骨髓瘤细胞系KM3中免疫球蛋白重链基因易位的初步研究

目的 研究骨髓瘤细胞系KM3中免疫球蛋白重链基因(IgH)的易位。方法 用PCR方法合成地高辛标记的IgH转换区（switch region,S区）探针,即σμ/σδ、Sμ、Sγ、Sα、Sε的3'端和5'端探针,应用Southern blot方法检测杂交结果。结果 胎盘基因组DNA中有－10．0kb的HindⅢ片段可同时与5'Sμ探针和3'Sμ探针杂交,而骨髓瘤细胞系KM3基因组DNA中除有一相同的10．0kb的HindⅢ片段外,还有1个5．6kb的HindⅢ片段,仅与3'Sμ探针杂交。结论 骨髓瘤细胞系KM3存在1个由IgH基因易位引起的异常重组片段,且IgH易位的断裂点在Sμ区。     

志贺氏菌DNA基因探针检测粪便中痢疾杆菌

从患者粪便中检测志贺氏菌一般需48～72h,方能作出报告.本文用福氏志贺菌5型的侵袭性基因,通过Cosmid 重组质粒克隆,提取质粒DNA,酶切取17kb 片段,用~(32)P 标记制备志贺氏菌DNA 基因探针(sh-DNA-p),来检测粪便标本中痢疾杆菌.     

人宫颈癌DNA与HPV16型核酸分子杂交的研究

本文以人乳头状瘤病毒(HPV)16型-PBR_(322)重组质粒,对大肠杆菌HB101进行转化实验。经筛选、扩增、酶切、电泳鉴定。获得满意的电泳图谱及kb值,HPV-16Bam HI DNA为7.2kb,其260/280O.D比值为1.9-2。纯度合乎要求,可用以制备探针。以HPV-16DNA7.2kb片段为探针,应用~(32)P(α)-dATP标记进行了点杂交及Southern印迹杂交实验。结果表明38例宫颈癌组织DNA,其点杂交阳性率为76.3％,Southern杂交阳性率为65.7％。点杂交与Southern杂交结果基本符合。上述结果说明了在人宫颈癌组织中,存在着HPV-16相关的基因组,Southern杂交表明其以整合形式存在。说明宫颈癌的发病可能与HPV-16型的感染有密切关系。从分子水平进一步探讨了宫颈癌的病毒病因。     

MDS和急非淋未见免疫球蛋白和T细胞受体基因重组

72例MDS中RA26例、RARS 8例、RAEB 14例、RAEBt 14例、CMML 10例;17例急非淋中M13例、M210例、M43例、M51例。MDS均在化疗前抽取骨髓标本,急非淋10例在诊断时、7例在复发时抽取。DNA分析用常规分子杂交技术,每份标本至少用下列两种限制性内切酶:HindⅢ、Bam HI、EcoRI和BglⅡ,DNA水解片段先在0.8%琼脂上电泳,尔后转移到尼龙纤维上,在适当的条件下杂交,最后自显影成像。基因探针共3种:免疫球蛋白重链结合区探针、T细胞受体β链稳定区基因探针和T细胞γ链结合区基因探针。结果所有病人的标本呈现正常的免疫球蛋白和T细胞受体α及β链基因排列,未见异     

缺少血小板生成素受体c-mpl的小鼠缺乏多系造血祖细胞并有巨核系造血缺陷

作者研究了用基因打靶造成血小板生成素受体编码基因缺陷后小鼠的造血状况。 首先,在体外构建成带β-gal-含PGKneo的暗盒并以此置换c-mpl外显子1～5的核苷酸序列位置,将c-mpl基因组DNA3′末端8.3kb的Hind Ⅲ片段连接到β-gal-PGRneo基因的3′端,从而形成c-mpl基因的打靶载体(14.5kb),酶切分离后得到14.5kb的打靶基因片     

纯合子与杂合子重型VWD病人和携带者的VWF基因缺失

von Willebrand因子(vWF)是一个存在于血浆中与FⅧ非共价结合的大分子糖蛋白,其质与量的异常均导致血管性假血友病(vWD)。作者为提高对纯合子与杂合子重型vWD的鉴别诊断水平,应用了Slot-blot技术从基因水平上对5个vWD家族进行了研究。本文作者首先把定量的患者DNA固定到Zetabind膜上再分别与两个vWFcDNA探针(LEX,5(?)端;K2,3(?)端)及β珠蛋白探针逐次地进行杂交,然后放射自显影,经激光扫描仪定量扫描,分别计算出LEX/β及K2/β的比值。结果表明,G家族中有4例患者,其LEX/β和K2/β均为O,作者还用了另外1个vWFcDNA探针(从5(?)至中间部分)进行检测,结果同上,从而证实这     

离子特异性DNA酶在人体重金属含量检测中的应用

20世纪90年代以来,研究人员逐渐发现了多种具有特定生物催化功能的DNA分子,即DNA酶.离子特异性DNA酶是上述DNA中特殊的一类.该酶是具有离子结合特异性的DNA分子片段[1-5],这些片段和某种特定离子结合后可以被活化成为一种核酸内切酶,能够将与之序列互补的核酸链切断[6-9],因此被称为离子特异性DNA酶.目前在分子诊断中一般通过多种方法筛选得到目的离子特异性DNA酶,随后构建相应的离子特异性DNA酶生物传感器(探针)用于离子浓度的检测.     

用生物素标记的等位基因特异性探针直接检测β地中海贫血病人的突变基因

β珠蛋白基因的βIVS~(1-6),BIVS~(1-110)和β~(39)位突变是引起地中海人群中三种最常见的地中海贫血基因。作者用多聚酶链式反应(PCR)对1个含536个碱基对的片段(包括了上述突变位置)进行了扩增,用生物素-16-dUTP对βVS~(1-110)位突变特异的寡核苷酸探针进行标记,标记探针与PCR扩增产物杂交,然后通过颜色反应法(采用底物和酶结合物)直接测定纯     

两种DNA探针在肺炎链球菌DNA检测中的应用价值

目的研究寡核苷酸探针和长链DNA探针在肺炎链球菌检测中的诊断价值。方法合成肺炎链球菌特异的21bp寡核苷酸探针和263bp长链DNA探针并用生物素标记,两种探针分别与细菌全染色体DNA进行斑点杂交,比较两种探针检测痰液标本的敏感性和特异性,并与痰培养法比较。结果寡核苷酸探针和263bp探针检测肺炎链球菌基因组DNA的敏感性分别是100ng和1ng。培养法和杂交法同时检测100份痰标本,培养法、21bp探针和263bp探针的阳性检出率分别是7%、6%和17%。结论263bp长链DNA探针是检测肺炎链球菌DNA的较佳选择。     

串联重复序列信号放大液相杂交检测HBV-DNA技术的建立及评价

目的 建立串联重复序列信号放大(TRSE)液相杂交系统检测HBV-DNA技术,并初步评价其效果。方法 在前期研究构建的含24个60 bp串联重复核酸片段的重组噬菌粒中,插入4个HBV DNA片段而构建成一级检测探针,并结合12个串联重复的二级放大探针和标记的三级探针,建立检测HBV DNA的TRSE液相杂交系统。采用含HBV全基因组的重组质粒DNA对355份肝炎患者或正常人群的血清样本进行检测,评价该系统的效果。结果 在检测探针的一侧插入HBVDNA片段后,建立了HBV DNA的TRSE液相杂交检测系统。检测含HBV全基因组的重组质粒DNA的敏感性为8.33×104拷贝/ml。检测血清样本时,可区分HBeAg阳性与阴性患者间的HBV DNA水平差异。结论 TRSE液相杂交检测HBV DNA系统具有较好的敏感性、特异性和实用性。串联重复核酸序列信号放大的模式具有进一步开发利用的价值。     

长聚合酶链反应（LPCR）的进展

聚合酶键反应（PCR）是一种体外扩增DNA的有效技术。目前该技术主要用于扩增数百个到上千个碱基对（kb）的DNA片段。但是在许多分子遗传学研究中，如基因图谱分析，则需扩增更长的DNA片段才有价值。长片段DNA的PCR扩增近年已有报道[1]，例如选择不同的耐热DNA聚合酶、改过缓冲浪成份及循环条件等，可以扩增出10～15kb的片段，但产量低，多数实际应用仍限制于5kb以内。直到1994年，Barnes［2］和Cheng［3］等对DNA合成中碱基错配现象和模板DNA的损伤两个问题进行了研究并探讨了解决办法，其结果使PCR扩增）噬菌体DNA达42kb，扩…     

实时荧光PCR熔解曲线法在β-地中海贫血基因诊断和产前诊断中的临床应用评价

目的 对荧光PCR熔解曲线法用于β-地中海贫血(β-地贫)基因诊断和产前诊断进行临床评价.方法 收集2011年1至8月柳州市妇幼保健院外周血标本451份,其中经血液学表型分析为β-地贫阳性表型标本372份,β-地贫阴性表型标本79份.同时收集2011年6至9月夫妇双方经PCR-RDB探针法确诊为β-地贫基因携带者,在我院行β-地贫产前诊断的胎儿绒毛、羊水及脐带血标本共84份,其中孕10～ 13周胎儿绒毛标本16份、孕16 ～24周羊水标本64份、孕17周以上胎儿脐血标本4份.按双盲对照试验,分别采用荧光PCR熔解曲线法(可检测24种β珠蛋白基因突变)、PCR-反向点杂交(RDB)探针法(可检测17种β珠蛋白基因突变)和DNA测序法同时对451份外周血标本和84份胎儿绒毛、羊水、脐带血产前诊断标本进行检测.计算荧光PCR熔解曲线法和PCR-RDB探针法、DNA基因测序法检测结果的野生型符合率、突变型符合率和总符合率.结果 利用荧光熔解曲线法在451份外周血标本中共检出13种突变类型、19种基因型,其中有447份标本与PCR-RDB探针法的基因型检测结果相符,符合率为99.1％ (447/451),902个等位基因位点检出符合率为99.6％(898/902),有4份标本与PCR-RDB探针法的基因型检测结果不相符,经DNA测序法验证,有3份标本与荧光熔解曲线法的检测结果完全一致,1份标本的β珠蛋白基因突变不在荧光熔解曲线法检测范围而未被检出.450份外周血标本的荧光熔解曲线法检测结果与DNA测序法相符,符合率为99.8％ (450/451).利用荧光熔解曲线法在84份产前诊断胎儿标本中共检出8种突变类型、18种基因型,168个等位基因位点的检测结果与PCR-RDB探针法和DNA基因测序法检测结果符合率为100％.结论 荧光PCR熔解曲线法可同时检测多份待测标本,并可准确检出多种基因突变类型,可用于β-地贫的基因诊断和产前诊断.     

急性原粒细胞白血病母细胞内原癌基因c-kit的表达

作者用人c-kit(人HFB-c kit/171)探针(1.3kb片段)经P~(32)-dCTP标记后,与抽提的RNA标本(15μg)进行杂交(Northern分析).结果:21例急粒(M1:初起3例,复发6例;M4:初起6例,复发4例;M5:初起复发各1例)的RNA均显示5kb附近的单条带.急淋病人的RNA均无kit表达.HL-60,OCI/AML-1,OCI/AML-2和OCI/AML-3细胞的RNA用Northern分析均不能测出c-kit.3例经ficol hypaque分离的正常骨髓,和PHA处理的T淋巴细胞的RNA亦无c-kit.虽然每个白血病病人母细胞的特点有显著差     

使用经固定细胞的DNA检测Prader-Willi综合征

目的探讨以外周血染色体检查或荧光原位杂交(FISH)检查剩余的固定细胞作为DNA来源,采用甲基化特异性(MS)聚合酶链反应(PCR)与甲基化特异性多重连接探针扩增(MS-MLPA)方法进行Prader-Willi综合征(PWS)分子检测的可行性,为采用少量全血液样本同时开展染色体、FISH和分子检测奠定基础。方法将13例受试样本分为正常对照组(3例)、确诊组(2例)和疑似组(8例)3个组。将所有的冻存固定细胞进行离心,弃固定液,采用基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取,13例PWS样本同时采用MS-PCR与MS-MLPA进行检测。结果 13例DNA样本的A260/A280比值平均为1.94±0.1、浓度平均为(64.0±10)ng/μL、片段大小均在10 kb以上;MS-PCR检测发现正常对照组父源与母源条带均存在,确诊组仅存在母源条带、父源条带缺失,疑似组父源与母源条带均存在;MS-MLPA结果表明除确诊组2例提示为父源缺失型PWS外,其余2个组结果都提示为正常。结论来源于固定细胞的基因组DNA在纯度、浓度及完整性方面均可满足MS-PCR以及MS-MLPA检测的实验要求,可用于PWS临床分子检测及其相关实验。     

炭疽芽孢杆菌基因芯片探针的制备

目的制备炭疽芽孢杆菌(BA)基因芯片探针,应用于BA基因芯片的检测。方法采用PCR方法,以BA疫苗株A16R基因组DNA为模板,扩增pXO1质粒上的8个特异性片段,连接至pMD19-T Simple载体,构建分别包含8个探针序列的重组质粒,以其为PCR扩增模板获取探针DNA。结果基因测序证明,成功获得BA的3个探针。结论 BA基因探针的成功获取,为炭疽芽孢杆菌基因芯片的制备奠定了基础。     

淋巴增生疾患中的免疫球蛋白和T细胞受体基因重组及原位免疫表型

作者在45例淋巴增生疾患的活检标本中按照WF进行组织形态分类、用免疫组织化学染色(Slg、CD-10、CD-19、CD-22、CD-21、CD-24、CD-9、HLA-DR、CD-3、CD-8、CD-4、CD-5、CD-1、CD-38、Leu7、Leu8及CD-15抗体)、及用DNA探针(Ig重链、Igκ轻链、Igλ轻链、TCRγ及TCRβ)作Southern Blot分析。结果免疫表型为B系的19例、T系3例,另3例不能确定。用DNA杂交技术,19例B系均有Ig重链重组,2例蕈样霉菌病有TCRβ基因重组,另1例免疫组织化学定为     

微阵列比较基因组杂交技术与二代基因测序检测拷贝数变异的对比

目的 对比分析微阵列比较基因组杂交技术(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)和第二代基因测序技术(next generation sequencing,NGS)在基因组拷贝数变异(copy number variation,CNV)上的一致性,为临床检测CNV提供新的检测方法. 方法 提取15例流产组织临床样本的基因组DNA,然后分别使用aCGH和NGS 2种方法对上述DNA进行检测,分析对比每个样本的CNV的数目. 结果 aCGH共检测到CNV数有109个,最小的片段有16 kb,最大的片段有34Mb,其中小于200 kb的有20个,大于200 kb小于1 Mb的有34个,大于1 Mb小于5 Mb的有26个,大于5 Mb小于34Mb的有29个.NGS共检出68个CNV,其中小于200 kb的有3个,检出率为15.0％;大于200 kb小于1 Mb的有22个,检出率为64.7％;大于1 Mb小于5 Mb的有20个,检出率为76.9％;大于5 Mb小于34 Mb的有29个,检出率为100.0％. 结论 对于目前的数据量来说,NGS在检测大于5Mb的大片段CNV上检出率较高,与aCGH具有一定的一致性,可以应用于流产组织中CNV的检测.对于小片段的CNV的检测,需要增加相应的读取的数据量进行检测.     

PCR检测幽门螺杆菌

作者从幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)克隆库中随机选择一1.9-kb 染色体DNA 片段作为一潜在的探针。此探针检出了送检的全部19株幽门螺杆菌:用于检测其它对照的32类不同细菌共306株,其特异性为98.7%,作者认为极少量的假阳性是由于载体序列被污染所致。从上述1.9-kb 片段中取出一对各20个碱基的寡核苷酸当引物,分别为CAM-2(5′-CATCTTGTTAGAGGGATTGG-3′)和CAM-4(5′—TAA     

DNA芯片快速检测耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的 开发快速检测耐利福平结核分枝杆菌(结核菌)rpoB基因突变的DNA芯片。方法 根据结核菌rpoB基因序列设计探针并制作基因芯片，从临床样品中分离出结核菌的基因组DNA，PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段，荧光标记后与芯片上含有的检测特异突变位点的寡核苷酸探针进行杂交，同时与DNA直接测序法测定序列比较。结果 35株耐利福平结核菌中有91．4％(32／35)用直接测序法检测出存在rpoB基因突变，DNA芯片的检测效率为71．4％(25／35)。结论 用DNA芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的特异性和敏感性，可用于临床结核菌耐药性检测。     

全自动提取大量全血样本基因组DNA方法的建立及其在HLA基因分型中的应用

目的 研究和建立从大量全血样本中提取基因组DNA的有效方法,以应用于Luminex HLA 流式磁珠基因分型.方法 使用自动工作站(瑞士TECAN公司)提取基因组DNA,提取的DNA样本用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,DNA的完整性用琼脂糖电泳检测,并统计分析每一DNA样本流式磁珠HLA-A、B和DRB1基因扩增产物经探针分子杂交后的荧光信号强度.结果 从60μl全血中提取基因组DNA,产量平均为(1.584±0.824)μg,样本的A260/A280值平均为1.741±0.229.琼脂糖电泳法测得DNA的分子量约为21kb.结论 本方法适用于从大量全血样本中快速提取基因组DNA,所得基因组DNA适用于高通量HLA流式磁珠基因分型等下游的分子生物学实验.