PCR法筛选日本血吸虫cDNA文库中磷酸丙糖转移酶基因

目的：用PCR法自日本血吸虫童虫cDNA文库到丙糖转移酶（TPM）基因，为进一步亚克隆和表达奠定基础。方法：根据GeneBank中日本血吸虫TPM基因开放阅读框设计合成一对引的，应用PCR测定cDNA文库中该基因的频率。根据测得的频率，将适量的噬功体接种于96孔细胞培养板上进行细菌培养扩增。再利用PCR是性克民在位置，经过选择性扩增，筛选出阳性克隆，并环化成质粒，经测序验证后构建pGEM-T/TPM克隆载体。结果：经过3轮筛选，所得阳性克隆经过测序，用Genebank BLAST进行序列比较，证实为日本血吸虫磷酸丙糖转移酶基因。重组质粒pGEM-T双酶切证实有约760bp的插入片段。结论：从日本血吸虫cDNA文加中筛选出TPM基因，并成功地构建该原克隆载体，为研究该基因在血吸虫糖代谢中的作用创造了条件。     

日本血吸虫成虫抗原基因的克隆和序列分析

本实验在用感染兔血清和单克隆抗体对日本血吸虫（大陆株）成虫ｃＤＮＡ表达文库进行筛选的基础上，对筛选出的阳性克隆插入片段ＤＮＡ进行了亚克隆和序列分析。     

日本血吸虫成虫抗原基因的克隆和序列分析

本实验在用感染兔血清和单克隆抗体对日本血吸虫（大陆株）成虫ｃＤＮＡ表达文库进行筛选的基础上，对筛选出的阳性克隆插入片段ＤＮＡ进行了亚克隆和序列分析     

日本血吸虫精氨酸酶编码基因cDNA的分离和序列分析

目的：分离和鉴定日本血吸虫（Schistosoma japonicum,S.j)新基因。方法：应用免疫学方法筛选S.j.cDNA库获得阳性克隆;通过PCR直接序列测定技术,表达序列标答（EST）同源性检索对阳性克隆插入片段进行鉴定／采用亚克隆技术及生物信息学等技术,对获的日本血吸虫精氨酸酶编码基因序列进行结构与功能的分析。结果：获得了一个含1061bp外源插入片段的阳性克隆,其cDNA序列含有一个804bp的阅读框,编码279个氨基酸,属精氨酶家族,与国际蛋白质库中的酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为44％,50％,51％,53％和54％,结论获得了编码日本血吸虫精氨酸酶编码基因全长cDNA,为日本血吸虫精氨酸酶基因功能的研究奠定了.     

日本血吸虫精氨酸酶编码基因cDNA的分离和序列分析

【目的】分离和鉴定日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,S .j)新基因。【方法】应用免疫学方法筛选S .jcDNA文库获得阳性克隆 ;通过PCR直接序列测定技术 ,表达序列标签 (EST)同源性检索对阳性克隆插入片段进行鉴定 ;采用亚克隆技术及生物信息学等技术 ,对获得的日本血吸虫精氨酸酶编码基因序列进行结构与功能的分析。【结果】获得了一个含10 6 1bp外源插入片段的阳性克隆 ,其cDNA序列含有一个 840bp的阅读框 ,编码 2 79个氨基酸 ,属精氨酸酶家族 ,与国际蛋白质库中的酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为 44 % ,5 0 % ,5 1% ,5 3%和 5 4%。【结论】获得了编码日本血吸虫精氨酸酶编码基因全长cDNA ,为日本血吸虫精氨酸酶基因功能的研究奠定了基础。     

日本血吸虫精氨酸编码基因CDNA的分离和序列分析

【目的】分离和鉴定日本血吸虫(Schistosomajaponicum,S.j)新基因。【方法】应用免疫学方法筛选S.jcDNA文库获得阳性克隆;通过PCR直接序列测定技术,表达序列标签（EST）同源性检索对阳性克隆插入片段进行鉴定;采用亚克隆技术及生物信息学等技术,对获得的日本血吸虫精氨酸酶编码基因序列进行结构与功能的分析。【结果】获得了一个含1061bp外源插入片段的阳性克隆,其cDNA序列含有一个840bp的阅读框,编码279个氨基酸,属精氨酸酶家族,与国际蛋白质库中的酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为44%,50%,51%,53%和54%。【结论】获得了编码日本血吸虫精氨酸酶编码基因全长cDNA,为日本血吸虫精氨酸酶基因功能的研究奠定了基础。     

免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库基因的亚克隆与鉴定

目的 亚克隆免疫筛选日本血吸虫ｃＤＮＡ文库得到的基因。方法 在体外将血吸虫ｃＤＮＡ文库基因的ＰＣＲ产物和ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接,转染大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,经抗生素及呈色底物Ｘ－ｇａｌ粗筛,再用限制性内切酶及ＰＣＲ方法进一步鉴定。结果 成功地将文库中４个大小不同的日本血吸虫基因片段连接到载体中,获得４个重组子。结论 为可能编码保护性抗原的血吸虫基因测序和将其亚克隆入真核表达质粒奠定基础。     

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增和克隆

目的　克隆日本血吸虫卵壳蛋白基因 ,以研究其在诊断和作为候选疫苗分子的作用。方法　设计合成引物 ,以日本血吸虫雌性成虫cDNA第一链为模板 ,用PCR法扩增日本血吸虫卵壳蛋白 (SchistosomajaponicumeggshellproteinSjEP)基因编码序列 ,并克隆入pGEM T质粒载体。结果　PCR法扩增出大小为 62 4bp的单一条带 ,将其克隆入载体获重组质粒 pGEM T SjEP ,经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增 ,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段。结论　日本血吸虫卵壳蛋白的编码基因重组质粒的成功构建 ,为进一步研究提供了条件。     

湖南省日本血吸虫线粒体coxl基因部分序列多态性的研究

目的研究湖南省日本血吸虫不同自然隔离群的线粒体细胞色素c氧化酶亚基1基因（coxl）部分序列（pcoxl）的变异，为阐明我国日本血吸虫的种群遗传结构奠定基础。方法采用聚合酶链反应（PCR）技术对湖南省岳阳君山、汨罗的日本血吸虫的pcoxl片段进行扩增、克隆及序列分析。结果获得480bp的pcoxl序列。经DNAstar软件分析，pcoxl序列有一定的种内差异（0～1．2％）。结论本研究为阐明我国日本血吸虫的种群遗传结构提供了数据。     

日本血吸虫(大陆株)26ku谷胱甘肽转移酶基因真核表达载体构建及序列分析

目的　构建日本血吸虫大陆株 2 6ku谷胱甘肽转移酶 (GST)基因真核表达质粒 pBK SjGST并进行序列分析 ,为进一步进行重组蛋白的表达及保护性免疫研究提供条件。方法　根据日本血吸虫菲律宾株 2 6kuGST核苷酸序列 ,设计合成一对引物 ,以日本血吸虫中国大陆株成虫总RNA为模板 ,通过RT PCR合成日本血吸虫中国大陆株 2 6kuGSTcDNA片段。将其克隆入 pGEM T载体 ,经双酶切及PCR鉴定后 ,再亚克隆入 pBK CMV真核表达质粒 ,构建重组质粒pBK SjGST ,转化到大肠杆菌BL2 1感受态细胞 ,提取重组质粒双酶切鉴定并进行序列分析。结果　PCR、pGEM T SjGST及 pBK SjGST分别经双酶切获得一特异性基因片段 .经测序分析该片段具有一个 670bp的全基因序列 ,而其开放阅读框 (openreadingframe,ORF)为 65 7bp ,编码 2 18个氨基酸 ,并对其基因序列及编码的蛋白质进行了分析。结论　成功地构建了日本血吸虫中国大陆株 2 6kuGST基因真核表达重组质粒 ,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列蛋白激酶磷酸化位点进行分析     

人源日本血吸虫Fab抗体库的构建及抗独特型抗体的筛选、鉴定

目的:构建人源日本血吸虫Fab抗体库,筛选出日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定。方法:以3名晚期血吸虫患者切除的脾脏为源,构建人源日本血吸虫Fab抗体库。并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达。结果:构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,库容为4.3×106,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断。经过5轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取60个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(A3、B6、C4、C17),其中B6经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确。结论:成功构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体B6,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。     

大容量天然人源Fab抗体库的构建及日本血吸虫抗独特型抗体的筛选、鉴定

目的:构建大容量天然人源Fab抗体库,筛选全人源日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定。方法:采集15位健康成人的骨髓淋巴细胞,构建天然人源Fab抗体库。并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达。结果:构建了2×109大容量天然人源Fab抗体库,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断。经过6轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取80个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(C12、C19、D1、D2),其中C12经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确。结论:成功构建了大容量天然人源Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体C12,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。     

人蛋白质二硫键异构酶活性片段基因的克隆及序列测定

目的：获取人蛋白质二硫键异构酶活性片段基因，并进行序列测定，为今后研究其机理及应用创造条件。方法：从人胎肝组织中用反转录ｐＵＣ１９质粒载体，用双脱氧法双向测定目的基因序列。结果：从人胎肝组织中成功地扩增到ｈＰＤＩｆ基因，测出的序列与已知基因序列一致。结论：构建了ｈＰＯＩｆ基因的重组克隆，为以后的深入研究奠定了基础。     

HBV前S区的基因克隆及序列测定

获取ＨＢＶ前Ｓ区基因,并进行序列测定,为今后研究其机理及应用创造条件。方法：用ＰＣＲ方法从含ＨＢＶ基因组的模板中扩增ＰｒｅＳ基因,重组入Ｂｌｕｅ－ｓｃｒｉｐｔ载体,用自动测序仪,采用荧光素标记的引物,测定基因的序列,结果：成功地扩增到ＰｒｅＳＡＱ ＷＧ ＴＡ ＡＤ     

小鼠内皮抑素基因的克隆及序列测定

目的 获取小鼠内皮抑素（endostatin)基因并进行序列测定,为今后研究其机制及应用创造条件。方法 以小鼠肝脏总RNA为模板,用RT-PCR法从中扩增endostatin基因,并将所得基因重组入pUC19载体质粒,采用自动测定仪及荧光素标记引物,测定目的基因序列。结果 从小鼠肝组织中成功扩增endostatin基因,莘成功克隆入pUC19载体。经酶切鉴定正确后,命名为pUC-Endo。经测序证实所获基因序列与已知的endostatin基因序列一致。结论 成功构建小鼠endo-statin基因的重组克隆pUC-Endo,为今后利用endostatin进行胶质瘤的抗血管生成治疗研究奠定了实验基础。     

扬州地方株HPV16 L1基因的克隆及序列分析

目的：了解扬州地方株HPV16L1基因结构特点,为研制HPV16疫苗奠定基础。方法：从感染HPV16的宫颈癌组织中提取DNA,用PCR技术获得HPV16L1基因,以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析。结果：扬州地方株与德国标准株在核苷酸序列上有7处不同,其中4处由于核苷酸的改变,其编码氨基酸也相应发生变化,与标准株的同源性为99．7％;扬州地方株与中国株之间也存在1至2处核苷酸不同,但未造成氨基酸序列改变,其同源性为99．9％。结论：扬州地方株HPV16L1基因与标准株、中国株之间均存在差异,但与后者的差异极小,未造成氨基酸改变。