甘草根cDNA文库构建与分析

目的：构建甘草cDNA文库，为甘草功能基因的研究以及筛选、克隆与甘草次生代谢产物合成途径相关基因奠定基础。方法：以LiCl沉淀法提取根组织总RNA，置换合成法合成双链cDNA，末端补平，连接EcoR I并磷酸化，以pBlueScriptⅡ为载体并电转化感受态细胞E.coli DH10 β，测定文库的克隆数、重组率，PCR 测定插入片断大小。同时，对文库进行随机测序并在GenBank中进行同源性检索和功能预测。结果：经鉴定文库的库容量为1.15×10⁷，重组率为98.2％，插入片段在0.5～4.8 kb，平均片段长度大于1.0 kb；经随机测序，获得126条EST，BLAST分析表明，大多数EST与豆科植物以及拟南芥、水稻等植物基因序列具有较高的同源性，在86条已知功能基因中，主要为细胞代谢、抗逆性、生长抑制及休眠相关的基因，其余40条EST为未知功能基因。结论：构建的甘草根cDNA文库库容量大、重组率高且插入的cDNA片段较长，能够满足甘草功能基因的研究。     

香菇C91-3 cDNA文库的构建及鉴定

目的 构建香菇C91-3 cDNA文库.方法 低速离心法收集香菇C91-3菌丝体发酵液中的菌丝,提取总RNA,巢式PCR扩增5SrRNA非转录间隔区2片段并测序鉴定.纯化mRNA,以mRNA为模板进行反转录反应;产物与pBlueScript II SK(+)载体连接,并转化E.coil DH10B,检测库容及插入片段.结果 香菇C91-3cDNA文库初始库容为7.2×106cfu,插入片段长度0.4～3.4kb,平均1.5kb.结论 成功构建香菇C91-3 cDNA文库,适合用于研究香菇蛋白的编码基因.     

慢性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库的构建

目的：采用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术构建汉族人慢性肾炎（chronic glomemlonephritisCGN）肾阳虚证cDNA消减文库。方法：选择汉族人CGN且中医辨证为肾阳虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA。用SMART（Switch Mechanism At 5end of RNA Template）技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断,分别与两种不同的接头连接,进行2次消减杂交及两交抑制性PCR,建立抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）,在SSH基础上进行镜像选择（mirror orientation selection,MOS）,将PCR产物与U载本连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建CGN肾阳虚证消减文库。结果：用SSH方法筛选出了CGN肾阳虚证的差异cDNA片段。得到了443个白色克隆,再经PcR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了CGN肾阳虚证的cDNA消减文库。结论：SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建CGN肾阳虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆CGN肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

肺癌脾虚痰湿型肿瘤相关证候差异表达基因的筛选与鉴定

目的：构建脾虚痰湿型肺癌肿瘤相关消减cDNA文库,以寻找脾虚痰湿型肺癌证候特异基因。方法：以原发性肺癌脾虚痰湿型的患者肿瘤组织及瘤旁正常组织为材料,分离Poly（A）RNA,反转录合成单链及双链cDNA,经Rsa I酶切,将肿瘤组织cDNA分成两组,分别与两种不同的接头连接,再与正常肺组织cDNA进行两次消减杂交和两次抑制性PCR扩增,将第两次PCR产物与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行文库扩增,构建了消减cDNA文库,同法建立反向消减cDNA文库。对经反向斑点杂交验证,从cDNA文库中随机挑选的200个含差异片段的克隆,碱裂解法提取DNA,从克隆5’端进行单向测序。EST测序序列行生物信息学分析,所有基因聚类用BLASTX（E values〈10-5）和BLASTN（E values〈10-10）搜索GenBank的非冗余核酸序列数据库及蛋白质库予以注释。结果：经文库扩增,随机挑选克隆进行PCR鉴定,插入片段主要分布在250～1000bp之间,并以反向斑点杂交法进一步验证其阳性克隆,最终获得251个阳性克隆,其中正向消减文库获得165个阳性克隆,反向消减文库获得86个阳性克隆。测序发现了正向消减文库差异基因22个,反向消减文库差异基因6个。结论：成功构建脾虚痰湿型肺癌肿瘤相关消减cDNA文库,发现了那些有明确生物学功能的证候相关基因,其基因表达及分布特征初步反映了肺癌脾虚痰湿型在分子层面的证候特点。     

狼疮性肾炎肾阴虚证cDNA消减文库的构建

目的:采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建汉族人狼疮性肾炎(LupusNephritis LN)肾阴虚证cDNA消减文库。方法:选择汉族人LN且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA,用SMART(Switch Mechanism At 5 end of RNA Template)技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建LN肾阴虚证消减文库。结果:用SSH方法筛选出了LN肾阴虚证的差异cDNA片段,得到了450个白色克隆,再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了LN肾阴虚证的cDNA消减文库。结论:SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建LN肾阴虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆LN肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

Studies on methods of processing sika deer fetus

Two methods of processing Sika Deer Fetus were comparatively studied according to the indexes such as rate of powder removal, crude proteins, crude fats, amino acids, trace elements, vitamins and hormones. It was found that the method of oven drying is superior to that of decocting. Thus we suggest that the former method should be used for Chinese patent medicines, such as Deer Fetus capsule etc.     

梅花鹿胎炮制方法的研究

用出粉率、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸、微量元素、维生素和激素作指标,对梅花鹿胎的两种炮制方法进行了比较,认为烘干法优于水煎法。因此鹿胎胶囊等中成药的鹿胎炮制,应以烘干法为宜。     

菌根真菌诱导的铁皮石斛根差减cDNA文库构建

 目的 构建菌根真菌共生诱导的铁皮石斛根的差减cDNA文库,从中筛选出差异表达基因。方法 采用SMARTer PCR cDNA合成方法直接以总RNA为模板合成并富集稀少cDNA,再利用抑制消减杂交（SSH）方法构建受菌根真菌共生诱导铁皮石斛根的差减cDNA文库。结果 成功构建了受菌根真菌诱导铁皮石斛根的差减cDNA文库,共获得1 975个阳性克隆。经检测,90%以上克隆能扩增出有效产物,其插入片段大小在150~1 000 bp之间。随机挑取了20个克隆菌液测序并进行了比对分析,大部分为植物应对环境胁迫防御性基因。结论 该技术体系所构建的差减cDNA文库质量较好,操作方便,尤其适用于珍稀濒危的植物材料。     

牛樟芝菌丝体全长cDNA文库构建及EST序列分析

目的为了更好地挖掘牛樟芝Antrodiacinnamomea菌丝体三萜合成和代谢相关基因、筛选互作蛋白和牛樟芝指纹图谱分析,构建了牛樟芝菌丝体cDNA文库并分析其表达序列标签(EST)序列。方法以牛樟芝菌丝体为材料,采用Gateway法构建其cDNA文库,对部分EST序列进行生物信息学分析、功能注释和EST-SSR分析。结果成功构建了牛樟芝菌丝体cDNA文库,经鉴定文库重组率高达95%,文库滴度为6.1×106 cfu/mL,总克隆数为1.2×107 cfu,插入片段大小为300~2000 bp,平均长度达1000 bp。随机挑选单克隆进行测序获得65个有效EST序列,其中1个重叠群,64个单一序列,比对结果显示有45条序列有明确功能注释,18条为未知功能基因,GO功能注释结果表明序列涉及细胞组成、转运、催化活性、调控等功能。所有EST序列共含有271个SSR,牛樟芝核苷酸重复类型丰富,其中二核苷酸和三核苷酸重复基元占总重复基元的94.23%。结论初步明确牛樟芝菌丝体cDNA文库及其EST序列相关生物信息,为牛樟芝菌丝体基因组学研究奠定理论基础。     

红花单功能反馈抑制敏感型CtAK1基因克隆、序列分析及表达载体构建

目的分离红花天冬氨酸代谢途径关键酶天冬氨酸激酶(AK)基因的全长cDNA序列,进行植物超表达载体构建。方法根据红花种了转录组文库注释和qRT-PCR鉴定的AK基因核心片段及表达分析数据,采用RACE技术获得红花AK(CtAK)基因的全长cDNA,利用DNA重组技术构建植物超表达载体。结果生物信息学分析表明,CtAK基因全长1 703bp,ORF区为1 626 bp,编码541个氨基酸残基,功能结构域分析推测,该基因可能为单功能反馈抑制敏感植物AK1。通过DNA重组技术成功构建以35 S为启动子和Bar抗性基因并含有叶绿体转运肽的pCAMBIA3301-CTP-AK1植物超表达载体。结论获得CtAK1基因的编码序列并构建植物超表达载体,为进一步研究其生物学功能及其在红花氨基酸代谢调控中的作用机制奠定基础。     

苦参碱诱导K562细胞分化的差异表达基因的研究

目的研究苦参碱诱导人红白血病K562细胞分化的分子机制。方法应用改良的mRNA差异显示逆转技术(DDRT—PCR)筛选苦参碱诱导K562细胞分化相关的差异表达基因；对差异cDNA片段纯化、克隆、测序及Blast分析，采用逆转录一聚合酶链式反应(RT—PCR)方法验证。进一步对其中的未知差异cDNA片段采用Northern杂交确定其转录本的大小及组织分布特性，进而充分利用多种生物信息学资源对差异片段进行结构和功能的预测。结果苦参碱诱导K562细胞前后存在明显的基因表达差异，筛选获得了17条差异条带。其中4个差异显著片段经RT—PCR验证后，在Genbank中分析，有3个为已知基因，1个可能为未知基因，暂命名为KH基因。Northern杂交证实KH基因转录本的大小为1．35kb，分布于正常人体脑组织中。结论苦参碱具有诱导K562细胞基因表达谱发生变化的作用，由苦参碱诱导的K562细胞分化是一个多基因参与的过程；KH基因可能是苦参碱作用K562细胞后表达量发生改变的未知基因，可能与细胞癌变有关。