人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究

目的 克隆hTERT启动子,并观察hTERT启动子调控下tk/GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法 设计特异性引物,以HepG2基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hTERT启动子;分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体;将上述质粒用脂质体转染A549细胞和人胚肺成纤维细胞系MRC5后,通过RT-PCR和β-Gal染色观察hTERT启动子工作情况;用MTT法检测不同浓度的GCV对A549和MRC5细胞的细胞毒作用。结果 成功克隆hTERT上游-280bp~+40bp的核心启动子。RT-PCR和β-Gal染色显示hTERT启动子能有效地调控其下游tk基因、LacZ基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性转录和表达;hTERT启动子调控的tk/GCV系统对端粒酶阳性的肿瘤细胞系A549有明显的特异性杀伤效应。结论 hTERT启动子可特异性地调控目的基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达而不影响正常的细胞,表明端粒酶启动子调控自杀基因的表达是一种很有希望的肿瘤靶向基因治疗策略。     

hTERT基因启动子调控HSV-tk/GCV系统对HeLa细胞杀伤作用

目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法:构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pCI-neo/hTERT-tk,分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(HeLa)和正常血管内皮细胞(ECV304),新霉素(G418)筛选阳性克隆扩增. 用RT-PCR法比较两种细胞tk基因的表达情况;给予前药更昔洛韦(GCV),用流式细胞术检测hTERT调控的HSV-tk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用. 结果:hTERT启动子调控下的HSV-tk/GCV系统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用,使36.7%的细胞凋亡;而对正常细胞ECV304作用则不明显. 结论:hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法,有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题.     

hTERT启动子调控下HSV-tk/GCV系统对人卵巢癌细胞系Skov3的杀伤作用

目的 探讨hTERT启动子驱动下的HSV-tk／GCV系统对人卵巢癌细胞系Skov3的体外杀伤作用。方法 应用分子生物学方法构建hTERT启动子调控下的tk基因真核表达载体pBTdel-279-tk,并应用脂质体转染法将之转入Skov3、正常人卵巢上皮细胞(NOEC)和人胚肺成纤维细胞中,加入GCV,用MTT法和流式细胞术检测pBTdel-279-tk／GCV系统对各种细胞的杀伤作用;应用RT-PCR法检测pcDNA3-tk和pBTdel-279-tk转染前后卵巢癌细胞和正常细胞中tk基因的表达情况。结果 pBTdel-279-tk／GCV对端粒酶阳性的卵巢癌细胞有明显的杀伤作用,而对端粒酶阴性的正常细胞则无;hTERT启动子系统诱导卵巢癌细胞凋亡的效能与CMV启动子近似,两者差别无显著性意义。pcDNA3-tk转染后,在Skov3细胞和NOEC中均可探测到tk基因;而pBTdel-279-tk转染后只有Skov3可探测到tk基因,NOEC中则无。结论 hTERT启动子调控下的tk基因治疗是一种新的卵巢癌靶向治疗方法,具有更高的特异性和高效性。     

HSV-tk基因表达载体的构建及其对A549细胞的杀伤作用

目的构建自杀基因HSV-tk表达质粒,研究自杀基因疗法对人肺癌细胞的杀伤作用,探讨其治疗肺癌的可行性。方法PCR扩增tk基因带EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点,然后构成建到pcDNA3.0载体中成pcDNA3.0-tk;将pcDNA3.0-tk转染A549肺癌细胞,应用细胞生长曲线和MTT法测定前药GCV对A549细胞的杀伤作用。结果成功获得pcDNA3.0-tk克隆,RT-PCR、Western印迹法证明A549细胞转染pcDNA3.0-tk后可表达自杀基因,GCV能特异性地杀伤A549/tk细胞。结论HSV-tk基因表达质粒构建成功;HSV-tK/GCV系统对肺癌A549细胞有一定的杀伤作用。     

pcDNA3．1（＋）／hTERT-tk真核表达质粒的构建及其在HepG-2细胞中的表达

目的：研究人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／更昔洛韦（HSV-tk／GCV）系统对肝癌HepG-2细胞的体外杀伤作用。方法：构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）／hTERT-tk,用脂质体法分别转染肝癌细胞（HepG-2）和正常肝细胞（L-02）后给予更昔洛韦（GCV）,用TUNEL法观察自杀基因对肝癌细胞生长的影响。结果：HETRT启动子调控下的HSV-tk／GCV系统对肝癌HepG-2细胞有明显的杀伤作用,而对正常肝细胞则作用不明显。结论：hTERT-tk／GCV基因体系能够靶向杀伤肝癌细胞,有靶向治疗肝癌的潜力。     

HRE增强hTERT启动子-tk/GCV基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的杀伤作用

目的：探讨缺氧反应元件(HRE)增强hTERT启动子-tk/GCV逆转录病毒基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的体外杀伤作用。 方法：构建由HRE缺氧反应元件修饰的hTERT杂合启动子和hTERT单一启动子引导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因表达的重组逆转录病毒载体,在脂质体介导下分别转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。将重组病毒感染人肺癌细胞SPC-A1和人肝癌细胞Bel-7402,G418筛选出抗性克隆肿瘤细胞。实验分为对照组、SPC-A1/tk组和Bel-7402/tk组。在缺氧处理条件下,MTT法检测前体药物丙氧鸟苷(GCV)对SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞的杀伤效应,流式细胞仪检测其细胞凋亡率和细胞周期的变化。 结果:与对照组比较,缺氧环境培养的SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞对GCV的敏感性明显增强,其中细胞凋亡率明显升高（P<0.001）,细胞周期各期细胞数有所减少（P<0.05）。与hTERT启动子引导的tk基因系统组细胞比较,［HRE］hTERT杂合启动子引导的tk基因系统组肿瘤细胞存活率更低（P<0.01）,诱导肿瘤细胞凋亡率明显升高（P<0.01）,G₁期和^G0期细胞数有所增高（P<0.05）,S期细胞数减少（P<0.05）。结论：HRE能增强hTERT启动子-tk/GCV自杀基因系统对缺氧环境中肿瘤细胞的体外杀伤作用。     

端粒酶启动子调控tk基因靶向性杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨端粒酶催化亚单位启动子/胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(hTERTp/tk)基因特异载体在体外靶向性杀伤鼻咽癌细胞的效应.方法 通过细胞转染将hTERTp/tk转染鼻咽癌细胞株中,采用RT-PCR及MTT法检测hTERTp/tk/pGL3体外特异性杀伤鼻咽癌细胞的效应及其tk基因、端粒酶表达.结果 转染hTERTp/tk/pGL3后可见tk基因表达,端粒酶及其hTERT表达较对照组下降.hTERTp/tk/pGL3能特异性杀伤鼻咽癌HNE1细胞,而对正常成纤维细胞无杀伤作用,hTERTp/tk/pGL3杀伤细胞的效应比阳性对照CMV/tk/pGL3的无选择性杀细胞作用略低.结论 hTERTp/tk基因特异表达系统具有靶向性杀伤鼻咽癌细胞的作用及抑制肿瘤细胞端粒酶活性.     

hTERT启动子的克隆及其在端粒酶阳性肺癌细胞中的靶向转录活性研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子序列片段,并探讨hTERT启动子在肿瘤细胞中的靶向转录活性。方法用PCR方法克隆293细胞DNA hTERT 5＇端上游旁侧序列长约1．1kb的启动子片段,经测序无误后将其克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游,构建pGL3-hTERTp重组质粒,瞬时转染肺癌细胞A549、SPC-A-1、LTEPα-2、NCI-H446、YTMLC-9、GLC-82、95D、A2以及正常成纤维细胞MRC-5,检测荧光素酶活性。并用RT-PCR和TRAP-ELISA方法分析各细胞hTERT mRNA的表达及其端粒酶活性。结果琼脂糖电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1．1kb,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致,位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp（-1126～-40）,片段长度为1084bp;采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒,均显示构建成功;hTERT mRNA和端粒酶活性在肺癌细胞中呈不同水平的表达,而正常细胞则均为阴性;瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示,hTERT启动子片段在所有检测的肺癌细胞中均有高低不同的转录活性,在正常细胞MRC-5无转录活性。结论克隆的1084bp大小的hTERT启动子片段在hTERT mRNA和端粒酶阳性的肺癌细胞中有特异性的转录活性,hTERT启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件。     

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK靶向性表达治疗肺癌的体内外实验研究

目的 研究人类单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)治疗系统在人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的调控下对肺癌细胞A549的体外靶向性增殖抑制作用和对裸鼠体内A549移植瘤的治疗效果.方法 ①用已构建的hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞A549及端粒酶阴性的人胚肺细胞MRC-5,RT-PCR方法检测转染细胞中TK基因的表达情况;②MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用;并应用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡的影响;③将A549细胞接种于裸鼠皮下,研究pGL3-hTp-TK/GCV和pGL3-SV40-TK/GCV对移植瘤的体内生长抑制作用.结果 ①转染pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5细胞均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞也有TK mRNA表达,但MRC-5细胞无TK mRNA表达;②GCV对转染pGL3-SV40-TK的A549、MRC-5细胞和转染pGL3-hTp-TK的A549细胞的体外增殖均有明显抑制作用,对转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无明显抑制作用;转染pGL3-SV40-TK 和pGL3-hTp-TK的A549细胞经GCV处理后细胞凋亡指数(分别为21.58%和23.19%)均显著高于转染pGL3-hTp的A549细胞及空白对照, 转染pGL3-SV40-TK的MRC-5细胞凋亡指数(9.35%)显著高于对照组,而转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞凋亡指数(0.88%)无明显升高;③pGL3-SV40-TK/GCV和pGL3-hTp-TK/GCV治疗系统对裸鼠A549移植瘤的生长具有明显抑制作用,抑瘤率分别为46.7%和40.5%,均显著高于各阴性对照组(分别为9.7%,14.3%,7.0%和8.0%).结论 hTERT启动子可以调控HSV-TK基因在肺癌细胞中靶向性表达,HSV-TK/GCV治疗系统在hTERT启动子调控下对肺癌细胞A549的体外增殖和裸鼠体内的移植瘤生长均有明显的抑制作用.     

HSV-tk/GCV自杀基因系统对骨肉瘤细胞体外杀伤效应

目的：观察：HSV—tk／GCV系统对骨肉瘤细胞SAOS-2的体外杀伤作用．方法：构建tk基因逆转录表达载体pL(tk)SN,在lipofectamine2000介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人骨肉瘤细胞SAOS-2,G418筛选出抗性克隆命名为SAOS／tk,以RT—PCR及Southern blot检测tk基因的整合及表达．观察tk基因修饰细胞生长状况及MTT法观察前药对tk基因修饰骨肉瘤细胞的杀伤效应．结果：RT—PCR及Southern blot分析证明tk基因在人骨肉瘤细胞系SAOS-2中有整合及表达;SAOS／tk与未转基因的原肿瘤细胞相比,两者生长速度及形态结构无明显差别;在前药敏感性试验中,GCV对SAOS／tk细胞的杀伤作用十分明显,半数致死量约为1mg／L,而亲本细胞SAOS-2和空白质粒转染SAOS／0细胞,半数致死量大于100mg／L．tk基因修饰细胞与不同比例亲本细胞混合后经GCV治疗,SAOS／tk占混合细胞总数的20％时即可杀伤约50％的混合培养细胞.结论：人骨肉瘤细胞系SAOS-2对HSV—tk／GCV系统高度敏感,并且有明显的旁观者效应,可望成为骨肉瘤基因治疗的新途径．     

人胰岛素样生长因子ⅡP3启动子调控融合基因质粒构建的研究

目的构建人胰岛素样生长因子Ⅱ基因(IGF-Ⅱ)P3启动子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,观察其在肝癌细胞株HepG2及宫颈癌细胞株HeLa细胞中的表达及其作用。方法应用基因重组技术,构建IGF-ⅡP3启动子驱动EGFP与HSV-tk融合表达穿梭质粒载体,脂质体转染技术将其转入HepG2及HeLa中,48h后荧光显微镜下观察荧光表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HSV-tk和EGFP的mRNA表达,四甲基偶氮唑蓝实验检测转染融合蛋白载体后给予不同浓度的更昔洛韦对HepG2及HeLa细胞毒作用。结果酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功;转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光;RT-PCR检测到HSV-tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达;更昔洛韦(GCV)对转染了携此质粒载体的HepG2细胞有选择性细胞毒作用,1、10、和100μg/ml3个浓度GCV作用72h后(实验均重复3次),对转染细胞的抑制率分别为19.8%±1.3%、36.2%±2.0%和48.7%±1.9%,与细胞病毒转染HepG2组(24.1%±1.9%、45.1%±1.7%、69.4%±3.6%)和此质粒转染HeLa细胞组(25.1%±1.6%、49.3%±1.1%、72.2%±2.9%)相比,差异有统计学意义(均P<0.01)。结论成功构建IGF-ⅡP3启动子驱动携带HSV-HSV-tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用,为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定基础。     

脂质体介导的HSV-tk基因转移对烫伤大鼠成纤维细胞凋亡的影响

目的通过脂质体介导外源基因转导烧伤创面的手段,探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因转移对创面成纤维细胞凋亡的影响。方法利用我们已经构建成功的重组真核表达质粒pcDNA3.1/HSV-tk,通过脂质体介导转染烫伤大鼠皮肤组织,用RT-PCR法检测HSV-tk基因的表达,在给与抗病毒药物丙氧鸟苷(GCV)后,用透射电镜观察成纤维细胞的凋亡情况。结果RT-PCR结果显示脂质体介导的tk基因转移可在创面成纤维细胞中出现阳性表达,给予GCV后可诱导表达tk基因的成纤维细胞出现凋亡。结论脂质体介导的HSV-tk基因转移可促进成纤维细胞凋亡。     

人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子驱动的增强绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达载体，研究其调控EGFP在肿瘤细胞中的靶向表达。方法：从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上，酶切获取约1100bv的启动子片段，克隆至无启动子的EGFP质粒载体pEGFP-1的多克隆位点中，构建pEGFP-hTERTp真核表达载体。用含有巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒pEGFP—N1作为阳性对照，pEGFP-1作为阴性对照，脂质体转染法分别转染人肺癌细胞95D，NCI—H446，A2，A549，LTEP—a-2，YTMLC和人正常细胞MRC-5，荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果；双酶切和单酶切均显示载体pEGFP—hTERTp构建成功。细胞转染结果显示：在转染了pEGFP-hTERTp质粒的肺癌细胞中EGFP都有不同程度的表达，而在MRC-5中无EGFP表达；转染pEGFP-N1的肺癌细胞和正常细胞中均可清晰地观察到EGFP强荧光表达。结论：hTERT启动子能调控EGFP在肺癌细胞中靶向性转录表达。CMV启动子调控的EGFP在肺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。     

hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的含有治疗基因的质粒,探讨在膀胱癌细胞株中特异性靶向转录表达及其潜在的临床意义。方法:将hTERT起始转录区上游的启动子序列克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因及含野生型p53基因的质粒上,分别构建成质粒phTERT-GFP及phTERT-p53。脂质体转染法瞬时转染膀胱癌细胞株T24,应用荧光显微镜、噻唑蓝(MTT)法等方法观察在转染细胞中的差异性表达及膀胱癌细胞生长的靶向性抑制作用。结果:在端粒酶阳性的膀胱细胞中观察到hTERT启动子调控的绿色荧光蛋白的靶向性稳定表达,转染hTERT启动子调控的野生型p53基因靶向性抑制膀胱癌细胞生长,但对端粒酶阴性的正常细胞无明显影响(P<0.05)。结论:成功构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因和GFP基因可在膀胱癌细胞T24中靶向性表达,hTERT启动子调控表达p53基因可靶向性抑制膀胱癌细胞生长。