3-甲基腺嘌呤诱发HeLa细胞自噬及抑制辐照细胞自噬的双重作用

目的了解PI,K抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）对电离辐射后细胞自噬的影响,初步探讨作用机制。方法细胞增殖-毒性试剂盒CCK-8检测不同浓度3-MA处理及60Coγ射线4Gy照射或联合3-MA作用的HeLa细胞细胞生长变化和毒性,Annexin V—FITC／PI双标记检测细胞凋亡,Westernblot检测自噬相关蛋白SQSTMl／p62表达,Lipofectamine2000介导转染GFP—LC3质粒,共聚焦显微镜检测自噬体形成。结果3mmol／L以上浓度3-MA作用24h对HeLa细胞增殖有明显的抑制作用,作用更长时间产生致死毒性效应。无论是5mmol／L3-MA单独作用还是单独4Gy照射,均能诱发HeLa细胞自噬。但3-MA与（射线辐照联合作用时,HeLa细胞自噬受到抑制,细胞凋亡显著增加。结论PI3K抑制剂3-MA既诱发细胞自噬又能抑制电离辐射诱发细胞自噬,以在不同的条件下两种方式影响细胞存活。     

3-甲基腺嘌呤通过抑制自噬促进小鼠毛囊再生的作用研究

为研究自噬在毛囊周期循环和休止期脱发中的作用,以及是否可通过调节毛囊上皮细胞的自噬促进休止期毛囊的再生,采用拔毛法诱导3~4周龄C57BL/6小鼠的毛囊生长期,给予腹腔注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)处理,并以空白和自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)为对照,结果发现,经3-MA处理后的毛囊再生明显加快,且新生毛发的数量与质量均明显优于Vehicle组和RAPA组。取处理后的小鼠皮肤组织经HE染色、Western blot、免疫组化和免疫荧光检测,发现经3-MA处理后,毛囊上皮细胞中的Beclin1表达、LC3BⅡ/Ⅰ比值均显著降低,P62和Ki67表达增加,同时以CD34、CD49f为双标记的毛囊干细胞的数目明显增多;但经RAPA处理后的毛囊中Beclin1表达、LC3BⅡ/Ⅰ比值明显增加,但P62和Ki67表达下降,且毛囊干细胞的数目减少。实验结果表明,通过3-MA抑制毛囊上皮细胞的自噬可以促进由拔毛法诱导的C57BL/6小鼠的毛发再生。3-MA或其他相关的自噬抑制剂可能在未来的人类休止期脱发的治疗中发挥重要作用。     

自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤促进荜茇酰胺的抗肿瘤作用

摘 要 目的 荜茇酰胺是一种中药单体,具有多种药理学作用。本研究旨在探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对荜茇酰胺抗肿瘤作用的影响。方法 实验分为对照组：采用生理盐水处理A549细胞48h;荜茇酰胺组：3μM荜茇酰胺处理细胞48h,荜茇酰胺+ N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）组：3μM荜茇酰胺和10mM NAC处理细胞48h;3-甲基腺嘌呤+荜茇酰胺组：3μM荜茇酰胺和10mM NAC处理细胞48h。采用CCK-8法测定细胞活力,使用流式细胞仪测定细胞内活性氧（ROS）水平,蛋白质印迹法检测细胞自噬蛋白（LC3B）的表达。结果 3μM荜茇酰胺处理A549细胞后,细胞ROS水平显著升高至1.49±0.18(P<0.05),细胞活力显著下降至60.1±10.2%（P<0.05）,LC3B-II表达显著增加（P<0.05）。荜茇酰胺与10mM NAC合用后,细胞ROS水平为0.98±0.04,细胞活力为97.7+4.0%,LC3B-II表达下降至用药前水平（P<0.05）。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤处理肺癌细胞后,LC3B-II表达显著降低。3-甲基腺嘌呤+荜茇酰胺组A549细胞活力为24.8±1.3%,显著低于荜茇酰胺组（60.1±10.2%,P<0.05）。结论 荜茇酰胺通过ROS依赖途径促进细胞自噬。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤增强荜茇酰胺的抗肿瘤作用。     

自噬抑制剂3-MA对结直肠癌细胞Jagged-1蛋白表达及其增殖的影响

目的:探索自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine 3-MA)对结直肠腺癌细胞Jagged-1蛋白表达及其增殖活性的影响。方法:实验分为对照组和3-MA药物组(5 mmol/L),利用CCK-8法检测细胞活性;用Annexin/PI双染法检测细胞凋亡率;采用免疫组化和Western blot检测Jagged-1蛋白在两组中的表达差异。结果:Western blot及免疫组化结果表明:3-MA作用后,与对照组比较,结直肠腺癌细胞内Jagged-1蛋白的表达显著被抑制(P<0.05);3-MA作用后,结直肠腺癌细胞增殖率为(85.23%±5.61%),与对照组增值率比较具有显著差异(P<0.05);3-MA作用后,结直肠腺癌细胞凋亡率为(11%±4.3%),与对照组凋亡率(4.5%±2.1%)比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:3-MA可能通过抑制结直肠腺癌细胞中Jagged-1蛋白表达和结直肠腺癌细胞增殖、促进凋亡,从而发挥抗肿瘤生物学作用。     

3-甲基腺嘌呤通过抑制自噬和内质网应激途径保护睡眠紊乱诱导的大鼠肝损伤

目的：观察与分析3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）对睡眠紊乱诱导的大鼠肝损伤的保护作用及其相应的机制。方法：将30只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组和3-MA组,每组10只,对比各组大鼠实验前后体质量变化。处死大鼠后进行以下实验分析：(1)采用ELISA法检测各组大鼠血清丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）与天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）水平变化;(2)运用HE观察肝脏组织形态学的改变;(3)使用透射电子显微镜观察各组大鼠肝细胞中自噬体的形成;(4)采用TUNEL法评估各组肝细胞的凋亡水平,并计算凋亡指数;(5)通过RT-PCR与Western blot检测肝组织自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3-Ⅱ)、Beclin1、葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)及Caspase-3的mRNA与蛋白表达水平。结果：动物实验结果表明睡眠紊乱会诱导大鼠肝损伤,同时伴随肝脏自噬与内质网应激（endoplasmic reticulum ...     

3-methyladenine抑制自噬诱导胰腺癌细胞SW1990失巢凋亡

【目的】 探讨3-methyladenine(3-MA)对人胰腺癌SW1990细胞增殖?迁移及失巢凋亡的影响作用及其机制?【方法】 以胰腺癌细胞SW1990及永生化胰腺导管上皮细胞H6C7为研究对象,设3-MA处理组及PBS对照组,采用软琼脂克隆培养法及Poly-HEMA悬浮培养法筛选抵抗失巢凋亡的细胞?Annexin V-FITC/PI双染和TUNEL试剂盒法检测细胞凋亡;免疫荧光法及透射电镜检测细胞自噬;CCK-8法检测细胞增殖; Transwell小室检测细胞迁移能力?【结果】永生化胰腺导管上皮细胞H6C7处理组及对照组均无集落形成,胰腺癌细胞SW1990处理组形成(2.3 ± 2.63)个集落,对照组形成(9 ± 3)个,与H6C7 相比,SW1990具有较强的抵抗失巢凋亡的能力 (P < 0.05)?3-MA可抑制胰腺癌SW1990细胞自噬(P < 0.05)并抑制其增殖及迁移能力(P < 0.01)且诱导失巢凋亡(P < 0.01)?【结论】 3-MA可诱导胰腺癌细胞SW1990失巢凋亡,其机制可能与细胞自噬受抑有关?     

3-甲基腺嘌呤腹腔注射干预大鼠胃窦组织自噬最佳药物剂量与用药时间探讨

目的:探讨3-甲基腺嘌呤(3-MA)腹腔注射干预大鼠胃窦组织自噬的最佳药物剂量及用药时间.方法:将21只健康雄性SD大鼠随机分为七组:A组3-MA 10 mg/kg组、B组3-MA 15 mg/kg组、C组3-MA 30 mg/kg组,D组PBS组,E组空白对照组,F组3-MA 30 mg/kg 3 d组、G组3-MA...     

自噬调控剂研究进展

自噬是一种高度保守的经溶酶体介导的对细胞内蛋白质和细胞器降解、维持细胞内环境自身稳定的过程,广泛存在于真核细胞中,它与细胞的正常生长发育进程以及炎症、肿瘤等多种疾病的发生发展有着密切的联系。多数情况下,自噬对细胞或机体是作为一种保护机制,但有时也可以导致细胞的死亡。近几年来,自噬成为生物学领域研究中的一个新热点,而自噬调控剂的研发也应运而生。自噬调控剂通过不同的机制发挥作用,有望通过对其的深入研究为相关疾病的预防和诊治提供新方法。     

3-甲基腺嘌呤增强口腔鳞癌体外化疗药物敏感性的作用机制

目的：通过在口腔鳞癌Tca83细胞培养过程中加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）,观察顺铂（DDP）对口腔鳞癌Tca83细胞的杀伤作用,探讨3-MA增强口腔鳞癌化疗药物敏感性的作用机制。方法： 将对数生长期口腔鳞癌Tca83细胞分为对照组、3-MA处理组、DDP处理组、3-MA+DDP处理组和DDP+3-MA处理组,用MTT法检测细胞生存率,激光共聚焦显微镜检测自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ的表达水平,Annexin V-FITC流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：Tca83细胞株对顺铂IC₅₀值为5 mg/L;MTT检测,DDP组细胞生存率显著低于对照组和DDP+3-MA组 (P<0.05),高于3-MA+ DDP组 (P<0.05);细胞免疫荧光检测,3-MA组平均荧光强度显著低于其他4组（P<0.05）;流式细胞术检测,DDP组细胞凋亡率显著低于3-MA+DDP组 (P<0.05),高于DDP+3-MA组 (P<0.05)。结论：不同水平的自噬对口腔鳞癌细胞的作用不同,抑制细胞自身基础水平的自噬可增强DDP对Tca83细胞的杀伤作用,提示自噬抑制剂有望成为口腔鳞癌的化疗增敏剂。     

自噬对口腔鳞状细胞癌CAL-27和KB细胞放疗敏感性的影响及其机制

目的：利用自噬抑制剂联合放射疗法作用于口腔鳞状细胞癌CAL-27和KB细胞,探讨自噬对口腔癌放射治疗敏感性的影响及其作用机制。方法：选择人口腔鳞状细胞癌CAL-27和KB细胞,分为对照组、氯喹（CQ）组、3-甲基腺嘌呤（3-MA）组、放射组（IR组）及联合放射组（CQ+IR组和3-MA+IR组）。应用MTT法检测细胞生存率,采用免疫荧光法激光共聚焦显微镜观察CAL-27细胞自噬水平（即LC3Ⅱ免疫荧光强度）,Western blotting法检测自噬相关蛋白LC3和beclin-1表达水平,AnnexinV/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：与IR组比较,联合放射组细胞生存率明显降低（P < 0.05）。IR组细胞自噬水平明显高于对照组、CQ组、3-MA组和联合放射组（P < 0.05）。IR 组LC3和beclin-1蛋白表达水平明显高于对照组和联合放射组（P < 0.05）。与对照组比较,IR组和联合放射组细胞凋亡率明显升高（P < 0.05）;与IR组比较,联合放射组细胞凋亡率也明显升高（P < 0.05）。结论：放射疗法可以诱导口腔鳞状细胞癌细胞自噬水平升高。自噬抑制剂可以通过对口腔鳞状细胞癌细胞的增殖抑制及促凋亡作用,提高其对放射治疗的敏感性。     

Rapamycin and 3-methyladenine regulate apoptosis and autophagy in bone-derived endothelial progenitor cells

 

Background  Mammalian target of rapamycin (mTOR) is involved in a caspase independent form of programmed cell death called autophagy. The aim of this research was to investigate the effects of rapamycin and 3-methyladenine (3-MA) on autophagy, proliferation, apoptosis, and cell-cycle parameters of rat bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPCs).

Methods  Mononuclear cells isolated from rat bone marrow were treated with rapamycin (0.01, 0.1, 1, or 10 μg/L) or 3-MA (1.25, 2.5, 5, or 10 mmol/L) for 24 hours. Expression of the autophagy marker protein LC3-II was analyzed by Western blotting. Apoptosis and cell-cycle progression were analyzed by flow cytometry. Cell proliferation was measured using the MTT assay.

Results  Rapamycin treatment of EPCs induced apoptosis and autophagy and inhibited proliferation and cell-cycle progression in a dose-dependent manner. Treatment with 5 mmol/L 3-MA promoted cell proliferation; in contrast, treatment with 10 mmol/L 3-MA promoted apoptosis and induced S-phase arrest.

Conclusions  Rapamycin treatment of EPCs induced apoptosis and autophagy. Low concentrations of 3-MA had no significant effect on the proliferation and apoptosis of EPCs; The 5 mmol/L group promoted cell proliferation, but had no effect on the apoptosis; the 10 mmol/L group inhibited the proliferation and promoted apoptosis through the cell cycle.

     

NVP-BEZ235对人结肠癌细胞SW480体外增殖的抑制作用及其机制探讨

目的:探讨NVP-BEZ235对人结直肠癌细胞株SW480的抑制、凋亡作用及其可能的作用机制。方法:以不同浓度的NVP-BEZ235处理体外人结直肠癌细胞株SW480,分别用MTT法、流式细胞术和Western blot法检测NVP-BEZ235对SW480细胞的增殖抑制作用、细胞凋亡率和凋亡相关蛋白的表达。结果:NVP-BEZ235对人结直肠癌细胞株SW480的生长具有显著的抑制活性,诱导其凋亡,抑制p-Akt、p-p70S6K蛋白的表达,且均与药物浓度和作用时间呈正相关。结论:NVP-BEZ235具有抑制人结直肠癌细胞株SW480的生长作用并诱导其凋亡,且机制可能是通过抑制p-Akt、p-p70S6K蛋白的表达来实现的。     

三磷酸肌醇、钙离子在胃泌素促人结肠癌SW480细胞株增殖中的作用

目的：探讨胃泌素对人结肠癌细胞株ＳＷ４８０内三磷酸肌醇（ＩＰ３）、钙离子（Ｃａ２＋）的影响及其在细胞增殖中的作用,为结肠癌抗信息传导治疗提供实验依据。方法：①３Ｈ－肌醇标记细胞进行ＩＰ３分析。②应用Ｃａ２＋荧光指示剂Ｆｕｒａ－２检测细胞内Ｃａ２＋的浓度。③ＭＴＴ比色分析法检测活细胞数（吸光度Ａ值）。结果：５肽胃泌素（Ｐｅｎｔａｇａｓｔｒｉｎ,ＰＧ）可使ＳＷ４８０细胞内ＩＰ３、Ｃａ２＋水平升高,同时活细胞数Ａ值增加;５肽胃泌素与其受体拮抗剂丙谷胺（Ｐｒｏｇｌｕｍｉｄｅ,ＰＧＬ）合用时,癌细胞内ＩＰ３、Ｃａ２＋水平和活细胞数Ａ值均无明显变化。结论：提示胃泌素可能通过肌醇脂质信号传导途径促进人结肠癌细胞株ＳＷ４８０的增殖     

微小RNA-451对结肠癌细胞侵袭能力的影响

目的 研究微小RNA-451(miR-451)对结肠癌细胞系SW480侵袭能力的影响.方法 用荧光染料标记的siRNA片段转染,优化转染条件,观察转染效率;通过化学方法合成miR-451 mimics,以脂质体包裹转染SW480细胞,并设单独脂质体转染组、无关序列转染组、未处理组(对照组),采用细胞计数试剂盒-8检测miR-451对细胞增殖的影响,流式分析检测miR-451对细胞凋亡的影响,Transwell小室检测miR-451对细胞侵袭能力的影响.结果 化学合成的miR-451 mimics(100 nM)转染对结肠癌细胞系SW480的增殖和凋亡无明显影响,但对SW480的侵袭能力有抑制作用.结论 转染miR-451 mimics能抑制结肠癌细胞系SW480的侵袭能力.     

TRAIL与5-Fu合用对结肠癌细胞系SW480杀伤作用的研究

目的 观察TRAIL与5—Fu联合应用对结肠癌SW480细胞的作用。方法 采用MTT法检测TRAIL与5-Fu联合应用对结肠癌SW480细胞存活分数的影响；TUNEL法检测TRAIL与5—Fu联合应用对结肠癌SW480细胞凋亡率的影响。结果 MTT法证实30～300ng/ml的TRAIL与3．0mmol／L 5—Fu联合应用对结肠癌SW480细胞存活分数的影响有协同作用，TUNEL法表明3．0mmol／L 5—Fu可显著增强TRAIL诱导结肠癌SW480细胞凋亡的作用。结论 5-Fu可提高结肠癌SW480细胞对TRAIL的敏感性。     

肠癌SW480肿瘤细胞SP亚群分析

目的分选肠癌细胞株SW480中边群细胞(SP)亚群,观察SP细胞是否具有肿瘤干细胞样生物学特性。方法将1×107个/mL对数期生长的SW480细胞进行Hoechest33342和PI染色,80μg/mL维拉帕米阻断,流式细胞仪分选SP细胞。将分选后的SP细胞和非SP细胞,采用MTT法绘制细胞生长曲线和进行细胞克隆形成实验;并将两种细胞接种于裸鼠皮下,观察移植瘤的形成情况。结果 Hoechest33342染色显示:SP细胞亚群的平均含量为(1.43±0.05)%,加入维拉帕米后SP细胞亚群比例减少为(0.01±0.01)%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。细胞生长曲线显示:非SP组细胞生长速度较SP组明显降低,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。克隆形成实验表明,移植第15天后SP细胞克隆体积大,边界平滑,细胞呈巢状隆起生长,结构致密,细胞体积小,平均克隆数为49.33±8.21,显著高于非SP细胞组的31.03±5.29,两组比较差异也有统计学意义(P<0.01)。在移植量为1×105个SP细胞组中有50%小鼠成瘤,而非SP细胞组小鼠均未见明显成瘤(P<0.01)。结论人肠癌细胞株SW480中...