整合素在牙龈蛋白酶诱导人成骨细胞凋亡中的表达变化及其机制

目的探讨整合素α5、β1在牙龈蛋白酶诱导人成骨细胞凋亡中的表达变化及其机制。方法厌氧环境下培养牙龈卟啉单胞菌,分离牙龈蛋白酶。用6.840 U/L的牙龈蛋白酶处理人颅骨成骨细胞(HCO)48 h,生物素原位缺口末端标记法(TUNEL)-4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光双染色法检测细胞凋亡情况;Western印迹检测不同牙龈蛋白酶浓度和不同作用时间HCO中整合素a5、β1蛋白表达变化;用磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信号通路抑制剂LY294002处理HCO后观察不同时间点整合素a5、β1蛋白表达变化。结果 TUNEL-DAPI染色显示,牙龈蛋白酶作用48 h后阳性对照组及观察组HCO凋亡的细胞数目较空白对照组明显增多。与空白对照组相比,牙龈蛋白酶可明显下调HCO中整合素α5、β1蛋白表达水平,且随浓度增加逐渐增强,各浓度之间差异有统计学意义(P0.05)。随着牙龈蛋白酶作用时间延长,HCO中整合素α5、β1蛋白表达水平逐渐下调,各时间点之间差异均有统计学意义(P0.05);整合素β1蛋白表达水平降低程度明显大于整合素α5,牙龈蛋白酶作用16 h、24 h、48 h、72 h时整合素β1蛋白表达水平均明显低于同期整合素α5,差异有统计学意义(P0.05)。LY294002处理HCO后,各时间点整合素α5、β1蛋白表达水平之间差异均无统计学意义(P0.05)。结论牙龈蛋白酶通过PI3K-AKT信号通路下调整合素α5、β1表达来诱导人成骨细胞凋亡,且呈时间和剂量依赖性。     

β_1整合素反义寡核苷酸抑制精氨酸加压素诱导下心脏成纤维细胞DNA合成的作用

目的:探讨β1整合素反义寡核苷酸(ASODN)对精氨酸加压素(AVP)诱导大鼠心脏成纤维细胞(CFs)DNA合成功能的抑制作用。方法:以胰蛋白酶消化法分离、培养SD大鼠的CFs,采用MTT吸光度法及3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法,原位酶联免疫吸附测定(ELISA)等技术,观察基础状态下β1整合素ASODN对CFs细胞数目及DNA合成功能的影响;β1整合素ASODN对AVP诱导的β1整合素表达,CFs增殖及DNA合成功能的影响;基础状态下设空白对照组、反义链组和正义链组;AVP诱导下设空白对照组、1×10-7mol/L AVP组、反义链+1×10-7mol/L AVP组和正义链+1×10-7mol/L AVP组,每组均为8个复孔。结果:①反义链组的CFs细胞数目及3H-TdR掺入率明显低于空白对照组及正义链组,并且均有统计学意义(P0.01);正义链组与对照组比较无统计学意义。②1×10-7mol/LAVP组和正义链+1×10-7mol/LAVP组的β1整合素表达水平,CFs细胞数目均高于空白对照组(P0.05),β1整合素ASODN与AVP共同作用组的β1整合素表达水平,CFs细胞数目明显低于1×10-7mol/LAVP组和正义链+1×10-7mol/L AVP组,并且均有非常显著性意义(P0.01)。③1×10-7mol/L AVP组和正义链+1×10-7mol/L AVP组的CFs3H-TdR掺入率均高于空白对照组(P0.05),β1整合素ASODN与AVP共同作用组的CFs3H-TdR掺入率明显低于空白对照组、1×10-7mol/L AVP组和正义链+1×10-7mol/L AVP组,并且均有非常显著性意义(P0.01)。结论:β1整合素ASODN不但抑制基础状态下CFs生长及DNA合成代谢,而且抑制AVP刺激β1整合素表达、CFs增殖、DNA合成的作用,说明针对特异性靶基因片段合成的ASODN可能抑制β1整合素遗传信息传递的某个环节,干扰细胞内外信息的传递,影响β1整合素介导的CFs与细胞外基质的黏附,从而产生拮抗AVP刺激心脏间质重构形成的作用。进一步提示应用反义药物防治高血压心脏间质重构的可能性。     

糖尿病大鼠肾脏局部α3、β1整合素与血管紧张素Ⅱ水平的相关性研究

目的探讨糖尿病大鼠肾脏局部α3、β1整合素与血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)的相关性及ATⅡ1型受体(AT1)拮抗剂对其的影响。方法 40只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(NC)、糖尿病组(DM)、糖尿病肼屈嗪干预组(Hyd)、糖尿病厄贝沙坦干预组(Irb),每组各10只。肼屈嗪及厄贝沙坦干预8周后进行PAS染色,观察肾脏病理变化。免疫组织化学法检测肾小球足细胞密度,ELISA及RTPCR检测肾脏局部ATⅡ水平、UAER、肾脏α3/β1整合素mRNA的表达。结果 (1)与NC组比较,DM组肾小球足细胞密度下降、蛋白尿增加、α3及β1整合素mRNA的表达下降、ATⅡ升高(P0.05)。予肼屈嗪及厄贝沙坦干预后,上述指标改善(P0.05)。(2)除外血压影响,与Hyd组比较,Irb组蛋白尿下降,足细胞密度升高(P0.05);ATⅡ下降(P0.05);α3及β1整合素mRNA的表达进一步改善(P0.05)。(3)肾小球足细胞密度与肾皮质α3、β1整合素mRNA表达呈正相关(rα3=0.883,rβ1=0.853,P0.01);α3及β1整合素mRNA的表达与ATⅡ呈负相关(rα3=-0.527,rβ1=-0.421,P0.01)。结论糖尿病大鼠肾脏局部α3、β1整合素表达变化与ATⅡ水平相关,可能是AT1拮抗剂除降压外,对糖尿病大鼠肾脏的保护机制之一。     

miR-200c改善转化生长因子－β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化的机制

目的探讨miR-200c是否通过调节自噬缓解转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞纤维化。方法不同浓度(0、5、10、15、20、30 ng/ml)TGF-β1刺激HK2细胞48 h后倒置显微镜下观察细胞形态,CCK-8检测细胞增殖情况。选择致HK2细胞增殖最快的TGF-β1浓度(c)进行转染实验:细胞转染40 nmol/L无意义序列RNA(NC组);细胞转染40 nmol/L无意义序列RNA后c浓度TGF-β1处理细胞48 h(NC+T组);细胞转染40 nmol/L miR-200c mimics(M组);细胞转染40 nmol/L miR-200c mimics后c浓度TGF-β1处理细胞48 h(M+T组)。qRT-PCR检测miR-200c转染效率。Western blotting检测4组细胞Smad通路蛋白Smad2和Smad3、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙黏蛋白(E-cad)表达量,以及自噬相关蛋白LC3(包括LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值)和P62。结果 10 ng/ml的TGF-β1刺激HK2细胞48 h后增殖最快,镜下细胞形态由正常的卵圆形铺路石状变为长梭形,纤维化形态最明显。qRT-PCR显示M组miR-200c表达量是NC组(212.42±12.25)倍(t=24.41,P=0.000),说明转染有效。Western blotting结果显示,与NC组比较,NC+T组加入10 ng/ml TGF-β1的HK2细胞Smad2、Smad3和α-SMA表达量增加,E-cad蛋白表达量降低(P0.05)。与NC+T组比较,M+T组Smad2、Smad3和α-SMA表达量减少,E-cad表达量增加(P0.05),提示miR-200c表达增加抑制了纤维化。进一步发现,M组较NC组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平增加,P62表达水平降低,提示自噬活性增加;M+T组较NC+T组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平增加,P62表达水平降低,提示miR-200c表达升高缓解了纤维化程度。结论 miR-200c可能通过激活细胞自噬缓解TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化。     

前列腺素E_1对高糖培养小鼠肾足细胞整合素及整合素连接激酶影响的研究

目的研究前列腺素E_1(PGE_1)对高糖培养小鼠足细胞整合素及整合素连接激酶(ILK)的影响。方法体外培养和分化小鼠肾小球足细胞,按培养条件不同分为:5.6 mmol/L葡萄糖组(Con),5.6 mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇组(5.6 mmol/L+24.4 mmol/L),15 mmol/L葡萄糖组(15mmol/L),30 mmol/L葡萄糖组(30 mmol/L)。每个培养条件分别以0、1、10、20 ng/ml的PGE_1进行干预,24 h后收集足细胞。Western blot检测整合素β1(Integrinβ1)、ILK、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况。结果依次增高葡萄糖浓度下足细胞Integrinβ1蛋白表达相对量依次降低,ILK、α-SMA蛋白表达相对量依次升高。30 mmol/L组足细胞Integrinβ1、ILK、α-SMA蛋白表达相对量为(0.32±0.04)、(1.20±0.02)、(1.24±0.02),与Con组比较差异有统计学意义(P0.05);添加20ng/ml的PGE_1对高糖引起的足细胞上述蛋白异常表达有逆转作用,Integrinβ_1、ILK、α-SMA蛋白相对表达量分别为(0.91±0.02)、(0.26±0.02)、(0.42±0.02),较各组中PGE_1=0时差异有统计学意义(P0.05)。结论 PGE_1对高糖环境中足细胞ILK、α-SMA蛋白表达上调具有抑制作用,对Integrinβ1蛋白表达具有上调作用,对高糖引起的足细胞转分化有抑制作用。     

整合素αvβ3在血管紧张素Ⅱ诱导人脐静脉内皮细胞衰老中的变化

目的观察整合素αvβ3在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老中的变化。方法体外培养HUVECs,采用CCK-8法检测细胞存活率,用AngⅡ(终浓度10-6mol/L)干预,分为实验对照组、AngⅡ诱导组。以衰老相关β-半乳糖苷酶活性和细胞增殖能力两种衰老标志物为主要观察指标。其中衰老相关β-半乳糖苷酶活性采用免疫化学染色方法,流式细胞术检测细胞周期来反应细胞的增殖能力;利用Western印迹法分析AngⅡ诱导HUVECs 0、12、24、36、48 h的整合素αvβ3表达的时间效应关系。结果与对照组相比,10-6 mol/L AngⅡ诱导组存活的细胞数为对照组的(77.15±6.83)%;(81.80±0.92)%的细胞呈现β-半乳糖苷酶阳性染色,流式细胞仪检测细胞周期停滞于G0～G1,证实细胞衰老;AngⅡ呈时间依赖性上调整合素αvβ3表达。结论 AngⅡ可以诱导HUVECs衰老,其机制可能与上调衰老细胞整合素αvβ3表达有关。     

β1-整合素促进Akt/GSK-3β/β-catenin 信号活化并抑制阿霉素诱导的大鼠心肌细胞损伤

目的 研究β1-整合素过表达对阿霉素诱导的大鼠心肌细胞损伤的作用。 方法 分离新生SD大鼠心肌细胞,随机分为对照组、空载体组、过表达组、阿霉素组、空载体 阿霉素组、过表达 阿霉素组和LY294002预处理组。利用四唑盐比色法(MTT)检测细胞存活,检测心肌细胞LDH释放率、MDA含量、GPx活性、SOD活性,利用实时定量PCR和Western blot检测细胞中β1-整合素以及Akt磷酸化、GSK-3β、β-catenin、Bcl2、Bax的表达,同时利用流式细胞术检测细胞凋亡。 结果 空载体组和过表达组转染效率为68.8±9.5%和71.2±8.9%。与对照组比较,阿霉素组细胞存活率显著降低(P<0.05),而过表达 阿霉素则提高细胞存活(P<0.05)。相比于对照组,阿霉素处理促进LDH释放和MDA形成(P<0.05),降低GPx和SOD活性(P<0.05),过表达 阿霉素则可以逆转阿霉素作用。阿霉素抑制心肌细胞Akt磷酸化和β-catenin 核转移,β1-整合素过表达则促进Akt磷酸化和β-catenin 核转移。阿霉素处理促进细胞凋亡并下调Bcl2表达、上调Bax表达,β1-整合素过表达抑制细胞凋亡并上调Bcl2表达、下调Bax表达。抑制Akt磷酸化显著阻碍β1-整合素的作用。 结论 过表达β1-整合素可拮抗阿霉素诱导的细胞毒性,这可能与Akt /GSK-3β/β-catenin信号活化相关。     

蛋白激酶Cβ_2-活性氧交互环介导高糖致内皮细胞损伤记忆效应

目的 以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为体外模拟高血糖记忆的研究对象,观察蛋白激酶C(PKC)β_2、活性氧(ROS)对其表达血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1) mRNA的影响,并探讨PKCβ_2、ROS在其中可能的交互作用.方法 将培养的HUVECs分为以下5组:正常糖(NG,5 mmol/L D-葡萄糖×3周)组、高糖(HG,25 mmol/L D.葡萄糖×3周)组、记忆(M,25 mmol/L D-葡萄糖×2周+5 mmol/L D.葡萄糖×1周)组、记忆PKCβ_2转染[MB,25 mmol/LD-葡萄糖×2周+5 mmol/L D-葡萄糖×l周+PKCβ_2重组腺病毒(Ad5-PKCβ_2)]组、记忆+α-硫辛酸(MA,25 mmol/L D-葡萄糖×2周+5 mmol/L D-葡萄糖×1周+62.5μmol/Lα-硫辛酸)组.以RT-PCR法检测VEGF、VCAM-1 mRNA表达水平,用荧光显微镜和荧光酶标仪测定ROS水平,采用激光共聚焦检测PKCβ_2蛋白的表达和转位.结果(1)HG组和M组VEGF、VCAM-1 mRNA表达增加,分别为NG组的1.76倍、1.35倍和1.69倍、1.43倍(P值均<0.05).(2)HG组和M组ROS水平分别较NG组升高了86%、80%(P值均<0.05);MA组ROS水平较M组下降了38%,同时MA组VEGF、VCAM-1 mRNA表达亦较M组显著下调,分别为M组的67%、78% (P值均<0.05).(3)HG组和M组PKCβ_2:核转位激活,定量分析显示,胞质/胞核荧光强度比值均较NG组下降,分别为NG组的70%、74% (P值均<0.05);MB组PKCβ_2核转位较M组更为明显,胞质/胞核荧光强度比值为M组的77%,同时MB组VEGF、VCAM-1 mRNA表达亦较M组进一步上调,分别为M组的1.29倍、1.18倍(P值均<0.05).(4)MA组PKCβ_2:核转位较M组减少,胞质/胞核荧光强度比值为M组的1.18倍;而MB组ROS水平较M组上调了25% (P值均<0.05).结论 HUVECs存在高糖记忆效应,PKCβ_2-ROS交互环可能介导了这个效应的发生.     

利拉鲁肽通过抑制高糖环境下NOD样受体家族核苷酸结合寡聚化结构域样受体3炎性体活化保护人髓核细胞的研究

目的 探讨利拉鲁肽（Lir）通过抑制高糖环境NOD样受体家族核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)炎性体活化保护人髓核细胞（NPCs）的作用及机制。方法 培养人髓核细胞株,第三代髓核细胞随机分为对照组（Con组）、高糖组（HG组）、Lir干预组（Lir组）,培养48 h。ELISA法检测IL-1β,流式细胞术检测活性氧簇（ROS）,Western blot法检测NLRP3、半胱天冬氨酸酶-1前体（Pro-caspase-1）、半胱天冬氨酸酶-1(Caspase-1)蛋白表达。结果 与Con组比较,HG、Lir组IL-1β、ROS、NLRP3、Pro-caspase-1、Caspase-1蛋白表达、细胞凋亡率升高（P<0.05）。与HG组比较,Lir组IL-1β、ROS、NLRP3、Pro-caspase-1、Caspase-1蛋白表达、细胞凋亡率降低（P<0.05）。结论 Lir通过抑制NLRP3炎性体活化,降低IL-1β分泌,抑制细胞凋亡,保护人NPCs。     

结缔组织生长因子对足细胞相关蛋白表达的影响

目的:观察结缔组织生长因子(CTGF)对体外培养的足细胞整合素连接激酶(ILK)、nephrin和desmin表达以及细胞表面形态的影响,以进一步探讨CTGF介导足细胞损伤的机制. 方法:不同浓度rhCTGF(0、10、50ng/ml)干预足细胞24h,观察rhCTGF对ILK、nephrin及desmin表达影响的浓度效应.以浓度为50 ng/ml的rhCTGF干预足细胞0h、24h、48h,观察rhCTGF对ILK、nephrin及desmin表达影响的时间效应.分别用real time RT-PCR方法和Western blot方法检测ILK、nephrin及desmin mRNA表达水平和蛋白表达水平.采用扫描电镜技术观察rhCTGF对足细胞表面形态的影响. 结果:在基础状态下,足细胞表达其标志蛋白nephrin及少量desmin,10ng/ml rhCTGF可使desmin表达显著增加(P＜0.05),而nephrin表达显著下降(P＜0.05),随着rhCTGF浓度增加,desmin表达进一步增加(P＜0.05),而nephrin表达进一步减少(P＜0.05);rhCTGF刺激24h,足细胞desmin表达上调(P＜0.05),而nephrin表达下调(P＜0.05),48h,desmin表达进一步增加(P＜0.05),而nephrin表达进一步减少(P＜0.05).在基础状态下,足细胞表达一定量的ILK,rhCTGF能上凋足细胞ILK表达.扫描电镜显示,对照组足细胞胞体表面相对光滑,微绒毛较少;rhCTGF(50 ng/ml)刺激24h后,足细胞细胞表面形态发生改变,形成大量微绒毛. 结论:CTGF能引起足细胞nephrin表达下调,desmin表达上调,促进足细胞发生上皮-间充质转分化;CTGF能引起足细胞微绒毛化.同时,CTGF能诱导足细胞ILK表达增加,推测ILK表达上调可能是足细胞损害机制之一.     

柴胡皂苷 d 对SH-SY5Y细胞体外抑制作用及机制

目的 探究柴胡皂苷(SS)d对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的体外抑制作用及分子机制。方法 体外常规培养神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,分别在浓度0、4、8、10μmol/L SSd的杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)中作用48 h,设为对照组及4、8、10μmol/L SSd组,荧光探针(DCFH-DA)法检测各组细胞中活性氧(ROS)的产生情况,试剂盒检测不同浓度SSd对SH-SY5Y细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性及丙二醛(MDA)含量的影响;Western印迹法检测细胞内细胞周期蛋白(Cyclin)D1、凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2及Bcl-2相关X基因(Bax)表达水平。结果 与对照组相比,8、10μmol/L SSd组ROS水平、MDA含量显著升高,Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01),且有浓度依赖趋势;4、8、10μmol/L SSd组LDH活性、Bax蛋白表达明显升高,CyclinD1蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论 SSd能够通过提高细胞的氧化应激水平,抑制CyclinD1信号转导通路而促进SH-...     

肠上皮细胞来源整合素αVβ6对树突状细胞功能的影响

目的:研究肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)来源的整合素αVβ6对骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)功能的影响.方法:分离、培养小鼠IEC和DC,IEC经卵清蛋白(ovalbumin,OVA)刺激后,多步离心法制备外泌体(exosome).应用免疫胶体金对外泌体中的整合素αVβ6进行定性,通过免疫磁珠技术,分离获取DC,流式细胞仪检测分离后DC纯度.然后将分离后的DC分5组,分别为空白组、OVA组、外泌体组、外泌体+抗整合素αVβ6抗体组、外泌体+羊抗小鼠IgG组,观察各组对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的反应.ELISA法检测DC在LPS刺激前后IL-12p70的表达.LPS刺激前活性转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)以及总TGF-β1的表达.结果:OVA组与空白组相比,总TGF-β1表达明显增高(226.636±40.355vs176.947±23.072,P<0.05),但活化TGF-β1表达无明显变化(P>0.05).空白组与外泌体+抗整合素αVβ6抗体组相比,活化TGF-β1表达无明显变化(P>0.05),但总TGF-β1表达明显增高(P<0.05).外泌体组和外泌体+羊抗小鼠IgG组与空白组相比,活化TGF-β1和总TGF-β1表达均明显增高(P<0.05).相比空白对照组,LPS刺激48h后外泌体组和外泌体+羊抗小鼠IgG组IL-12p70表达明显降低(P<0.05),OVA组及外泌体+抗整合素αVβ6抗体组IL-12p70表达无明显差异(P>0.05).结论:IEC来源整合素αVβ6能增加DC活性,以及TGF-β1和总TGF-β1的表达量,并拮抗LPS对BMDC的促成熟作用.     

洛伐他汀上调体外培养神经细胞毒蕈碱型乙酰胆碱受体及对抗β-淀粉样肽对该受体表达的抑制作用

目的观察洛伐他汀是否对毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChRs)有上调作用,探讨其是否具有抗β-淀粉样肽(Aβ)的作用。方法选择原代培养的大鼠海马神经细胞和SH-SY5Y细胞,采用洛伐他汀和Aβ寡聚体(AβOs)分别或联合处理培养细胞24~48 h后,采用蛋白印迹法和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测细胞中M1 mAChR和M3 mAChR蛋白及mRNA表达水平。结果免疫荧光染色显示原代大鼠海马神经细胞的体外培养纯度达85%以上;不同浓度洛伐他汀处理神经细胞24 h后,M1 mAChR和M3 mAChR蛋白及mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.05);0.5μmol/L AβOs处理神经细胞48 h后,其M1 mAChR和M3 mAChR蛋白及mRNA表达水平均明显下降(P<0.05);但预先用0.1μmol/L洛伐他汀处理神经细胞24 h,可减轻AβOs导致的M1 mAChR和M3 mAChR表达水平下降。结论洛伐他汀可能具有上调mAChRs表达水平的作用,对抗Aβ对该受体的作用。     

SB431542对高糖环境中小鼠足细胞Cdk5/p35表达的影响

目的应用SB431542及Roscovitine处理高糖培养的足细胞,观察抑制转化生长因子(TGF)-β1通路对高糖培养足细胞中Cdk5/p35表达的影响及抑制Cdk5激酶活性对高糖和TGF-β1诱导足细胞凋亡的影响。方法采用不同浓度SB431542(0.1,1.0,10μmol/L)处理高糖培养的足细胞,Western印迹法及RT-PCR技术检测各处理组Cdk5及p35蛋白和mRNA的表达变化情况。应用流式细胞术检测Roscovitine对高糖及TGF-β1刺激足细胞凋亡的影响。结果高糖(HG组)Cdk5和p35的蛋白及mRNA表达水平明显增高,显著高于正常血糖组(NG)组和甘露醇组(M组)(P0.05),并且呈时间依赖性升高。加入SB431542后,高糖培养导致的足细胞内Smad-2蛋白磷酸化水平明显降低。同时,HG+SB431542组足细胞内Cdk5和p35的蛋白及mRNA表达水平呈浓度依赖性显著降低,明显低于HG组(P0.05)。加入Roscovitine后,高糖及TGF-β1诱导足细胞的足细胞凋亡水平显著下降(P0.05)。结论高糖可能通过活化TGF-β1通路上调Cdk5/p35表达从而诱导足细胞凋亡。     

TGF-β1在AVP诱导的心肌成纤维细胞表型转化中的作用

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)在精氨酸加压素(AVP)诱导的心肌成纤维细胞(CFs)向肌成纤维细胞(MFs)转化中的作用。方法:用胰酶消化法分离培养SD仔鼠的CFs,将CFs分别与不同浓度的AVP、不同浓度的TGF-β1或添加了不同浓度的抗TGF-β1中和抗体的1×10-6mmol/L AVP共同孵育48 h后,用3H-脯氨酸掺入法检测CFs胶原合成的功能,用Western blot检测CFs中平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)的表达量,用ELISA法检测CFs中TGF-β1的合成。结果:AVP可浓度依赖性地诱导CFs的3H-脯氨酸掺入率和α-SMA的表达量增加,其中1×10-6mmol/L AVP组CFs的3H-脯氨酸掺入率和α-SMA的表达量显著高于对照组(P<0.05)。AVP也可浓度依赖性地诱导CFs中内源性TGF-β1的合成增加,其中在1×10-6mmol/L AVP刺激下,CFs合成显著增加的内源性TGF-β1刚好达到外源性TGF-β1诱导CFs向MFs转化所需要的剂量(>2 ng/ml)。抗TGF-β1中和抗体虽然能够显著抑制在10-6mmol/L AVP诱导下CFs的3H-脯氨酸掺入率和α-SMA的表达量(P<0.05),但却不能将其抑制到与对照组相近的水平(P<0.05)。结论:AVP刺激下CFs中内源性TGF-β1合成的增加可部分地介导AVP诱导的CFs向MFs转化。     

环氧合酶-2基因敲低对足细胞凋亡及podocin蛋白表达的影响

目的观察足细胞环氧合酶-2(COX-2)基因敲低对足细胞凋亡及podocin蛋白表达的影响,以进一步探讨足细胞凋亡的分子机制。方法将条件永生性小鼠足细胞株随机分为阴性转染组、5μL siRNA组、10μL siRNA组、15μL siRNA组。经诱导分化成熟,在siRNA干扰48 h后用半定量RT-PCR和Western bolt分别检测足细胞COX-2 mRNA及蛋白表达水平,用流式细胞仪检测足细胞凋亡水平。将10μL siRNA组分别设立足细胞正常对照组、足细胞COX-2基因敲低组和足细胞阴性转染对照组三个亚组,用Western bolt检测podocin蛋白、BAX蛋白及BCL-X1蛋白的表达水平。结果与阴性转染组比较,随着干扰浓度的增加,COX-2 mRNA及蛋白表达逐渐减少,而足细胞的凋亡率逐渐升高,15μL的siRNA组凋亡率明显增高。足细胞COX-2基因敲低组podocin蛋白表达显著低于足细胞阴性转染对照组(P<0.05)。与足细胞阴性转染对照组相比,足细胞COX-2基因敲低组BAX蛋白表达显著上调,而BCL-X1蛋白表达稍有下调。结论敲低COX-2基因表达可以导致足细胞凋亡,且随着siRNA干扰浓度的增加,足细胞凋亡率逐渐增加。在干扰浓度为10μL时,足细胞podocin蛋白的表达下调。BAX蛋白上调及BCL-X1蛋白下调参与了足细胞的凋亡。     

Wnt信号通路抑制剂对脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用及其作用机制研究

目的探究Wnt信号通路抑制剂(IWR-1)对脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用及其作用机制。方法2014年1月—2015年8月,体外培养脑胶质瘤细胞,给予不同浓度IWR-1处理,采用MTT法测定脑胶质瘤细胞增殖情况,并计算其抑制率,其中实验1组终浓度为5μmol/L IWR-1、培养液、细胞悬液,实验2组终浓度为10μmol/L IWR-1、培养液、细胞悬液,对照组添加等量培养液和细胞悬液。采用蛋白质印迹法检测Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白表达水平。结果实验1组、实验2组脑胶质瘤细胞增殖抑制率高于对照组,实验2组脑胶质瘤细胞增殖抑制率高于实验1组(P0.05);培养48 h时实验1组、实验2组脑胶质瘤细胞增殖抑制率均高于培养24 h(P0.05);培养48 h与24 h对照组脑胶质瘤细胞增殖抑制率比较,差异无统计学意义(P0.05)。实验1组、实验2组脑胶质瘤细胞中Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白表达水平低于对照组,实验2组脑胶质瘤细胞中Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白表达水平低于实验1组(P0.05)。结论 IWR-1能有效抑制脑胶质瘤细胞增殖,其作用机制可能与抑制Wnt5a蛋白和β-连锁蛋白的表达有关。     

替米沙坦和氨氯地平对乳鼠心肌成纤维细胞增殖的影响

目的探讨替米沙坦联合氨氯地平对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的乳鼠心肌成纤维细胞增殖及细胞中转化生长因子-β1(TGF-β1)及ROS的影响。方法对Wistar乳鼠心肌成纤维细胞行体外原代及传代培养,将培养好的细胞分为5组:对照组(加入15%小牛血清DEME培养液)、AngⅡ组(15%小牛血清DEME培养液+1×10-6 mol/L AngⅡ),替米沙坦组(TE组,在AngⅡ组基础上加入10μmol/L替米沙坦),氨氯地平组(AM组,AngⅡ组基础上加入1μmol/L氨氯地平)及替米沙坦+氨氯地平组(TE+AM组,在AngⅡ组基础上加入10μmol/L替米沙坦+1μmol/L氨氯地平)。倒置显微镜下观察各组细胞不同时期增殖情况及TGF-β1(免疫荧光法测定)、ROS(荧光探针DCFH-DA分析)情况。结果与对照组相比,AngⅡ组心肌成纤维细胞在S期时增殖率较高,而在G0/G1期、G2/M期时增殖率下降(P0.05),TGF-β1、ROS水平显著升高(P0.05)。与AngⅡ组相比,TE组、AM组及TE+AM组心肌成纤维细胞在S期时增殖率显著下降,而在G0/G1期、G2/M期时增殖率升高(P0.05),TGF-β1、ROS水平下降(P0.05)。TE+AM组与TE组、AM组相比心肌成纤维细胞在S期时增殖率下降,在G0/G1期、G2/M期时增殖率升高更明显(P0.05),心肌成纤维细胞中TGF-β1水平低于TE组、AM组(P0.05)。结论替米沙坦联合氨氯地平能有效抑制AngⅡ诱导心肌成纤维细胞增殖,其可能机制与抑制TGF-β1过度表达及ROS过度生成有关。     

血管紧张素(1-7)通过p53/Drp1轴对血管紧张素Ⅱ诱导的血管内皮细胞衰老的影响

目的 观察血管紧张素(1-7)[Ang(1-7)]对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)衰老的作用及机制。方法 体外用含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养HUVEC 48 h,随机分为对照组、Ang(1-7)组(1 μmol/L)、AngⅡ组(1 μmol/L)和AngⅡ＋Ang(1-7)组。通过细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色试剂盒检测各组衰老细胞数量(光学显微镜观察),通过活性氧检测试剂盒测定各组细胞活性氧(ROS)的水平,通过Western blot检测各组细胞p53和动力蛋白相关蛋白1(Drp1)的表达。结果 与对照组比较,AngⅡ组SA-β-Gal染色阳性细胞明显增多(P＜0.001),细胞ROS水平增加(P＜0.001),p53及Drp1蛋白表达量明显增加(P＜0.01)。与AngⅡ组比较,AngⅡ＋Ang(1-7)组SA-β-Gal染色阳性细胞率(P＜0.01)、细胞ROS水平(P＜0.001)、p53及Drp1蛋白表达量(P＜0.05)均降低。结论 Ang(1-7)可能通过影响p53/Drp1通路,抑制HUVEC内ROS生成,减轻AngⅡ诱导的HUVEC衰老。     

活性氧ROS在幽门螺杆菌诱导胃上皮细胞NLRP3炎症小体激活中的作用

目的探讨细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)诱导胃上皮细胞NLRP3炎症小体激活中的作用。方法培养Hp国际标准株NCTC11639和胃黏膜上皮细胞株GES-1。用Hp感染细胞GES-1 6 h,采用活性氧检测试剂盒检测细胞内ROS;用25 mmol/L的活性氧ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)预处理GES-1细胞30 min,再按照MOI为100∶1、200∶1加入Hp与细胞共孵育6 h和12 h,通过Western blot检测细胞内NLRP3、caspase-1 p10、ASC蛋白水平,采用ELISA检测上清液中IL-1β含量;实验设未感染对照组。结果与未感染组比较,Hp感染组细胞内ROS生成增多;无论是感染6 h还是感染12 h, NLRP3、caspase-1及ASC蛋白的表达及细胞培养上清液中IL-1β的浓度均随着感染复数的增加而增加(均P0.05);NAC预处理后再用Hp感染,细胞NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表达降低,IL-1β的浓度也降低(均P0.05);Hp感染6 h和12 h结果一致。结论 ROS途径可能参与Hp对GES-1细胞NLRP3炎症小体的激活。