重组汉坦病毒包膜糖蛋白G1、G2基因体内外表达的评价

目的　构建分别编码汉坦病毒浙 37(Z37)株包膜糖蛋白G1、G2的真核表达质粒 ,并在离体及活体内评价重组汉坦病毒 (HV)包膜糖蛋白G1、G2基因的表达。方法　将编码G1、G2的基因片段分别插入至真核表达载体 pcDNA3.1( ) ,获重组质粒pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2。在体外转录翻译系统和真核细胞中表达重组基因 ,并在BALB/C小鼠中评价包膜糖蛋白G1、G2所激发的特异性体液免疫应答效果。结果　重组质粒pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2转染COS 7细胞后 ,IFA法可检测到细胞内有特异性荧光分布 ;在体外蛋白质转录、翻译系统 ,重组质粒 pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2所表达的蛋白质分子量分别约为 70KD及 5 5KD ;在免疫的部分小鼠体内可检测到特异性抗体。结论　成功地构建了分别编码HVZ37株包膜糖蛋白G1、G2的重组质粒 ,并能在体内外表达     

在大肠杆菌中分别表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1和G2

利用PCR方法扩增了汉滩病毒76-118株囊膜糖蛋白G1和G2的编码区基因,并将PCR产物克隆到T-载体中,用限制性内切酶将G1和G2的编码区基因切下,并克隆到表达载体pBV220中构建G1和G2的表达质粒.诱导表达后在SDS-PAGE凝胶中未见表达产物带,表达的G1和G2能与部分抗G1和G2的单克隆抗体发生反应,但用Western-blot方法不能检测到表达产     

结核分枝杆菌热休克蛋白65与汉坦病毒G2糖蛋白融合基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65（HSP65）和汉坦病毒G2糖蛋白重组融合基因为基础的真核表达载体。为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定基础。方法 采用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv株基因中．扩增出HSP65的编码基因，从T-H8205G2质粒扩增出G2糖蛋白的编码基因．经相应限制性核酸内切酶消化后．插入真核表达载体pcDNA3．1／His，并将此重组质粒通过脂质体介导转染NIH3T3细胞．用SDS-PAGE、免疫组织化学及免疫荧光方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果 获得正向插入的pcDNA3.1/ His-HSP65-G2重组表达质粒，表达产物的相对分子量为105kD．与理论预期大小一致．并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体和HSP65单抗起特异反应。表明构建的pcDNA3．1／His-HSP65-G2能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性。结论 编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功。     

HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型包膜糖蛋白gp120基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,进一步为制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gp120基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5'端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性地扩增gp120基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gp120编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1( )/gp120。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gp120基因的细胞系,用RT-PCR及Westernboltting检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.44kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1( )中插入了gp120基因片断,测序结果表明编码框正确。RT-PCR及Westernblotting证实稳定转染gp120基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因的真核表达载体pcDNA3.1( )/gp120,并在HepG2细胞中获得稳定表达。     

HSV—1包膜糖蛋白G原核表达克隆的构建和表达

①目的 构建人单纯疱疹病毒1型Stoker株包膜糖蛋白G编码基因（Us4）片段的原核表达克隆,并进行原核表达。②方法 通过PCR方法增扩HSV-1Us4基因的抗原决定簇编码区,目的基因与原核表达载体PGEX-4T-2分别比双酶切后连续,然后转化宿主菌Ecoli.BL21,IPTG诱导表达。③结果 获得了重组的原核表达质粒及重组蛋白。④结论 用限制性内切酶鉴定原核表达质粒构建成功,SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达成功。     

HIV-1 B亚型包膜糖蛋白gp41基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型包膜糖蛋白gp41基因并构建真核表达我体，进一步为制备自行设计的以λ噬茵体作为栽体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以 克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板，根据Genbank中gp41基因的核苷酸序列设计引物，并在引物的5’端分别引入Kpn Ⅰ及Xho.Ⅰ酶切位点，特异性的扩增gp41基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒，再经双酶切、连接构建含gp41编码基因的真核表达栽体，并进行酶切及测序鉴定分析peDNA3、1（＋）／gp41。结果 重组质粒经Kpn Ⅰ，XhoⅠ双酶切成5、4kb与1．0kb的片断，表明表达载体peDNA3、1（＋）中插入了gp41基因片断，测序结果表明编码框正确。结论 成功构建了HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp41基因的真核表达栽体peDNA3．1（＋）／gp41。     

汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G2-IL-2嵌合基因的稳定表达

目的 探讨汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G2-IL-2嵌合基因（IL-2-G2）在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞获得稳定表达可溶性融合蛋白的可行性。方法 将人源IL-2基因与汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G2的cDNA分别克隆于真核表达载体pcDNA3．1-HisB，构建重组真核表达载体pcDNA3．1HisB-IL2G2，在脂质体介导下，将其导入cHO细胞，通过G418筛选获得阳性克隆，并继续培养6周，然后用原位杂交、ELISA、SDS-PAGE电泳方法检测IL-2-G2基因在CHO细胞中的稳定表达情况。结果 经原位杂交和SDS-PAGE电泳证实，转染pcDNA3．1-HisB-IL-2-G2的CHO细胞内有IL-2-G2的mRNA转录，且在培养上清和CHO细胞胞质中有融合蛋白的表达，经人IL-2 ELISA检测试剂盒检测证实在培养上清和细胞裂解物中所表达的融合蛋白有IL-2特性。结论 在脂质体介导下，外源性IL-2-G2嵌合基因能够成功导入CHO细胞并获得稳定表达。     

结核杆菌HSP65与汉坦病毒H8205株G2基因的构建

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65和汉坦病毒G2重组融合基因为基础的核酸疫苗。方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中，扩增出HSP65的编码基因，从T—H8205G2质粒扩增出G2蛋白的编码基因，经相应限制性核酸内切酶消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1／His，并将此重组质粒通过酶切、SDS—PAGE分别测定表达产物的相对分子量。结果 获得正向插入的pcDNA3．1／His—HSP65-G2重组表达质粒，与理论预期大小一致。结论 以编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功，为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定了基础。     

汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白基因表达载体的构建及表达

摘要：目的构建汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白G1、G2的真核表达载体并将其在Vero E6细胞中进行表达,观察细胞融合现象。方法采用PCR和基因克隆技术,将GM04 38株G1、G2基因分别克隆到表达载体pCAGGS／MCS,酶切和测序鉴定正确后,将表达载体pCAGGS-G1、pCAGGS-G2共转染Vero E6细胞,酸性MEM处理后观察细胞融合现象的产生,并以间接免疫荧光试验(IFA)观察糖蛋白的表达情况。结果显示在Vero E6细胞中成功表达出糖蛋白G1、G2,IFA显示荧光信号分布在细胞浆中。二者的共表达可产生良好的生物学活性,在偏酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合,而转染pCAGGS-NP的细胞没有融合现象发生。共表达也未出现明显的促进效应。结论成功构建了糖蛋白G1、G2的表达载体,并在Vero E6细胞中呈有效表达,二者的共表达可在偏酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D酵母表达载体的构建

目的:构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础.方法:应用PCR方法从HSV-Ⅰ基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD.结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%.结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒.     

汉滩病毒西安分离株84FLi M片段的克隆

目的:克隆汉滩病毒84FLi株M片段的cDNA. 方法:提取病毒总RNA,反转录为cDNA模板,用高保真的Taq酶扩增出G1和G2两个糖蛋白编码的基因片段:84M2.0(1～2058)和84M1.6(1964～3616). 将这两个片段分别与T载体-pMD18-T连接,转化感受态大肠杆菌后获得两个分别为G1和G2编码的克隆pMD84M2.0和pMD84M1.6. 再利用酶切连接的方法获得M片段全序列的cDNA克隆. 结果:获得两个分别为G1和G2糖蛋白序列编码的克隆,进而酶切组装为含有M片段全序列的cDNA克隆. 结论:获得了84FLi株M片段全序列的cDNA克隆.     

汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白M的基因克隆与序列分析

目的：建立汉坦病毒（HV）包膜糖蛋白M的克隆载体;研究M基因的变异情况,并对其序列进行系统发生树分析。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增GM04—38M片段的基因。产物纯化后克隆于PMD-18T载体。经氨苄青霉素筛选,酶切鉴定,并进行序列测定,应用DNASTAR软件将它与世界范围内分离的病毒株同一基因序列分析比较。结果：筛选出含有HVM蛋白基因的克隆。GM04—38株M片段的全基因序列共3651个核苷酸。4种核苷酸的比例分别为：A30．46％。T30．13％,G20．84％。C18．57％。序列同源分析表明。GM04—38株与Z37株核苷酸同源性最高（97.3％）。属于SEO型HV。与其他SEO各株的差别均小于18．0％：绘出了核苷酸系统发生树。结论：成功地建立汉坦病毒M蛋白基因克隆载体：中国不同地区汉坦病毒流行株基因序列存在明显差异。这为研究HV遗传与变异以及制备有效的亚单位疫苗奠定了基础。     

汉滩病毒西安分离84FLi的M片段全基因序列测定及分析

目的 测定我国肾综合征出血热患者流产胎儿肝脏分离病毒84FLi株的全M片段基因序列，了解其分子基础。方法 采用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR），分节段扩增M基因片段的cDNA，直接用PCR产物或克隆人pMD18-T载体后进行测序。结果 84FLi株的全M基因序列组成为：M片段基因共由3616个核苷酸组成，四种核苷酸的比例分别为A30．92％，C18．03％，G21．18％，T29．87％。GC含量为39．21％，AT含量为60．79％，最大开放读码框为41－3448，共编码1135个氨基酸。核苷酸序列同源性分析表明84FLi株与HTN型同源性高于与其他型汉坦病毒的同源性，其中与中国株的同源性较高，与HV114株的同源性为85．5％。与HTNV的国际标准毒株76－118的核苷酸同源性分别为84．0％，氨基酸的同源性为96．0％。结论 84FLi株属于汉滩型病毒，并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高。     

中国汉坦病毒H82O5株G2糖蛋白基因的克隆及在真核细胞中的瞬时表达

从感染病毒乳鼠脑组织提取总RNA，采用RT－PCR和分子克隆技术将扩增到的G2糖蛋白基因插入含CMV启动子的pcDNA3.1/His质粒载体中，通过脂质体介导转染COS－7细胞，用SDS－PAGE、Western-blot及IFIA方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果证明获得正向插入的G2－pcDNA3.1/His重组表达质粒，表达产物的相对分子量为56ku，与理论预期大小一致，并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体起特异反应。表明构建的G2－pcDNA3.1/His重组质粒所表达的蛋白为中国汉坦病毒株特有，能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性，重组质粒可应用于汉坦病毒的DNA疫苗研究。     

稳定表达人骨形成蛋白2成纤维细胞的建立与鉴定

目的 探讨ＢＭＰ对细胞分化的调节作用,为ＢＭＰ基因疗法的建立提供依据。方法 构建了含有人ＢＭＰ２开放阅读框（１．２ｋｂ）的真核表达载体ｐＢＫ－Ｂ２利用脂质本转染方法将其导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,通过Ｇ－４１８筛选获得了性细胞克隆,细胞原位杂交和免疫组化检测ＢＭＰ２基因的稳定转染及表达情况。结果 转染细胞内有ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的转录及其蛋白的表达,结论：人ＢＭＰ２基因ＮＩＨ３Ｔ３细胞中得到稳定有效的方法。     

汉坦病毒H8205株M-IL-2融合基因的构建

目的研究汉坦病毒新型裸DNA疫苗,构建融合基因pcDNA3.1/HisBIL2M(G1 G2)。方法采用PCR扩增汉坦病毒H8205株G1和G2基因片段,将回收的G1和G2片段经双酶切插入到pcDNA3.1/HisBIL2,构建成新的质粒pcDNA3.1/HisBIL2M。结果融合基因转录一分子量为100kD左右的蛋白,对照组则未见电泳条带出现,回收的片段与预期的相符。结论成功构建pcDNA3.1/HisBIL2M融合基因。     

HSV-2糖蛋白D在昆虫-杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析

目的：在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒（HSV-2）糖蛋白D（gD2）胞外区基因,检测其免疫原性。方法：以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4代重组杆状病毒（P4）,通过Western blotting法鉴定蛋白表达情况,采用空斑实验检测重组病毒滴度,将P4代重组病毒作为种子大量感染sf9细胞,上清经镍柱亲和层析进行纯化,将纯化后的蛋白在第0、2和4周免疫BALB/c小鼠（gD2组）,以PBS作为阴性对照（PBS组）,ELISA检测小鼠血清中gD2特异性IgG滴度。结果：PCR鉴定和DNA测序,重组表达质粒gD2-Bacmind构建正确,空斑实验检测重组病毒滴度为2.0×10⁹ pfu·mL^-1,纯化的gD2重组蛋白在相对分子质量37000处出现目标条带,纯度达90%以上。第6周gD2组小鼠免疫血清中gD2特异性IgG抗体滴度Log10平均值达到4.34,与PBS组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：利用昆虫-杆状病毒表达系统表达的gD2胞外区蛋白具有良好的免疫原性,可作为HSV-2疫苗的候选。