宫颈癌组织中P16和HPV16/18 E7的表达及意义

①目的研究宫颈癌组织中抑癌基因p16 mRNA和蛋白质的表达,以及与HPV16/18 E7表达的关系.②方法采用聚合酶链反应(PCR)技术检测45例宫颈浸润癌组织、12例宫颈原位癌组织和20例正常宫颈组织中HPV16/18的感染情况;采用RT-PCR技术检测上述标本中HPV16/18阳性者E7 mRNA的表达水平及所有标本中p16 mRNA表达水平;采用免疫组化技术进一步检测HPV16/18 E7、P16蛋白的表达情况.③结果宫颈原位癌和浸润癌HPV16/18的感染率、HPV16/18 E7 mRNA和蛋白表达阳性率明显高于正常宫颈组织,差异有显著性(χ2=5.12～15.78,P<0.05、0.01),原位癌和浸润癌组之间比较差异无显著性(χ2=0.119、0.000,P>0.05);原位癌和浸润癌p16 mRNA的相对表达量明显高于正常宫颈,差异有显著性(F=5.412,q=4.125、5.519,P<0.05);HPV16/18 E7阳性组p16 mRNA的表达阳性率明显高于阴性组,差异有显著性(t=4.127,P<0.01);P16蛋白在宫颈原位癌和浸润癌组织中呈现过表达,在正常组织中为阴性表达或弱表达;p16 mRNA的相对表达量与HPV16/18 E7 mRNA的相对表达量呈显著正相关(r=0.813,P<0.05);P16蛋白的过表达与HPV16/18 E7蛋白表达有相关关系(χ2=8.959,P<0.01);HPV16/18 E7 mRNA和蛋白及p16 mRNA和蛋白的表达与肿瘤的组织学分级、淋巴结转移、肿瘤的大小和病人的年龄无关(P均>0.05).④结论抑癌基因p16的过表达发生在宫颈癌的早期和癌前病变阶段,可用于临床筛查和早期诊断宫颈癌.     

宫颈癌及其癌前病变组织中HPV16 E6蛋白的表达及意义

目的：探讨宫颈癌及其癌前病变组织中16型人乳头瘤病毒（HPV16）E6蛋白的表达及其意义.方法：用免疫组化SP法对15例正常宫颈组织、14例低级别宫颈上皮内瘤变（LCIN）、11例高级别宫颈上皮内瘤变（HCIN）以及61例浸润性宫颈癌标本进行了HPV16 E6蛋白表达的检测.结果：HPV16 E6蛋白在正常宫颈上皮、CINⅠ～Ⅱ、CINⅢ及浸润性宫颈鳞癌中的阳性表达率分别为0（0/15）、7.14%（1/14）、36.36%（4/11）、59.02%（36/61）.高级别CIN和浸润性宫颈癌中HPV16 E6蛋白阳性率明显高于正常宫颈组织和低级别CIN（P〈0.05）,HPV16 E6蛋白表达与宫颈癌临床分期、组织分化和淋巴结转移无关（P〉0.05）.结论：HPV16 E6蛋白的检测可能可作为宫颈癌前病变转归的指标.     

HPV16相关宫颈癌组织中MUC16和E6表达的关系

目的:探讨人乳头瘤病毒(HPV)16相关宫颈癌组织中粘蛋白抗原16(MUC16)与E6表达的关系。方法:以HPV16 E6阳性和阴性的宫颈癌细胞系和宫颈鳞状细胞癌(简称鳞癌)组织(184例)为研究对象,采用Western blot和免疫组化方法检测HPV16 E6和MUC16的表达。结果:Western blot结果显示:C-33A细胞中HPV16 E6无表达,Ca Ski细胞和Si Ha细胞中可见HPV16 E6表达;C-33A细胞中MUC16的表达低于Ca Ski细胞和Si Ha细胞(P<0.05),Ca Ski细胞和Si Ha细胞中MUC16的表达差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化结果显示:HPV16E6阳性的宫颈鳞癌组织中MUC16的表达高于HPV16 E6阴性的宫颈鳞癌组织(χ2=43.670,P<0.001)。结论:宫颈癌细胞系和鳞癌组织中MUC16与E6表达可能有关。     

宫颈癌组织中HPV16E6、E7蛋白水平与患者临床病理特征及预后的关系

目的 探究宫颈癌组织中16型人乳头瘤病毒E6蛋白(human papilloma virus type 16 E6 protein, HPV16 E6)、16型人乳头瘤病毒E7蛋白(human papilloma virus type 16 E6 protein, HPV16 E7)水平与患者临床病理特征及预后的关系。方法 选取行宫颈癌根治术87例患者的肿瘤组织、癌旁组织、正常宫颈组织标本进行研究,采用免疫组织化学法检测组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达情况,并结合患者临床病理特征进行分析,采用Kaplan-Meier生存曲线比较患者3年生存情况,采用COX回归分析各项因素对患者预后的影响。结果 免疫组化结果显示肿瘤组织中HPV16 E6、HPV16 E7阳性率高于癌旁组织和正常组织(P<0.05); HPV16 E6及HPV16 E7蛋白阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者(P<0.05);多因素分析显示HPV16 E6、HPV16 E7阳性是宫颈癌患者预后不良的独立危险因素(P<0.05)。结论 HPV16 E6、HPV16 E7蛋白在宫颈癌组织中...     

HPV16-E6蛋白在宫颈癌及癌前病变中的

目的 研究人乳头瘤病毒16型E6(human papillomavirus-16 E6 protein,HPV16-E6)蛋白在宫颈病变组织中的表达及其与临床病理特征之间的关系.方法 采用免疫组织化学SP法检测HPV16-E6蛋白在宫颈正常组织、慢性炎症、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial nioplasia,CIN)、宫颈浸润癌(invasive cervical cancer,ICC)中的阳性表达情况.结果 HPV16-E6在正常宫颈、宫颈炎、CIN、ICC各组中,阳性表达率分别为0.50%、38.35%、46.15%、71.11%,4组比较差异有统计学意义(χ2=27.50,P<0.01).经χ2分割后比较(α'=0.007 143),ICC组、CIN组、宫颈炎组的阳性率显著高于正常宫颈组.ICC组的阳性率显著高于宫颈炎组.HPV16-E6与年龄、病理类型、宫旁或脉管浸润呈显著性相关(P<0.05).结论 HPV16-E6与宫颈癌的启动、发生、发展及侵袭转移均密切相关.     

宫颈癌组织中HPV16 E6基因的检测及其意义

目的：探讨宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E6基因的检测及其意义。方法：运用PCR方法扩增HPV16E6／E7基因，分子克隆技术进行基因的克隆后进一步测定基因序列，宫颈炎和宫颈癌的确诊依赖于病理学方法。结果宫颈癌组织中HPV16E6基因的检出率为45％，显著高于宫颈炎组织中5％的检出率，两者有统计学差异。HPV16E7基因的检出率在两者之间没有显著性差异。结论：HPV16E6基因在宫颈癌的发病中起到重要的作用。宫颈组织中HPV16E6基因的检测有望成为宫颈癌筛查的新手段。     

TDI-FP法检测宫颈癌组织中HPV16E7基因647位点突变

目的:人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7基因的变异可能和HPV的致癌能力直接相关,E7 647位点的突变可能增强了致癌能力. 本课题通过应用TDI-FP法检测宫颈癌HPV16阳性标本中E7 647位点突变情况,可以对确定高危人群、恶性病变的预警筛查、辅助诊断、疗效判定及预后提供临床价值,并可以为宫颈癌及其癌前病变的基因治疗、疫苗治疗和预防提供分子水平方面的重要依据. 方法:TDI-FP技术是一种在聚合酶链反应的基础上具备液相探针杂交和碱基掺入三重特异反应的检测新方法,具有极高的特异性和敏感性. 本课题实验在TDI-FP方法的基础上检测宫颈癌患者HPV16 E7基因647位点突变情况,以进一步明确这些位点突变与宫颈癌变的相关性. 结果:应用TDI-FP法检测宫颈癌组织中HPV16型E7 647位突变率为32.35%,HPV16型E7 647位突变与对照组相比具有统计学差异(χ2=12.437,P＜0.001). 结论:本实验初步提示宫颈癌患者中HPV16型E7 647位突变可能是HPV致癌的一个高危因素.     

人乳头瘤病毒16型E2/E6癌基因与宫颈癌关系的研究

目的探讨人乳头瘤病毒16型(HPV16)E2/E6癌基因在宫颈癌发生中的作用。方法采用以医院为基础的1∶1配比病例对照研究,应用热启动PCR法检测经病理诊断确诊的74例宫颈鳞癌新发病例,及同期就诊的74例宫颈良性肿瘤患者的高危型HPV16 E2/E6癌基因的状况。结果病例组HPV16 E2、E6阳性率(41.89%,52.70%)高于对照组(17.57%,21.62%),差别有统计学意义,OR分别为3.250(1.471-7.178)和3.875(1.824-8.233);病例组HPV16 E2缺失率较对照组略高。结论宫颈癌的发生与HPV感染,特别是高危型HPV16的感染密切相关;HPV16 E2基因缺失、E6基因高阳性率在宫颈癌的发生发展中起重要作用。     

HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞凋亡及化疗敏感性的影响

目的：探讨HPV16E6对不同p53基因型的宫颈癌细胞化疗药物敏感性的影响。方法：应用AO/EB染色结合荧光显微镜技术及Annexine V-FITC/PI双标法流式细胞仪检测不同浓度DDP干预前后宫颈癌细胞凋亡情况;Western印迹检测DDP干预后对HPV16E6和p53mt蛋白表达的影响;通过差异RT-PCR检测不同浓度DDP干预C33A,C33A-E6,C33A-P和CaSki4组细胞24和48h后HPV16E6基因mRNA表达的变化。结果：AO/EB染色和流式细胞术检测的C33A,C33A-E6,C33A-P,CaSki细胞随着DDP干预剂量的增大,凋亡率亦明显增加（P〈0.05）。Western印迹结果示C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6蛋白的表达随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长而逐渐降低甚至难以检测到表达（P〈0.01）,而未干预的对照组C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6的表达量稍有增加。C33A-E6,C33A和C33A-P3组细胞中均检测到p53mt的表达,但随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长,3组细胞总蛋白中p53mt的表达量均无明显改变（P〉0.05）。差异RT-PCR结果表明,在未予DDP干预的情况下,C33A-E6与CaSki细胞在24h时HPV16E6 mRNA的表达量无差异,而在48h时则C33A-E6细胞的HPV16E6 mRNA表达量显著高于CaSki细胞（P〈0.05）,且两组细胞48h的HPV16E6 mRNA表达均较24h显著增高（P〈0.05）;在24和48h两时间段内,随着DDP干预浓度的增加,两组细胞的HPV16E6 mRNA表达量均逐渐减少（P〈0.01）;但在同样浓度的DDP干预时,C33A-E6与CaSki的HPV16E6mRNA表达量无统计学差异（P〉0.05）。结论：HPV16E6基因对宫颈癌细胞株化疗敏感性的影响与p53的基因型（p53mt/p53wt）无明显关系,其可能通过其他作用机制对C33A细胞的凋亡和化疗敏感性产生作用。     

HPV16-E6、E7蛋白在宫颈癌组织中的表达与病理特征的相关性

目的探讨HPV16-E6、E7蛋白在宫颈癌(CC)组织中的表达与病理特征的相关性。方法56例CC患者设为A组,43例高度鳞状上皮内病变(HSIL)患者设为B组,48例低度鳞状上皮内病变(LSIL)患者设为C组。3组均采集病理组织样本行HPV16-E6、E7蛋白检测,对比3组HPV16-E6、E7蛋白阳性率,探讨CC患者淋巴结转移、肿瘤最大径、临床分期、病理类型、宫旁浸润等病理特征与HPV16-E6、E7蛋白阳性的相关性。结果A组HPV16-E6、E7蛋白阳性率均高于B组、C组(均P<0.05),B组HPV16-E6、E7蛋白阳性率均高于C组(均P<0.05);HPV16-E6、E7蛋白阳性率与CC患者年龄、肿瘤最大径、淋巴结转移及组织学分级间差异均无统计学意义(均P>0.05),与临床分期、宫旁浸润及病理类型差异均有统计学意义(均P<0.05);CC患者HPV16-E6阳性与HPV16-E7阳性呈正相关(r=0.542,P<0.05)。结论HPV16-E6、E7蛋白在CC患者癌组织中表达水平较高且与病理特征间存在相关性。     

中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因 …

目的 分析中国山东地区宫颈癌患者ＨＰＶ１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点。方法 从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ,经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标准中感染ＨＰＶ型别,选感染ＨＰＶ１６型的标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因,将其重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体,进行双向测序、分析。结果 构建了含中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的重组质粒,命名为ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７－ＳＤ。     

慢病毒携带shRNA对宫颈癌细胞中HPV16型E6表达的抑制作用

目的研究慢病毒携带的短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA, shRNA)对宫颈癌Caski细胞中人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)16型E6表达的抑制作用.方法将靶向HPV16型E6的shRNA表达序列克隆到改建的慢病毒表达载体PLL3.7中,经限制性酶切鉴定和测序后,与3种包装质粒混合,以Lipofectamine 2000包裹后转染293FT细胞,72 h后收取含病毒的上清液并感染宫颈癌Caski细胞,感染48 h后加入G418筛选阳性克隆.每天对阳性细胞克隆进行细胞计数;提取细胞总mRNA,进行RT-PCR反应.结果与对照组相比HPV16型E6的表达降低70%,宫颈癌Caski细胞生长速度减慢50%.结论慢病毒携带的短发夹状干扰RNA能干扰宫颈癌细胞中HPV16型E6的表达并有抑制癌细胞生长的作用.     

Effects of anti- HPV16E6- ribozyme on phenotype and gene expression of a cervical cancer cell line

Objective To investigate the effects of anti- HPV16E6- ribozyme (HRz) on phenotype and gene expression of a cervical cancer cell line. Methods HRz was designed by computer programs.HRz’s activity was identified by cleavage experiments in vitro.HRz and empty eukaryotic plasmids were transfected into CaSKi cells with lipofectin, then renamed CaSKi- R and CaSKi- P, respectively. The expression of ribozyme in transfected cells was observed by RNA dot blot.The amounts of E6 mRNA in three kinds of cells lines were detected by Northern blot.Cell growth curves and soft agar forming ability were studied.The ability of each cell line to form tumors was assessed in nude mice.Apoptosis rates and expression of c- myc, bcl- 2, p53 and Fas were detected by flow cytometry (FCM).Antigens of tumor cells, HLA- 1, HLA- 2, B7- 1 and B7- 2 were also detected.NK, LAK, and CD3AK cells were induced.Their cytotoxicities were detected in CaSKi- R, CaSKi- P, and CaSKi cells. Results In vitro cleavage reaction demonstrated that HRz could cleave HPV16E6 mRNA in a site- specific manner.HRz could be expressed stably in transfected CaSKi cells.Northern blot analysis showed that E6 mRNA levels were lower in CaSKi- R than in CaSKi.The growth rate of CaSKi- R was slower than those of CaSKi and CaSKi- P.The soft agar- forming rate of CaSKi- R was lower compared with those of CaSKi and CaSKi- P cells.The ability of CaSKi- R to form tumors in nude mice was also poor.The apoptosis rate of CaSKi- R cells was much higher than those of CaSKi and CaSKi- P.HRz could reduce the expression of E6, c- myc and bcl- 2 proteins, and increase the expression of p53 as well.HRz could increase the expression of HLA- 2, B7- 1 and B7- 2 antigens.The cytotoxicity of NK, LAK and CD3AK cells was much higher in CaSKi- R than in CaSKi- P and CaSKi cells.Conclusion HRz not only reverses the malignant phenotype of CaSKi cells partially, but also induces apoptosis in the cells, and increases sensitivity of CaSKi cells to immune cells.     

HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞 凋亡及化疗敏感性的影响

目的：探讨HPV16E6对不同p53基因型的宫颈癌细胞化疗药物敏感性的影响。方法：应用AO/EB染色结合荧光显微镜技术及Annexine V-FITC/PI双标法流式细胞仪检测不同浓度DDP干预前后宫颈癌细胞凋亡情况;Western印迹检测DDP干预后对HPV16E6和p53mt蛋白表达的影响;通过差异RT-PCR检测不同浓度DDP干预C33A,C33A-E6,C33A-P和CaSki 4组细胞24和48 h后HPV16E6基因mRNA表达的变化。结果：AO/EB染色和流式细胞术检测的C33A,C33A-E6,C33A-P,CaSki细胞随着DDP干预剂量的增大,凋亡率亦明显增加(P＜0.05)。Western印迹结果示C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6蛋白的表达随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长而逐渐降低甚至难以检测到表达(P＜0.01),而未干预的对照组C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6的表达量稍有增加。C33A-E6,C33A和C33A-P 3组细胞中均检测到p53mt的表达,但随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长,3组细胞总蛋白中p53mt的表达量均无明显改变(P＞0.05)。差异RT-PCR结果表明,在未予DDP干预的情况下,C33A-E6与CaSki细胞在24 h时HPV16E6 mRNA的表达量无差异,而在48 h时则C33A-E6细胞的HPV16E6 mRNA表达量显著高于CaSki细胞(P＜0.05),且两组细胞48 h的HPV16E6 mRNA表达均较24 h显著增高(P＜0.05);在24和48 h两时间段内,随着DDP干预浓度的增加,两组细胞的HPV16E6 mRNA表达量均逐渐减少(P＜0.01);但在同样浓度的DDP干预时,C33A-E6与CaSki的HPV16E6 mRNA表达量无统计学差异(P＞0.05)。结论：HPV16E6基因对宫颈癌细胞株化疗敏感性的影响与p53的基因型(p53mt/p53wt )无明显关系,其可能通过其他作用机制对C33A细胞的凋亡和化疗敏感性产生作用。     

HPV16相关宫颈癌细胞系和组织中E7和DRR1蛋白的表达

目的:研究人乳头瘤病毒16(HPV16)相关宫颈癌细胞系和组织中E7和肾细胞癌下调基因1(DRR1)表达的关系。方法:以HPV16 E7阳性的宫颈癌Ca Ski和Si Ha细胞、HPV16 E7阴性的宫颈癌C-33A细胞及184例宫颈鳞状细胞癌组织为研究对象,采用Western blot方法和免疫组化染色方法检测E7和DRR1蛋白的表达,分析E7与DRR1蛋白表达的关系。结果:Western blot结果显示,C-33A细胞中HPV16 E7无表达,DRR1蛋白的表达显著高于Ca Ski细胞和Si Ha细胞(F=454.982,P<0.001);Ca Ski细胞和Si Ha细胞表达HPV16 E7,二者DRR1蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化染色结果显示,HPV16 E7阳性宫颈鳞状细胞癌组织141例,其中DRR1蛋白阳性34例;HPV16 E7阴性宫颈鳞状细胞癌组织43例,其中DRR1蛋白阳性32例;HPV16 E7阳性组织中DRR1蛋白的表达显著低于HPV16 E7阴性组织(χ2=36.250,P<0.001)。结论:DRR1可能是HPV16 E7作用的潜在靶基因。     

宫颈癌妇女人乳头瘤病毒16E6/E7基因变异分析

目的了解宫颈癌妇女人乳头瘤病毒(HPV)16E6/E7基因变异的情况,为HPV防治提供流行病学数据。方法从大量样本中筛选出HPV16阳性标本180例,其中宫颈癌患者100例,宫颈不典型增生患者50例,宫颈炎症患者30例,对宫颈脱落细胞样本采用PCR方法扩增HPV16 E6/E7基因,然后对反应产物采用DNA测序法获得基因序列,在GeneBank进行经BLAST分析,寻找变异位点。结果宫颈癌患者中E6核苷酸变异率为82.00%(82/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);宫颈癌HPV16E6最频繁的序列变异为T178G(60/100),其他常见变异为T350G、C335T/A442C、T178G/G39T,年轻宫颈癌组E6核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但两者T178G变异率存在明显差异(=0.000)。宫颈癌患者HPV16 E7核苷酸变异率为74.00%(74/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);E7最频繁序列变异为A647G 32.00%(32/100),其他常见的变异为A647G/C749T/T843C/T846C、A647G/C749T/T846C、C749T/C790T、A647G/C749T;年轻宫颈癌组E7核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但A647G变异率存在明显差别(=0.03)。结论宫颈癌患者明显存在HPV16E6E7核苷酸变异,HPVE6 T178G、E7 A647G可能与宫颈癌年轻化密切相关,故对该人群的检测并及时尽早采取干预措施。     

pcDNA3转染HPV16E6基因对人宫颈癌细胞C33A细胞生长及周期的影响

目的 探讨HPV16E6对宫颈癌C33A细胞生长增殖的影响.方法 通过脂质体法将HPV16E6基因稳定转染宫颈癌C33A细胞,RT-PCR及Western blot分别检测转染细胞中HPV16E6 mRNA和蛋白表达水平,流式细胞仪检测HPV16E6基因转染对C33A细胞生长增殖与细胞周期的影响.结果 稳定转染获得了稳定表达pcDNA3-HPV16E6质粒的C33A细胞克隆(C33A-E6细胞,即pcDNA3/HPV16E6/C33A组)及稳定复制空载体质粒的细胞克隆(C33A-P细胞,即pcDNA3/C33A组),并将未转染的C33A细胞作为对照组.pcDNA3/HPV16E6/C33A组细胞的生长速度比pcDNA3/C33A组和对照组明显加快(P<0.05).在转染了HPV16E6基因的C33A细胞中,其DNA合成前期G1和静止期G0(G0/G1期)细胞百分率(39.3%)明显低于pcDNA3/C33A组(53.7%)和对照组(55.4%)(P<0.01);而处于S期细胞的百分率(38.3%)、DNA合成后期G2及分裂期M的细胞百分率(G2/M:32.9%),均明显高于pcDNA3/C33A组(S:29.4%;G2/M:17.0%)和对照组(S:28.0%;G2/M:16.6%)(P<0.01).pcDNA3/C33A组和对照组细胞周期的各期分布无明显差异(P>0.05).结论 HPV16E6可能通过某种途径参与了C33A细胞的周期调控,促进细胞分裂,从而促进C33A细胞的增殖.