人脂肪来源干细胞的分离、培养及成骨分化的研究

目的体外分离、培养、扩增及鉴定人脂肪来源干细胞（human adipose-derived stem cells,hASCs）,并向成骨诱导分化,为临床骨组织重建提供种子细胞。方法应用胶原酶消化法和贴壁筛选法相结合从人手术切除的脂肪组织中提取hASCs。MTS法绘制hASCs生长曲线;利用流式细胞术检测hASCs表面标志;以低糖DMEM含10%FBS及1%青/链霉素为基础培养基,含1nM地塞米松,10mM磷酸甘油,0.05mM维生素C的条件培养基连续培养4w进行体外成骨诱导,并利用硫酸茜红素S（Alizarin Red S）染色检测钙沉积情况。结果成功从人脂肪组织中分离、提取了hASCs并在体外扩增。hASCs呈成纤维细胞样生长。生长曲线显示hASCs增生分裂能力活跃。hASCs表面标志表达CD29,CD44,CD73,CD105和CD166,不表达CD31,CD34,CD45和HLA-DR。成骨诱导4w后,经硫酸茜红素S染色可见：细胞呈复层生长,细胞外富集细胞外基质,基质经染色呈现橘红色,数量多,成结节状或成片状存在,并出现钙盐结节,证明有钙盐沉积。结论成功建立了一种简单有效的体外分离和培养hASCs的方法。获得的hASCs生长增殖旺盛、保存方便,具有多向分化能力。hASCs可以作为细胞移植治疗和组织工程理想的种子细胞。     

脂肪源性干细胞成骨分化过程中成骨相关miRNA的表达模式

背景:miRNA在细胞分化等众多生理病理过程中起重要调控作用,可调节脂肪来源干细胞成骨分化。目的:筛选成骨分化相关miRNA,分析miRNA在脂肪来源干细胞成骨分化过程中的表达模式。方法:从皮下脂肪组织中分离、培养人脂肪来源干细胞。应用基因芯片技术筛选脂肪来源干细胞成骨诱导前后表达差异显著的miRNA,采用RT-PCR技术检测所筛选的miRNA在成骨诱导第7,14,21天上调/下调的相对表达强度,以ELISA试剂盒检测相应时间点成骨相关蛋白的表达情况。结果与结论:①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的脂肪来源干细胞,一定诱导条件下具有成骨、成脂、成软骨分化能力。②基因芯片技术筛选出成骨分化前后表达差异变化明显的9个miRNA,其中5个上调,4个下调。③成骨诱导第7天,miR-106a表达上调1.58倍(P<0.05)。第14天时,9个miRNA均表达上调。第21天时,5个miRNA表达上调,4个表达下调。④成骨相关蛋白骨钙素、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及骨唾液酸蛋白的质量浓度在诱导成骨分化第7天即明显升高,第14天达到峰值,第21天略有下降。     

成人脂肪间充质干细胞的定向成骨诱导

背景：脂肪分离可获得大量的间充质干细胞并成功向骨、软骨、脂肪、心肌等多个方向诱导分化。 目的：建立成人脂肪间充质干细胞体外分离培养、成骨分化方法,并探讨脂肪间充质干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景。 方法：通过胶原酶消化法从成人脂肪中分离间充质干细胞,进行体外培养,流式细胞仪检测细胞表面标记物, CCK8检测细胞活性,成骨诱导液诱导干细胞向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶,骨桥蛋白表达变化。 结果与结论：利用脂肪抽吸液成功培养出脂肪间充质干细胞,且能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞仪检测证实有特定的间充质干细胞表面标记物表达;成骨诱导脂肪间充质干细胞后呈典型的成骨细胞形态;碱性磷酸酶染色阳性,茜素红染色后可见钙结节形成,成骨诱导培养0,3,7,14,21,28 d,RT-PCR定量检测结果证实碱性磷酸酶、骨桥蛋白阳性表达。说明用酶消化法可以从人脂肪中分离得到脂肪间充质干细胞;脂肪间充质干细胞可向骨细胞诱导分化,阳性表达骨桥蛋白,碱性磷酸酶,是一种优良的骨组织工程的种子细胞。     

脂肪源性干细胞成骨分化过程中成骨相关miRNA的表达模式

背景：miRNA在细胞分化等众多生理病理过程中起重要调控作用,可调节脂肪来源干细胞成骨分化。目的：筛选成骨分化相关miRNA,分析miRNA在脂肪来源干细胞成骨分化过程中的表达模式。方法：从皮下脂肪组织中分离、培养人脂肪来源干细胞。应用基因芯片技术筛选脂肪来源干细胞成骨诱导前后表达差异显著的miRNA,采用RT-PCR技术检测所筛选的miRNA在成骨诱导第7,14,21天上调/下调的相对表达强度,以ELISA试剂盒检测相应时间点成骨相关蛋白的表达情况。结果与结论：①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的脂肪来源干细胞,一定诱导条件下具有成骨、成脂、成软骨分化能力。②基因芯片技术筛选出成骨分化前后表达差异变化明显的9个miRNA,其中5个上调,4个下调。③成骨诱导第7天,miR-106a表达上调1.58倍（P〈0.05）。第14天时,9个miRNA均表达上调。第21天时,5个miRNA表达上调,4个表达下调。④成骨相关蛋白骨钙素、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及骨唾液酸蛋白的质量浓度在诱导成骨分化第7天即明显升高,第14天达到峰值,第21天略有下降。     

脂肪干细胞和生物支架应用于牙槽骨修复

背景：各种生理或病理因素导致的牙槽骨的吸收、缺损是口腔临床医学中的常见问题,但目前较常用的修复缺损牙槽骨的方法不能完全满足临床需要。骨组织工程的出现成为修复骨缺损的研究热点。     

同种异体脂肪干细胞复合脱钙骨支架材料修复兔胫骨缺损的实验研究

目的探讨同种异体脂肪干细胞复合脱钙骨支架材料修复兔胫骨缺损的实验研究。方法购自北京生物有限公司(动物实验中心)新西兰大白兔8对,其中2对白兔进行脂肪干细胞分离培养,并采用反复滴加方法将细胞均匀分布于支架材料上,获取脂肪干细胞复合脱钙骨材料。其中6对构建兔胫骨骨缺损模型,造模后即刻将单纯脱钙骨材料植入右侧缺损区设为对照组,将诱导后的兔脂肪干细胞-脱钙骨支架复合物植入左侧缺损区设为实验组。于术后12周采用空气栓塞处死大白兔,获取大白兔双侧后肢胫骨修复骨及其周围软组织,行Micro-CT和组织学检测,了解实验组和对照组白兔骨组织生长情况,兔脂肪干细胞-脱钙骨材料成骨表型测定体内降解情况和组织学检测结果。结果大体观察显示实验组白兔后肢骨缺损区可见骨样组织修复,对照组白兔为纤维样组织充填未见骨样组织覆盖;三维CT影像学显示实验组白兔骨缺损断端和材料接合部已充分融合且骨轮廓、光滑的骨塑形清晰可见,对照组白兔骨缺损处多为纤维性连接;HE染色下可见实验组白兔有典型再生骨组织、大量骨陷窝、骨细胞及部分骨小梁结构,对照组白兔为胶原纤维样组织和残留脱钙骨基质、无大片再生骨样组织。两组白兔Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性,细胞胞浆及胞外基质呈棕黄色,胞核呈蓝色,证实修复细胞表达Ⅱ型胶原,为软骨细胞。实验组和对照组白兔修复组织评分分别为(2.41±0.40)、(2.70±0.45)分,实验组白兔组织修复得分高于对照组白兔,差异有显著性(P<0.05)。结论兔脂肪干细胞接种于脱钙骨材料,经成骨诱导后具有较强成骨分化能力,能较好地修复兔胫骨骨缺损,具有较高临床疗效。     

骨髓间充质干细胞成骨分化中的微小RNA及Wnt通路

背景：有差异性表达的微小RNA在成骨细胞的增殖和分化中发挥广泛而又重要的作用,但其作用机制、作用靶点还不甚清楚,是近年来的研究热点。目的：对微小RNA通过Wnt信号通路调节成骨分化方面的研究现状及新进展作一综述。方法：应用计算机检索2000年1月至2012年1月CNKI和PubMed数据库,在标题和摘要中以＂MicroRNA,Wnt通路,成骨分化＂或＂MicroRNA,Wnt pathway,osteogenesis＂为检索词进行检索。选择文章内容与微小RNA经典Wnt通路促进成骨分化有关者,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志的文章。初检得到205篇文献,最终选择33篇文献进行综述。结果与结论：微小RNA是近年来生命科学的研究热点,越来越多的研究表明微小RNA作用于经典Wnt信号通路在成骨分化过程中发挥了重要作用。了解微小RNA在成骨分化中的调控机制是骨组织工程化培养的基础,具有巨大的应用前景。目前关于微小RNA的研究工作还处于起步阶段。     

兔自体脂肪干细胞成骨诱导后经皮注射修复骨缺损

目的:探索兔自体脂肪干细胞、成骨诱导后的脂肪干细胞联合骨形态发生蛋白-2/纤维蛋白胶(bone morphogenetic proein-2/Fibrin glue,BMP-2/FG)经皮移植到骨缺损后体内成骨能力的差异.方法:实验于2006-0812007-11在北京军区总医院全军骨科研究所完成.①实验材料:清洁级日本大耳白兔,2.0～2.5 kg,雌雄不限,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:制作新西兰大白兔桡骨中段15 mm骨缺损模型35侧,随机分为5组,每组7侧:未诱导细胞组、诱导细胞组、未诱导细胞 BMP-2/FG组、诱导细胞 BMP-2/FG组、空白对照组.未诱导细胞组、诱导细胞组直接用生理盐水重悬未诱导脂肪干细胞和经成骨诱导的脂肪干细胞,未诱导细胞 BMP-2/FG、诱导细胞 BMP-2/FG组分别用含20 g/L骨形态发生蛋白-2、5 g/L纤维蛋白原的生理盐水重悬未诱导和经成骨诱导的脂肪干细胞.⑨实验评估:X射线片观察各组骨缺损修复情况,并进行生物力学榆测.结果:①12周时,未诱导细胞 BMP-2/FG组、诱导细胞 BMP-2/FG组在骨缺损区新生骨的数晕明显优于未诱导细胞组、诱导细胞组(P均＜0.05).②术后4周x射线显示,未诱导细胞 BMP-2/FG组、诱导细胞 BMP-2/FG组阻射密度值高于其他组(P均＜0.05),未诱导细胞组与诱导细胞组无差别.术后8,12周时,诱导细胞组高于未诱导细胞组,未诱导细胞 BMP-2,FG、诱导细胞 BMP-2/FG组均高于其他组,诱导细胞 BMP-2/FG组高于未诱导细胞 BMP-2/FG组(P均＜0.05).③生物力学检测显示,未诱导细胞 BMP-2/FG组、诱导细胞 BMP-2/FG组桡骨标本的四点弯曲断裂载荷均明显高于其他组,并且诱导细胞 BMP-2/FG组高于未诱导细胞 BMP-2/FG组(P均＜0.05).未诱导细胞组与诱导细胞组无差别.结论:成骨诱导脂肪干细胞及联合BMP-2/FG移植后8周和12周时具有更强的成骨能力,可作为种子细胞应用于骨组织工程.     

骨形态发生蛋白2诱导慢性腱病大鼠肌腱干细胞体外成骨、成软骨分化

背景：目前临床对于慢性腱病缺乏有效的治疗手段,原因在于其发病机制至今尚未阐明。 目的：研究体外骨形态发生蛋白2对胶原酶诱导的大鼠慢性腱病模型髌腱来源肌腱干细胞的成骨、成软骨分化的作用。 方法：从大鼠慢性腱病模型的髌腱中分离培养出原代肌腱干细胞,传代培养至第3代细胞,行成骨、成脂、成软骨诱导分化鉴定其干细胞的特性。将肌腱干细胞（P3）单层培养至细胞融合,用重组人骨形态发生蛋白2干预。7 d后分别行茜素红染色,并行茜素红染色定量分析。将肌腱干细胞体外三维微球培养后分为2组,诱导组用重组人骨形态发生蛋白2干预,对照组不进行干预。21 d后三维微球行苏木精-伊红染色,阿利辛蓝染色以及Sox9和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。 结果与结论：慢性腱病大鼠来源原代肌腱干细胞体外培养呈克隆样集落生长,传代后细胞主要表现为多突的纺锤形和星形的扁平细胞,具有成纤维细胞样的特征。肌腱干细胞（P3）成脂诱导10 d,油红O染色阳性;成骨诱导7 d,茜素红染色阳性;成软骨诱导14 d,苏木精-伊红染色阳性可见软骨样细胞,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。单层培养的肌腱干细胞用重组人骨形态发生蛋白2诱导7 d茜素红染色阳性,对照组为阴性,茜素红染色定量检测显示差异有显著性意义。重组人骨形态发生蛋白2诱导肌腱干细胞21 d,苏木精-伊红染色可见软骨样细胞形成、阿利辛蓝染色可见细胞内糖胺多糖沉积、Sox9和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性。可见体外重组人骨形态发生蛋白2可以诱导慢性腱病来源的肌腱干细胞成骨、成软骨分化。这为进一步研究慢性腱病的发病机制提供了细胞生物学依据。     

Osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells: comparison of two different inductive media

Human mesenchymal stem cells (MSCs) have the potential to differentiate into cells of connective tissue lineages, including bone, cartilage, fat, muscle and also neurons. In our study we have examined the phenotypic profile of human adipose tissue-derived stem cells (hASCs) and compared different osteogenic-inductive media to assess hASC differentiation. Cells were enzymatically isolated from adipose tissues derived by liposuction from several adult human donors, purified and then expanded in culture. We obtained an abundant yield of hASCs with a constant proliferative trend, a doubling time of about 68 h and a mild variable clonogenic capacity. At passage 4, hASCs expressed MSC-related cell surface antigens (CD13, CD105, CD54, CD90, CD44), and subsequently hASCs were induced to differentiate into the osteogenic lineage for at least 3 weeks of culture in two distinct media, OM1 and OM2, differing in dexamethasone and ascorbic acid concentrations. Osteogenic differentiation of OM1- and OM2-cultured cells was assessed by evaluating cell morphology, osteopontin expression, alkaline phosphatase activity and calcium deposition. OM2 medium showed a higher osteogenic potential than OM1, as assessed by increased levels of calcium deposition, alkaline phospatase activity and osteopontin expression in comparison with OM1-differentiated cells. We conclude that hASCs efficiently differentiate into osteogenic lineage, particularly when cultured in inductive medium supplemented with 10 nM dexamethasone and 150 microM ascorbic acid.     

Osteogenic differentiation of two distinct subpopulations of human adipose-derived stem cells: an in vitro and in vivo study

The first stem cells considered for the reconstruction of bone were bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). Subsequently, cells with similar marker expression panel and differentiation potential were found in new sources of cells, such as adipose tissue. This source of stem cells has a promising future in tissue-engineering applications, considering the abundance of this tissue in the human body, the easy harvesting and the high number of stem cells that are available from such a small amount of tissue. The isolation of the adipose stem cells is generally performed by means of enzymatic digestion of the tissues, followed by a natural selection of the stem cells based on their capacity to adhere to the culture flasks, leading to a quite heterogeneous population. This constitutes a major drawback for the use of these cells, since the heterogeneity of the cell culture obtained can compromise their proliferation and differentiation potential. In the present study we have analysed the in vitro and in vivo behaviour of two selected subpopulations with high osteogenic potential. For this purpose, ASCs(CD29+) and ASCs (STRO-1+)subpopulations were isolated and in vitro cultured onto a biodegradable polymeric scaffold, using osteogenic medium, before implantation in a nude mice model. The biodegradable polymeric scaffold used is a fibre-mesh structure based on a blend of starch and polycaprolatone (SPCL) that has been successfully used in several bone tissue-engineering studies. The implanted ASCs-scaffold constructs promoted the formation of new bone tissue in nude mice. However, the results obtained show differences in the behaviour of the two ASCs subpopulations under study, particularly regarding their potential to differentiate into the osteogenic lineage, and allowed the indentification of ASCs (STRO-1+) as the best subpopulation for bone tissue-engineering applications.     

低氧对脂肪干细胞和关节软骨细胞三维共培养成软骨能力的影响

背景：多项体内外研究表明低氧和共培养均促进干细胞向软骨细胞方向分化。目的：观察低氧对脂肪干细胞和关节软骨细胞三维共培养成软骨能力的影响。方法：脂肪干细胞和关节软骨细胞二者按3∶1比例混合,以5×1010 L-1接种于聚乳酸-羟基乙酸共聚物/明胶支架上,分别在常氧（体积分数为20%O2）、低氧（体积分数为5%O2）环境下培养6周。苏木精-伊红染色进行组织学分析,阿尔新蓝染色鉴定糖胺多糖的合成,免疫组化鉴定Ⅱ型胶原的表达,并测定各组支架-细胞复合物的DNA、糖胺聚糖、羟脯氨酸含量。结果与结论：低氧组苏木精-伊红染色显示大量细胞及细胞外基质生成,阿尔新蓝染色显示有大量糖胺多糖生成,免疫组化显示Ⅱ型胶原表达强阳性,且DNA、糖胺聚糖、羟脯氨酸等各项指标均高于常氧组。表明低氧促进脂肪干细胞和关节软骨细胞共培养成软骨分化。     

脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞成软骨能力的比较

背景：脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞是软骨组织工程中应用较多细胞,二者在生物学特性上有诸多相似之处。目的：比较脂肪来源和骨髓来源的2种间充质干细胞的成软骨分化能力。方法：选取3月龄新西兰大白兔,取腹部脂肪,分离提取脂肪干细胞。取兔双侧股骨,采用贴壁筛选法分离提取骨髓间充质干细胞。绘制第3代脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞的生长曲线,比较2种细胞的倍增时间。对第3代脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞进行成软骨诱导,分别对诱导14d的2种细胞行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果与结论：骨髓间充质干细胞原代细胞呈聚集样生长,而脂肪干细胞原代细胞呈单个、散在生长。脂肪干细胞增殖速度要快于骨髓间充质干细胞,倍增时间短于骨髓间充质干细胞h。2种细胞成软骨诱导14d后,均表达糖胺聚糖和Ⅱ型胶原,且骨髓间充质干细胞成软骨诱导后表达Ⅱ型胶原水平高于脂肪干细胞。说明脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞体外增殖皆迅速且稳定,但是脂肪干细胞的生长增殖速度更快。单层培养时,特定条件下,脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞均能向软骨细胞转化,但是骨髓间充质干细胞比脂肪干细胞具有更高的潜能。     

C57小鼠脂肪及骨髓间充质干细胞生物学特性的比较

背景：研究发现,脂肪源干细胞具有和骨髓间充质干细胞一样的贴壁和形成成纤维样克隆特性,并具有向骨、脂肪、软骨等多系分化的能力。 目的：比较C57小鼠脂肪源间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的生物学特点。 方法：在无菌的条件下分别从C57小鼠的脂肪和骨髓中获取脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。体外分离、培养并将脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞传至第3代,进行细胞形态、表面标记、生长动力学分化潜能测定和Notch信号相关基因的检测。 结果与结论：脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞形态学相似,第3代的脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均表达CD29、CD105、Sca-1,不表达CD34、CD133,但骨髓间充质干细胞还表达CD45;生长曲线和细胞克隆分析显示脂肪间充质干细胞的增殖速度明显比骨髓间充质干细胞快;脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均可向成骨、成脂、成软骨诱导分化,脂肪间充质干细胞更易向成骨诱导;Notch 相关基因检测显示脂肪源干细胞的 Jagged-1表达水平明显比骨髓间充质干细胞低,而 Hes-1的表达水平脂肪源干细胞明显高于骨髓间充质干细胞的表达水平。提示脂肪间充质干细胞比骨髓间充质干细胞扩增能力更强,更易向成骨分化,可能与Hes-1表达水平有关。     

脂肪干细胞的三维球形培养简

背景：大多哺乳类细胞在正常生理状态下多以三维结构存在,为还原细胞本身在体内的自然状态,很多研究者开始尝试在体外对细胞进行三维培养,球形培养是一种常见的三维培养模式。目的：尝试用3种不同的方法在体外对人脂肪干细胞进行球形培养,并观察其生物学特征。 方法：对提取的脂肪来源细胞进行表面 Marker 流式检测以及成脂成骨诱导鉴定后,证实为脂肪干细胞。先后用低黏附培养法、hanging-drop培养法和Eppendorf管培养法3种方法在体外对脂肪干细胞进行球形培养,对3种方法形成球形的特点进行比较分析,并通过 Imagej 软件计算出3组多细胞球体的平均面积,利用Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live＆amp;Dead Cel s试剂盒对3组多细胞球体进行活力检测。结果与结论：①通过流式细胞术鉴定细胞表型标志物,其中CD29,CD44,CD59完全阳性,同时成脂成骨诱导也为阳性,证实提取的细胞为脂肪干细胞。3代以内脂肪干细胞多呈长梭形,并克隆状生长。②低黏附培养法、hanging-drop 培养法、Eppendorf 管培养法均可使脂肪干细胞聚集成球形生长,但所成多细胞球形有所差异。低黏附培养法所形成的细胞球形大小不一,不易控制;而hanging-drop培养法和Eppendorf管培养法均可使脂肪干细胞形成大小均一的球形,但在大小和形成时间上有所不同。③3种不同方法所形成的球形细胞均保持较好的细胞活力。     

人心包外脂肪干细胞诱导转化为心肌细胞简

背景：成体干细胞具有自我更新和分化为多种组织的能力,是组织工程学的重要组成部分。近来研究表明吸脂后人脂肪源性干细胞具有间充质干细胞的特点,能体外诱导分化为心肌细胞,但尚无对人心包外脂肪干细胞特点及诱导分化为心肌细胞的报道。目的：探讨人心包外脂肪干细胞体外培养及向心肌诱导分化的时期。方法：取人心包外脂肪组织,体外分离培养传代后,细胞免疫学检测不同时期细胞表面特异性抗原 CD44, CD90的表达,并比较荧光强度,选择最佳诱导时期利用心肌培养基诱导培养后,免疫细胞化学检测心肌特异性抗α-actin、cTnT的表达,进行表型鉴定。结果与结论：人心包外脂肪干细胞体外培养过程中贴壁生长,增殖能力强,形态呈长梭形,旋涡状排列;其表面标记物CD44,CD90表达阳性,并在3、4代细胞中荧光强度达峰值,CD34,CD45表达阴性。经心肌诱导培养基体外诱导培养后,分化的细胞大多呈肌细胞样,细胞免疫化学检测证实心肌特异性抗α-actin、cTnT表达阳性,且在3、4代细胞数量达峰值,结果表明人心包外脂肪干细胞具有间充质干细胞的形态特征及细胞免疫学特征,能体外诱导分化为心肌细胞,存在最佳诱导时期。     

骨髓间充质干细胞复合温敏水凝胶支架的制备

背景：壳聚糖及其衍生物制备的支架对细胞迁移和神经轴突再生有重要作用。壳聚糖及其衍生物的组织相容性好,易使干细胞在其表面附着生长,在神经组织工程具有较为广阔的应用前景。
　　目的：制备适宜骨髓间充质干细胞生长的壳聚糖/壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠温敏性水凝胶细胞支架,观察骨髓间充质干细胞在细胞支架中的生长情况。
　　方法：将壳聚糖进行季铵盐化改性处理,通过傅里叶变换红外光谱分析谱检测确定其生成。实验以壳聚糖与壳聚糖季铵盐配比为8∶1成功制备出较为稳定的壳聚糖/壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠温敏性温敏水凝胶细胞支架,观察成胶情况,并进行生物安全性检测。
　　结果与结论：实验在傅里叶变换红外光图谱上发现了季铵基基团的特征峰。细胞毒性实验显示,水凝胶浸提液干预的大鼠骨髓间充质干细胞无毒性。急性全身毒性实验显示,浸提液对大鼠体质量增加无明显影响,支架生物安全性较好。扫描电镜观察显示,骨髓间充质干细胞在细胞支架中能正常的生长和增殖。结果证实,实验成功制备了壳聚糖/壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠温敏性水凝胶细胞支架,适合骨髓间充质干细胞生长和增殖。     

Accelerating bone defects healing in calvarial defect model using 3D cultured bone marrow‐derived mesenchymal stem cells on demineralized bone particle scaffold

Bone defects are usually difficult to be regenerated due to pathological states or the size of the injury. Researchers are focusing on tissue engineering approaches in order to drive the regenerative events, using stem cells to regenerate bone. The purpose of this study is to evaluate the osteogenic differentiation of bone marrow‐derived mesenchymal stem cells (BMSCs) on biologically derived Gallus gallus domesticus‐derived demineralized bone particle (GDD) sponge. The sponges were prepared by freeze‐drying method using 1, 2, and 3 wt% GDD and cross‐linked with glutaraldehyde. The GDD sponge was characterized using scanning electron microscopy, compressive strength, porosity, and Fourier transform infrared. The potential bioactivity of the sponge was evaluated by osteogenic differentiation of BMSCs using 3(4, dimethylthiazol‐2‐yl)‐2, 5‐diphenyltetrazolium bromide assay and quantifying alkaline phosphatase (ALP) activity. in vivo experiments were evaluated through a micro‐computerized tomography (μ ‐CT) and histological assays. The analysis confirmed that an increase in the concentration of the GDD in the sponge leads to a higher bone formation and deposition in rat calvarial defects. Histological assay results were in line with μ ‐CT. The results reported in this study demonstrated the potential application of GDD sponges as osteoinductor in bone tissue engineering in pathological or nonunion bone defects.     

组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞

背景：研究显示兔脂肪干细胞的体外分离方法大多数为Ⅰ型胶原酶消化法,采用组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞尚不多见。 目的：采用组织块贴壁法从兔脂肪组织中分离培养兔脂肪干细胞,并进行成脂、成骨的诱导分化。 方法：采用组织块贴壁法分离出兔脂肪干细胞,进行体外培养,观察其形态特征。取对数生长期的第3代细胞,用MTT法绘制其生长曲线;流式细胞仪检测其表面抗原CD29、CD44、CD45的表达情况;分别用成脂和成骨诱导培养液诱导其向脂肪细胞和成骨细胞分化,油红O、茜素红染色定性鉴定。 结果与结论：体外培养的兔脂肪干细胞呈梭形纤维样细胞形态,生长力旺盛。流式细胞术分析结果显示,第3代兔脂肪间充质干细胞强表达CD29,CD44,阴性表达CD45。兔脂肪干细胞经成脂诱导14 d后,油红O染色阳性;成骨诱导培养14 d后,茜素红染色阳性。提示组织块贴壁法可以分离培养出兔脂肪干细胞。