日本血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基全长cDNA的克隆与功能分析

目的对用表达序列标签(EST)策略从日本血吸虫(Schistosomajaponicum)尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行全长cDNA克隆及功能预测。方法将插入于pTriplEx2 质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTn程序搜索,发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit, eIF2α) 基因高度同源。根据该EST序列设计与pTriplEx2 质粒上的5'端测序引物相匹配的PCR下游引物,从该cDNA文库中扩出包含eIF2α全长ORF的cDNA片段。将PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体上,并对此克隆进行测序得到其全长cDNA序列。用NCBI 站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索;用blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较。同时用网上分析软件进行基序和保守区域的搜索。结果发现一个与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源的日本血吸虫新基因,核苷酸与氨基酸水平的同一性分别为87%和79%,编码由327个氨基酸组成的蛋白序列。结论用EST策略筛选到一个日本血吸虫新基因,编码eIF2α亚基,全长编码序列与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源。     

兔大电导钙敏感性钾离子通道β亚基的克隆及生物信息学分析

目的:克隆新西兰白兔大电导钙敏感性钾离子通道(BKCa)β亚基基因,观察其组织分布,并对其进行生物信息学分析. 方法:采用3'及5'cDNA末端快速扩增(RACE)及RT-PCR技术从兔Oddi括约肌(SO)组织获得BKCa通道β亚基的全长cDNA序列. 并应用生物信息学方法分析该基因的同源性、蛋白结构域及跨膜拓扑结构. 结果:兔BKCa通道β亚基基因cDNA全长为1168 bp,开放读窗长度为576 bp,编码191个氨基酸. 生物信息学分析表明该基因核酸序列及氨基酸序列与人类及其它哺乳动物有很高的同源性;拓扑结构为两次跨膜蛋白,具有4个功能结构域,含有1个磷酸化位点及2个N-糖基化位点. 结论:首次成功地从兔SO组织克隆出BKCa通道β亚基基因,获得新GenBank号DQ821756,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

人绒毛膜促性腺激素β亚基cDNA的克隆

用新鲜的人绒毛膜组织提取总RNA,并通过逆转录反应合成cDNA第一链,利用人工合成的一对寡核苷酸引物,采用PCR技术特异性地扩增人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG—β)cDNA,琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增片段大小为500bp,与预计的片段长度相符,将此片段刊用T—A载体克隆至PCRⅡ质粒上并进行全序列分析,结果显示克隆片段包含hCG—βcDNA5’端和3’端的非编码区及完整的编码区。     

日本血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基全长cDNA的克隆与功能分析

目的 对用表达序列标签(EST)策略从日本血吸虫(Schistosoma japonicum)尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行全长cDNA克隆及功能预测。方法 将插入于pTriplEx2质粒上的cDNA进行测序，测序结果经BLAS Tn程序搜索，发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit，elF2α)基因高度同源。根据该EST序列设计与pTriplEx2质粒上的5′端测序引物相匹配的PCR下游引物，从该cDNA文库中扩出包含eIF2α全长ORF的cDNA片段。将PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体上，并对此克隆进行测序得到其全长cDNA序列。用NCBI站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索；用blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较。同时用网上分析软件进行基序和保守区域的搜索。结果 发现一个与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源的日本血吸虫新基因，核苷酸与氨基酸水平的同一性分别为87％和79％，编码由327个氨基酸组成的蛋白序列。结论 用EST策略筛选到一个日本血吸虫新基因，编码eIF2α亚基，全长编码序列与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源。     

小鼠整合素β7基因克隆、序列分析及突变修复

目的:克隆小鼠整合素β7基因cDNA,同时对其序列进行分析,对造成氨基酸突变的碱基进行定点突变修复.方法:采用RT-PCR的方法,从小鼠小肠PP结获得β7基因cDNA,克隆到pMD19-T载体,选择阳性克隆进行酶切鉴定和序列测定,对造成氨基酸突变的碱基进行定点突变修复.结果:扩增得到的β7基因cDNA为2418bp,编码806个氨基酸,与GenBank中公布的序列比较,有10个碱基发生突变,其中造成氨基酸发生改变的有5个碱基,涉及3个氨基酸,对发生突变的5个碱基进行定点突变修复.结论:获得小鼠整合素β7基因的克隆,为进一步研究其生物学功能奠定了良好基础.     

IFITM1克隆测序及生物信息学分析

目的 研究干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因(interferon induced transmembrane protein 1.IFITM1)克隆、测序,对序列进行分析,并获取生物学信息.方法 以IFITM1的cDNA为模板,用Pfu酶做PCR扩增,在EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后,将IFITM1的cDNA片段克隆到pUCm-T质粒,对重组的pUCm-T-IFITM1测序后,采用All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB Sequences Database 和 Simple Modular Architecture Research Tool (SMART)对IFITM1的cDNA进行生物信息学分析. 结果扩增后,含有IFITM1基因cDNA的PCR产物约1000 bp,IFITM1的 cDNA成功克隆到pUCm-T质粒并进行测序.序列分析结果显示,IFITM1结构cDNA全长683bp, 有2个外显子.IFITM1的 mRNA编码的氨基酸在37～57和87～107有2个跨膜区,编码125个氨基酸的多肽,其蛋白相对分子质量为14kDa.结论 IFITM1基因的成功扩增、克隆、测序,获取了IFITM1基因的cDNA、mRNA以及编码蛋白质氨基酸的生物学信息,有利于研究IFITM1基因与大肠癌的关系.     

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析

目的：克隆并分析我国刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶（NTPase）的编码基因。方法：采用聚合酶链反应（PCR）扩增弓形虫RH株的NTPase基因,克隆入pGEM-TEasy载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切与测序鉴定,并对获得的NTPase基因及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果：PCR扩增得到特异的弓形虫NTPase基因序列,测序结果表明,获得的弓形虫NTPase-Ⅱ基因全长1812bp,编码的603个氨基酸与Genebank报道的氨基酸序列同源性为100%。经DNAStar预测NTPase-Ⅱ存在6个潜在抗原表位。结论：成功克隆出序列正确的弓形虫NTPase-Ⅱ基因,为其相关研究奠定了基础。     

桂北五步蛇金属蛋白酶原基因1137bp片段的克隆和序列分析

目的：克隆桂北五步蛇金属蛋白酶原基因,并对其进行序列分析。方法：采用一步法抽提广西桂北山区五步蛇蛇毒总RNA,经RT-PCR扩增纤溶酶金属蛋白酶原基因,将扩增产物克隆至pGEM-T Easy载体,挑选白色菌落。用酶切和PCR法对其进行鉴定。直接利用纯化PCR产物或提取阳性菌落进行测序并推导其编码的氨基酸序列。结果：RTPCR和PCR扩增得到一约1137bp产物,并将其克隆及测序。结论：和已报道的皖南五步蛇纤溶酶金属蛋白酶氨基酸序列相比较,二者之间有91％的同源性。     

弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因的克隆、鉴定与生物信息学分析

目的 克隆并鉴定弓形虫PRU株表面抗原SAG2C基因序列和cDNA序列,对比不同毒力弓形虫株(PRU、RH、ME49)中SAG2C基因序列,进行生物信息学分析.方法 根据SAG2C基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从Prugniaud(PRU)株弓形虫基因组DNA和总RNA中扩增SAG2C基因,克隆入pMD19-T载体并进行序列测定.应用DNAMAN软件、NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析3种虫株之间SAG2C基因的同源性;利用生物信息学网站ExPASy(http://us.expasy.org/)对获得的基因及推导出的氨基酸序列进行生物信息学分析.结果 PCR扩增得到弓形虫PRU株SAG2C基因及其全长cDNA序列,酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒,测序结果表明,获得SAG2C基因序列1 225 bp,全长cDNA序列1 095 bp.编码364个氨基酸.同源性分析显示,弓形虫Prugniaud株和RH株SAG2C基因同源性为97.14%:Prugniaud株与ME49株cDNA序列同源性为96.89%;编码氨基酸序列同源性为92%.N端为信号肽,C端疏水序列预测它为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白,存在13个潜在抗原表位及多个保守功能区域.结论 成功克隆了弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因序列及其全长cDNA序列,序列分析显示其为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白.     

金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP—1）的克隆与序列分析

目的：用基因工程技术构建金属蛋白酶组织抑制剂的克隆质粒。方法：从人乳腺癌细胞中分离提取总RNA,经逆转录PCR（RT－PCR）扩增出金属蛋白酶抑制因子1（TIMP－1）的c DNA,插入经NdeI和XhoI双酶切的PET19b载体中,构建了克隆质粒PET19bTIMP－1。结果：对此克隆质粒进行了限制性酶切鉴定和DNA序列分析,结果在扩增出的cDNA中624个碱基中与发表的TIMP－1cDNA序列相比,除361位碱基由A变为G外,其余均完全相同。结论：该突变导致编码的氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸,不影响本课题后期用该克隆化基因表达蛋白作为抗原制备单克隆抗体的目的。该DNA全长624bp,编码207个氨基酸。     

日本血吸虫新基因的克隆及分析

目的：克隆并分析日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）新基因,提供有效的疫苗候选分子。方法：用Sj雄虫可溶性抗原免疫家兔血清为探针筛选Sj成虫cDNA文库,将所获阳性克隆的插入片断进行PCR扩增并测序,通过互联网NCBI GenBank和蛋白质分析软件进行分析。结果：共筛选得11个阳性克隆,经分析有2个新基因,分别是Sj-P8（GenBank注册号AF517843）和Sj肌球蛋白cDNA序列（GenBank注册号AY770506）,分别编码含75个氨基酸的跨膜蛋白和含212个氨基酸的蛋白片断。结论：Sj-P8和Sj肌球蛋白cDNA序列可能为日本血吸虫疫苗的研究提供有价值的材料。     

树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA和蛋白质序列结构分析

目的克隆获得树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA序列并进行结构分析。方法以树鼩肝脏mRNA逆转录出的Ⅰ链cDNA为模板,运用SMARTRACEPCR扩增技术,扩增得到树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)cDNA序列,并推导出LCAT氨基酸序列。利用分子生物学软件DNAMAN对氨基酸序列的一、二级结构及主要结构域进行分析和比较。结果树鼩LCATcDNA序列由1340个核苷酸构成,开放阅读框架1320bp,编码440个氨基酸的LCAT前体(含24个氨基酸构成的信号肽和416个氨基酸组成的成熟蛋白)熏3'非翻译区18bp,终止密码TAA,加尾信号AATAAA和一个25bp的poly(A)尾。树鼩LCATcDNA序列已作为新基因被GenBank接受,登记号AF272861。树鼩与人和狒狒LCATcDNA的同源性分别为90%和89%。结论树鼩LCATcDNA序列与人及其他实验动物高度同源。     

人AADC基因的克隆

为克隆表达人芳香族左旋氨基酸脱羧酶的基因 ,以了解此基因在多巴胺代谢过程中的作用 ,从人类胎儿黑质组织中提取总RNA ,以RT PCR方法扩增 1 4 4 2bp的cDNA片段 ,将此片段克隆于 pGEM T载体中 ,经过特异性限制性内切酶酶切分析片段正确后 ,进行全序列分析。结果表明克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致 ,得到了编码正确的人AADC的cDNA全序列。     

家蝇幼虫抗菌肽Defensins基因的克隆与序列分析

目的：克隆家蝇幼虫的抗菌肽defensins基因并对其进行序列分析。方法：提取家蝇幼虫总RNA，根据家蝇成虫defensins基因cDNA序列设计一对引物，RT-PCR扩增目的基因片段，T-A克隆后测序，应用相关生物信息学软件对该序列进行分析。结果：RT—PCR扩增出一条约310bp的目的片段，序列分析表明，其与家蝇成虫防御素基因同源性高达97％，核酸序列变异主要发生在信号肽区域。结论：成功克隆及分析了家蝇幼虫防御素基因全长编码区cDNA序列，为其下一步的重组表达和生物活性研究奠定了基础。     

人伴侣蛋白CCTβ亚基全长cDNA的分离与鉴定

目的 获得人伴侣蛋白CCTβ亚基全长cDNA序列,为进一步研究伴侣蛋白在蛋白质折叠中的功能提供理论依据。方法 采用“同源杂交筛选策略”,运用生物信息学方法结合PCR等分子生物实验技术,从人cD-NA文库中分离目的片段,并测序鉴定。结果 从人的睾丸组织cDNA文库中分离出一条新的cDNA片段,将它与计算机拼接的片段整合后,获得一全长为1935bp的序列,该序列含有一个长1680bp的的开放阅读框,编码535个氨基酸,并且在其3‘末端有典型的PolyA加尾信号。结论 基于从该cDNA推导的蛋白质与小鼠的CCTβ亚基氨基酸序列同源度性达97%,由这个新基因所编码的推导蛋白可能就是人的CCTβ亚基。     

人IL-32β基因的克隆和序列分析

目的克隆人IL-32β基因编码区并对其序列进行分析。方法人外周血单个核细胞经PHA-P刺激12小时后,提取总RNA,用RT-PCR扩增IL-32β基因并将目的基因克隆至pGEM-Teasy载体,转化E.coliJM109后,用菌落PCR筛选阳性克隆并进行双酶切鉴定和序列测定。结果构建的重组载体中含有人IL-32β基因的全长序列,与NCBI公布的序列一致。结论获得IL-32β基因的cDNA,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

人伴侣蛋白CCTβ亚基全长cDNA的分离与鉴定

目的获得人伴侣蛋白CCTβ亚基全长cDNA序列,为进一步研究伴侣蛋白在蛋白质折叠中的功能提供理论依据.方法采用“同源杂交筛选策略”,运用生物信息学方法结合PCR等分子生物学实验技术,从人cD-NA文库中分离目的片段,并测序鉴定.结果从人的睾丸组织cDNA文库中分离出一条新的cDNA片段,将它与计算机拼接的片段整合后,获得一全长为1935bp的序列,该序列含有一个长1680bp的开放阅读框,编码535个氨基酸,并且在其3'末端有典型的PolyA加尾信号.结论基于从该cDNA推导的蛋白质与小鼠的CCTβ亚基氨基酸序列同源度性达97%,由这个新基因所编码的推导蛋白可能就是人的CCTβ亚基.     

小鼠GITRL基因的克隆和序列分析

目的：克隆小鼠GITRL基因全长编码区的cDNA，同时对其序列分析。方法：采用RT-PCR方法，从小鼠树突状细胞获得GITRL基因的cDNA，克隆至pMD18-T载体，选择阳性克隆并进行序列测定。结果：扩增得到的GITRL基因编码区cDNA的全长519hp，编码173个氨基酸残基，与GeneBank中发表的序列完全一致。结论：获得小鼠GITRL基因的克隆，为进一步研究其生物学功能提供基础。     

家兔胆固醇酯转移蛋白基因克隆及其真核表达载体的构建

目的: 克隆家兔胆固醇酯转移蛋白(CETP) 基因,构建其真核表达载体,研究CETP基因的结构与功能,为进一步研究CETP在动脉粥样硬化(As)中的作用机制提供参考。方法: 采用TRIzol提取家兔肝组织总RNA,采用RT-PCR 方法将RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板,用LA Taq酶进行PCR扩增,克隆出CETP基因,将CETP cDNA片段克隆至pMD19-T载体上,对重组的CETP- pMD19-T测序后,登录GenBank进行序列比对,利用nnPredict软件分析预测CETP的二级结构。将CETP
cDNA片段克隆至pcDNA3.1真核表达载体上,对重组质粒进行PCR及酶切鉴定。结果：测序及序列比对显示与M27486基因序列98%相符;家兔CETP基因cDNA全长1 659 bp,编码序列(CDs区)长1 494 bp,编码498个氨基酸。CETP的二级结构以α螺旋结构为主,相对分子质量为142119.4, pI为4.91。结论: 成功克隆了家兔CETP基因,并成功构建了其真核表达载体,明确了CETP的二级结构。