫内膜癌组织的腺体细胞中的阳性表达率分别为90.9%和93.2%.各种子宫内膜组织中间质细胞CXCR4和SDF-1的表达均显著弱于腺体细胞.在子宫内膜癌腺体细胞和间质细胞中CXCR4和SDF-1的表达均显著弱于正常及良性病变者.在低分化的子宫内膜癌腺体细胞中CXCR4和SDF-1的表达弱于高分化者.结论:CXCR4和SDF-1在子宫内膜癌细胞系、子宫内膜组织及内膜癌组织中的表达存在差异,在内膜癌组织中其表达均显著弱于正常及良性病变者.     

miR-367通过靶向调控TET2对子宫内膜癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的探讨miR-367通过靶向调控10-11异位的甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET2)对子宫内膜癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响。 方法将人子宫内膜癌HEC-1A细胞分为5组:空白组(NG)、阴性转染组(mimics NC)、miR-367过表达组(miR-367 mimics)、inhibitor NC组、miR-367 inhibitor组。qRT-PCR检测HEC-1A细胞中TET2 mRNA、miR-367表达水平;MTT法检测细胞增殖情况;Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力;TargetScan数据库预测miR-367的靶基因并用双荧光素酶报告基因实验加以验证;Western blotting检测TET2、c-myc、cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平。 结果与NG、mimics NC组相比,miR-367 mimics组HEC-1A细胞TET2 mRNA表达水平下降(P < 0.05),miR-367表达水平升高,24、48 h细胞存活率上升,侵袭、迁移细胞数增加(P < 0.05),TET2蛋白表达水平降低(P < 0.05),MMP-2、MMP-9、c-myc、cyclin D1蛋白表达水平升高(P < 0.05)。与NG、inhibitor NC组相比,miR-367 inhibitor组HEC-1A细胞TET2 mRNA表达水平升高(P < 0.05),miR-367表达水平下降,24、48 h细胞存活率降低,侵袭、迁移细胞数减少,TET2蛋白表达水平升高(P < 0.05),MMP-2、MMP-9、c-myc、cyclin D1蛋白表达水平降低(P < 0.05)。TargetScan数据库预测显示miR-367是TET2潜在靶基因。荧光素酶报告实验结果显示,miR-367 mimics+WT组HEC-1A细胞荧光素酶活性低于miR-367 NC+WT组(P < 0.05),miR-367 NC+MUT组与miR-367 mimics+MUT组荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。 结论miR-367过表达可能通过靶向抑制TET2促进子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、迁移和侵袭。     

食管鳞状细胞癌中MT-3基因表达与启动子区CpG岛甲基化相关性

目的:使用启动子区CpG岛的甲基化特异性PCR(MSP),分析食管鳞状细胞癌中MT-3基因表达与启动子区CpG岛甲基化的相关性。方法:对MT-3基因启动子区的用MSP检测方法,并以DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂5-氮2'-脱氧胞(5-aza-CdR)分别处理食管鳞状细胞癌组织及HET-1A细胞株,检测MT-3基因启动子区甲基化状态变化,Western blot检测蛋白表达。结果:食管鳞状细胞癌组织中MT-3基因启动子区呈甲基化状态,HET-1A细胞株MT-3基因启动子区呈非甲基化状态。采用5'-Aza-dC去除食管鳞状细胞癌组织中MT-3基因启动子区甲基化后,金属硫蛋白3表达水平上升了9.2倍。结论:MT-3启动子区CpG岛甲基化可能是导致金属硫蛋白3低表达的重要机制,其结果则导致食管癌发生。     

miR-613靶向PTBP1抑制子宫内膜癌细胞侵袭和迁移的实验研究

  目的  探讨微RNA-613(miR-613)靶向多聚嘧啶区结合蛋白1(PTBP1)对子宫内膜癌细胞(Ishikawa)增殖、迁移及侵袭的影响。  方法  采用RT-qPCR法检测子宫内膜癌组织miR-613及PTBP1 mRNA表达;体外培养Ishikawa细胞并对Ishikawa细胞进行干预,过表达miR-613、抑制PTBP1表达或共同过表达miR-613与PTBP1,分别检测Ishikawa细胞增殖、迁移与侵袭及PTBP1、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9蛋白表达情况;双荧光素酶报告实验验证miR-613与PTBP1的靶向关系。  结果  子宫内膜癌组织中miR-613表达水平为0.48±0.09,显著低于癌旁组织的1.03±0.11(P＜0.05),PTBP1 mRNA表达水平为2.78±0.23,显著高于癌旁组织的1.01±0.12(P＜0.05),miR-613与PTBP1 mRNA呈负相关关系(r=-0.523,P＜0.05);双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-613靶向负调控PTBP1表达;过表达miR-613与抑制PTBP1表达,Ishikawa细胞存活率、细胞迁移与侵袭数、PTBP1、MMP-2及MMP-9表达水平显著降低(均P＜0.05);过表达PTBP1逆转过表达miR-613对Ishikawa细胞增殖、迁移与侵袭的抑制作用。  结论  miR-613在子宫内膜癌组织中低表达,过表达miR-613可通过靶向抑制PTBP1表达,抑制人子宫内膜癌细胞的增殖、迁移及侵袭。      

5-杂氮-2'-脱氧胞苷对前列腺癌PC3细胞系生长以及抑癌基因GSTP1、RASSF1A转录的影响

目的:观察DNA去甲基化药物5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-CdR)对前列腺癌细胞株PC3抑癌基因GSTP1和RASSF1A 转录改变以及细胞增殖活性的影响.方法:用不同浓度5-aza-CdR(2、5、10 μmol/L)处理前列腺癌细胞株PC3,利用甲基化特异性PCR(MSP)法检测用药前PC3细胞株GSTP1、RASSF1A启动子甲基化状态;采用实时荧光定量RT-PCR法检测用药过程中GSTP1和RASSF1A mRNA转录改变;用MTT法和流式细胞术检测用药前后PC3肿瘤细胞增殖活性改变.结果: GSTP1、RASSF1A启动子区域出现甲基化现象.与对照组相比,药物组培养24 h后 GSTP1和RASSF1A mRNA表达未发生明显改变;培养48 h后5、10 μmol/L药物组GSTP1和RASSF1A mRNA表达出现上调;72 h后各浓度药物组均检测出两基因mRNA表达升高(P<0.05).药物组培养24和48 h未出现明显的细胞增殖抑制现象和细胞周期改变;培养72 h后,药物组细胞增殖抑制显著(P<0.05),细胞周期改变明显(P<0.05),阻滞于G0/G1期.结论:GSTP1和RASSF1A基因在PC3前列腺癌细胞系中的失表达可能与其启动子CpG岛高甲基化有关;5-aza-CdR能在一定程度上抑制PC3细胞增殖,干扰细胞周期,提高GSTP1和RASSF1A的转录水平.     

5-杂氮-2′-脱氧胞苷对前列腺癌PC3细胞系生长以及抑癌基因GSTP1、RASSF1A转录的影响

目的:观察DNA去甲基化药物5-杂氮-2′-脱氧胞苷（5-aza-CdR）对前列腺癌细胞株PC3抑癌基因GSTP1和RASSF1A 转录改变以及细胞增殖活性的影响。方法:用不同浓度5-aza-CdR(2、5、10 μmol/L)处理前列腺癌细胞株PC3,利用甲基化特异性PCR（MSP）法检测用药前PC3细胞株GSTP1、RASSF1A启动子甲基化状态;采用实时荧光定量RT-PCR法检测用药过程中GSTP1和RASSF1A mRNA转录改变;用MTT法和流式细胞术检测用药前后PC3肿瘤细胞增殖活性改变。结果: GSTP1、RASSF1A启动子区域出现甲基化现象。与对照组相比,药物组培养24 h后 GSTP1和RASSF1A mRNA表达未发生明显改变;培养48 h后5、10 μmol/L药物组GSTP1和RASSF1A mRNA表达出现上调;72 h后各浓度药物组均检测出两基因mRNA表达升高(P<0.05)。药物组培养24和48 h未出现明显的细胞增殖抑制现象和细胞周期改变;培养72 h后,药物组细胞增殖抑制显著(P<0.05),细胞周期改变明显(P<0.05),阻滞于G0/G1期。结论:GSTP1和RASSF1A基因在PC3前列腺癌细胞系中的失表达可能与其启动子CpG岛高甲基化有关;5-aza-CdR能在一定程度上抑制PC3细胞增殖,干扰细胞周期,提高GSTP1和RASSF1A的转录水平。