EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究

目的：制备高效价EB病毒膜蛋白抗体,并对其效价及其与EBV结合的特异性进行鉴定。方法：将B95-8细胞培养至3×10^5/mL时,超声破碎,纯化获得EB病毒膜蛋白抗原;EB病毒膜蛋白抗原经弗氏佐剂乳化,在家兔背部皮下多点免疫注射,间隔2周免疫,共3次,并分别于免疫前和每次免疫后1周取兔血清,检测兔免疫血清抗体IgG;进一步采用Western blot检测制备的血清抗体与EBV结合的特异性,同时采用ELISA法检测兔血清抗体水平及各周抗体滴度的变化趋势。结果：所有家兔在全程免疫后都产生了高效价膜蛋白的特异性抗体,最高滴度达1：6400。结论：用B95-8细胞制备的EB病毒膜蛋白抗原免疫家兔,可成功制备高效价的特异性血清抗体,为EB病毒膜蛋白抗原的免疫学检测奠定了基础。     

兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢／还原酶多克隆抗体的制备

目的：制备兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢／还原酶（NRDR）多克隆抗体。方法：应用原核表达的兔NRDR免疫豚鼠,制备豚鼠抗兔NRDR多克隆抗体,并以Western blot法分析抗体特异性。结果：免疫豚鼠获得了高效价抗血清,效价为1：2000时检测极限为160rig蛋白,与NRDR蛋白能特异性结合。结论：获得的多克隆抗体应用于Western blot中检测兔NRDR效果良好。为NRDR的进一步研究打下基础。     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的 分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体.方法 应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度;用Western-blot、ELISA法检测纯化后IsG性质及效价.结果 重组NS1蛋白获得分泌表达,其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1:6000.结论 重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础.     

教学用高效价兔抗人免疫血清的制备

目的:制备教学用高效价兔抗人免疫血清.方法:采集健康人混合血清,用混合免疫法免疫健康家兔,一个月后产生高效价免疫血清,并用双向琼脂免疫扩散法测定其效价.结果:制备出效价高于1∶16的兔抗人免疫血清.结论:采用混合免疫法可在较短期内制备出高效价兔抗人免疫血清.     

抗泡球蚴重组Em18抗原多克隆抗体的纯化与鉴定

目的：制备抗泡球蚴18（Em18）抗原多克隆抗体,纯化并鉴定.方法：表达并纯化rEm18-GST蛋白.用纯化后的蛋白作为免疫原,免疫新西兰白兔获得抗rEm18-GST的多克隆抗体IgG,采用ELISA法检测抗体效价,进一步纯化抗体,获得抗Em18特异性多克隆抗体IgG,用Western blot及ELISA法检测并进行初步鉴定.结果：免疫制备获得兔抗rEm18-GST抗体,随着免疫次数的增加,抗体滴度不断升高,于第10周达到最高.ELISA检测抗体效价为1∶51 200.Western blot及ELISA法鉴定表明Em18-GST抗体去除了与GST的交叉反应.结论：获得了去除与GST交叉反应的抗Em18多克隆抗体,为进行噬菌体肽库筛选奠定基础.     

抗P37多克隆抗体的制备 纯化与鉴定

目的：用P37融合蛋白免疫动物制备抗血清,为猪鼻支原体感染作用的分子机制提供依据。方法：诱导表达GST-P37蛋白并以其免疫兔制备免疫血清,ELISA法检测抗血清的效价;Western blot-ting检测抗血清特异性。结果：免疫家兔并纯化抗血清得到特异的抗P37抗体,该抗体能检测到P37蛋白的表达。结论：成功制备了抗P37的多克隆抗体,对进一步研究P37的功能提供了一个有用的工具。     

辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶的表达与多克隆抗体制备

目的：制备辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶（NRDR）多克隆抗体.方法：应用大肠杆菌BL21-AI表达NRDR,制备NRDR包涵体,使用从SDS-PAGE凝胶中回收的重组NRDR作为免疫原,采用肩胛骨下注射作为免疫途径免疫兔.斑点杂交测定抗血清效价,HiTrap Protein G柱纯化兔IgG,免疫印迹鉴定抗体特异性.结果：BL21-AI对NRDR进行了高效表达.回收的NRDR蛋白溶液的浓度为0.36mg/ml,回收率为48.5%.所有免疫的动物在第2次追加免疫之后都产生了高效价的抗血清,血清的效价是1：500,检测极限是8ng NRDR蛋白.纯化后的NRDR抗体具有较高的免疫活性和特异性.结论：建立了高效制备辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶多克隆抗体的方法.     

人Ⅱ型高尔基体膜蛋白73多克隆抗体的制备及免疫学鉴定

目的制备人Ⅱ型高尔基体膜蛋白73(Golgi protein 73,GP73)的多克隆抗体,为进一步研究GP73的功能奠定基础。方法利用重组原核表达载体PET-32a-GP73在大肠杆菌BL21中诱导表达,利用切胶方法回收纯化蛋白,并免疫新西兰兔制备多克隆抗体。制备的抗体经硫酸铵沉淀纯化后,用ELISA法和Western blot对多克隆抗体进行效价和特异性检测,用免疫组织化学法(IHC)检测纯化抗体在不同肝组织中识别GP73的能力。结果 GP73蛋白表达成功,并成功获得纯化的GP73蛋白及兔抗GP73多克隆抗体;ELISA法测定多克隆抗体效价>16 000;Western blot证明多克隆抗体的特异性良好;IHC显示GP73蛋白在正常肝组织中仅表达于胆管上皮细胞,而在肝癌组织中表达于肝癌细胞和胆管上皮细胞。结论成功获得了纯化的GP73蛋白及高效价的多克隆抗体,肝脏组织的IHC验证了其良好的特异性。     

热休克因子4b多克隆抗体制备及纯化

目的制备兔抗人热休克转录因子4b(Hsf4b)多克隆抗体。方法利用实验室已纯化的GST-Hsf4b融合蛋白免疫新西兰大耳白兔3次,制备Hsf4b多克隆抗体血清,ELISA方法检测血清抗体效价,饱和硫酸铵纯化血清多克隆抗体,Western blot检测多克隆抗体与Hsf4b蛋白结合能力。结果 ELISA检测显示,经过三次免疫,获得了高效价的兔抗人Hsf4b多克隆抗体;Western blot检测表明,制备的兔抗人Hsf4b多克隆抗体与Hsf4b蛋白结合良好。结论成功制备了高效价的抗Hsf4b多克隆抗体,为研究Hsf4b生物学功能提供了有用的实验工具。     

兔抗人RBBP10多克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备兔抗人RBBP10多克隆抗体并进行鉴定.方法 用人工合成的RBBP10蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot方法检测制备的抗血清效价和特异性.结果此次获得的抗血清ELISA方法检测抗体效价达到1:16000,检测RBBP10的灵敏度最低为10μg/μ1.Western blot检测表明抗体效价高,特异性强.结论 应用该方法成功制备了人RBBP10多克隆抗体,此抗体可通过免疫组化方法检测RBBP10蛋白在各种肿瘤中的表达,具有一定的应用价值.     

人磷酯酰蛋白聚糖3N端融合蛋白多克隆抗体制备及鉴定

目的：制备人磷酯酰蛋白聚糖3（Glypican3,GPC3）N端蛋白的多克隆抗体。方法：在大肠埃希菌Rosetta中诱导表达磷酯酰蛋白聚糖3N端融合蛋白,从SDS-PAGE中切胶纯化,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体。用辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,并用ELISA、Westen-blot检测抗体的灵敏度和特异性。结果：成功制备了抗磷酯酰蛋白聚糖3N端的多克隆抗体,抗体滴度为1：64000,经Western blot检测特异性良好。结论：成功制备了抗人磷酯酰蛋白聚糖3N端融合蛋白多克隆抗体。     

人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库的构建

目的　利用噬菌体表面展示技术 ,构建人源性胃癌抗体 Ig G1Fab噬菌体表面展示文库 .方法　从胃癌手术患者胃一级站淋巴结中提取总 RNA,反转录成 c DNA后 ,用PCR扩增人 Ig G1Fd段及κ轻链 ,并克隆至噬菌粒载体p COMB3中 ,转化宿主菌株 XL 1- Blue,以辅助噬菌体M13K0 7超感染噬菌粒文库 ,构建成人源性胃癌抗体 Ig G1Fab噬菌体表面展示文库 .结果　得到一个含克隆数为 1.2× 10 6 ,实际滴度约为 2 .5 6× 10 1 5 pfu· L- 1的 Ig G1Fab片段的噬菌体表面展示文库 .结论　Ig G1Fab片段的噬菌体表面展示文库的成功构建 ,为下一步利用亲和富集筛选技术 ,获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础     

抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ单链抗体库的构建及筛选

目的构建抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ(Histidine-rich protein Ⅱ,HRP-Ⅱ）单链抗体库,并筛选出阳性克隆。方 法用噬菌体抗体库技术构建抗恶性疟原虫ＨＲＰ－Ⅱ单链抗体库,并以ＨＲＰ－Ⅱ为靶抗原对该库进行了三轮“亲和吸附 一援救一感染扩增”的富集,挑取单菌落筛选并鉴定阳性克隆。结果获得目的基因并成功构建抗恶性疟原虫 ＨＲＰ－Ⅱ的 单链抗体库,库容为 １０６,并从中筛选出８株阳性克隆。结论 噬菌体抗体库技术具有高效的筛选性能,抗 ＨＲＰ－Ⅱ单链 抗体的制备为其在恶性疟的免疫快速诊断方法中的应用奠定了基础。     

噬菌体呈现技术筛选抗黑色素瘤单链抗体

目的：制备黑色素瘤单抗的单链可变区片段，用于肿瘤的诊断或靶向治疗。方法：从杂交瘤细胞提取总RNA，分别扩增出轻重链可变区基因(variable region of heavy chain，VH和variable region of light chain，VLDNA)，连接形成单链抗体(single chain fragment variable region，ScFv)DNA，将SeFv与载体pCANTAB 5E的连接产物转化大肠杆菌TGl，经M13K07超感染后，获得噬菌体抗体ScFvcDNA文库，用黑色素瘤细胞LiBr对重组的噬菌体抗体进行3轮吸附-洗脱-扩增亲和筛选后，随机挑选克隆经ELISA筛选鉴定。结果：vH、VL和ScFv分别约为360、330、750bp，从随机筛检的30个克隆中获得10个高亲和性噬菌体呈现型ScFv单克隆。结论：用噬菌体呈现技术制备的黑色素瘤ScFv，可为肿瘤的诊断和靶向治疗奠定基础。     

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒ORF65抗体的制备及其特异性检测

目的：制备高效价卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）病毒ORF65衣壳蛋白抗体并检测其特异性。方法将人工合成的ORF65蛋白抗原肽经弗氏佐剂乳化,在家兔背部、颌下等皮下多点免疫注射,间隔2周免疫,共4次。末次免疫后1周取兔血清,ELISA法检测兔免疫血清抗体IgG抗体水平。进一步采用免疫荧光、Western blot检测制备的抗血清中与ORF65结合的特异性。结果家兔在全程免疫后产生了高效价的特异性抗体,最高滴度达1∶12800。免疫荧光检测显示,与未经佛波酯（TPA）刺激的BCBL‐1细胞相比,兔抗血清主要结合于BCBL‐1细胞胞质,与ORF65蛋白在细胞内表达位置一致。Western blot结果显示在21 kD处有特异性蛋白条带,其大小与预期的ORF65蛋白大小相符,同时经T PA刺激的BCBL‐1细胞中ORF65蛋白表达量高于对照组,与ORF65蛋白裂解期蛋白的特性相符。结论用ORF65衣壳蛋白抗原肽段免疫家兔,可成功制备高效价的特异性抗血清,该抗体可与KSHV病毒ORF65蛋白特异性结合。     

Clusterin蛋白在大肠杆菌中的表达及其多抗制备

目的：在大肠杆菌中表达Clusterin蛋白,并制备其兔抗Clusterin蛋白的多克隆抗体。方法：从MCF-7细胞提取mRNA,逆转录为eDNA,以此为模板PCR扩增Clusterin编码基因;将Clusterin编码区eDNA插入的pRSET-A原核表达载体,构建pRSET-A-elusterin;将重组质粒转化BL21（DE3）感受态细菌,以IPTG诱导6×His-C1usterin融合蛋白的表达,经亲和纯化柱与凝胶柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,将纯化的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备成油包水悬液,常规免疫新西兰大白兔制备多抗,Western-blot检测该抗体识别内源性clusterin的特异性。结果：成功构建了Clusterin蛋白的原核表达载体pRSETA-clusterin;经表达并纯化的Clusterin蛋白纯度达到98％以上,免疫新西兰大白兔后制备得到了特异性的抗Clusterin的多抗。结论：成功地表达并纯化了Clusterin蛋白,并制备了特异性抗Clusterin多抗。     

PRODUCTION OF PHAGE-DISPLAYED ANTI-IDIOTYPIC ANTIBODY SINGLE CHAIN VARIABLE FRAGMENTS TO MG7 MONOCLONAL ANTIBODY DIRECTED AGAINST GASTRIC CARCINOMA

Objective.To generate phage-displayed anti-idiotypic single chain variable fragments(anti-Id ScFv) to MG7 monoclonal antibody(McAb) directed against gastric carcinoma so as to lay a foundation for developing anti-Id ScFv vaccine of the cancer.Methods.Balb/c mice were immunized i.p.with MG7 McAb conjugated with keyhole limpet hemocyain (KLH),and mRNA was isolated from the spleens of the immunized mice.Heavy and light chain (VH and VL) genes of antibody were amplified separately and assembled into ScFv genes with a linker DNA by PCR.The ScFv genes were ligated into the phagemid vector pCANTAB5E and the ligated sample was transformed into competent E.coli TG1.The transformants were infected with M13K07 helper phage to yield recombinant phages displaying ScFv on the tips of M13 phage.After 4 founds of panning with MG7,the MG7-positive clones were selected by ELISA from the enriched phages.The types of the anti-Id ScFv displayed on the selected phage clones were preliminarily identified by competition ELISA.Results.The VH,VL and ScFv DNAs were about 340 bp,320bp and 750 bp respectively.Twenty-four MG7-positive clones were selected from 60 enriched phage clones,among which 5 displayed β or γ type anti-Id ScFv.Conclusion.The anti-Id ScFv to MG7 McAb can be successfully selected by recombinant phage antibody technique,which paves a way for the study of prevention and cure of gastric carcainoma by using anti-Id ScFv.     

抗哇巴因抗体IgY的制备及其应用

目的 制备高度特异性的抗哇巴因多克隆抗体,并将其应用于组织中内源性哇巴因的免疫学检测.方法 采用哇巴因.牛血清蛋白耦联物作为免疫原免疫母鸡.免疫后1周收集鸡蛋.鸡蛋黄采用PEG-6000方法进行纯化分离,并采用12%SDS-PAGE分析其纯度.酶联免疫吸附法检测IgY抗体效价.然后应用IgY的竞争性酶联免疫吸附法检测哇巴因水平,并将IgY应用于大鼠肾上腺组织中内源性哇巴因的检测.结果 IgY抗体效价在第二次免疫后迅速升高,最高效价达到1:10240,并持续至少4周左右.竞争性酶联免疫吸附法检测哇巴因的批内差异及批间差异分别为2.03%、2.34%.免疫组化结果显示内源性哇巴因主要分布于大鼠肾上腺皮质的网状带,髓质未见明显阳性颗粒.结论 免疫母鸡简单、快速,并且高效价抗体持续时间较长.同时本研究结果提示IgY抗体可用于常规免疫学检测.     

Construction of Human ScFv Phage Display Library against Ovarian Tumor

In order to construct a single chain fragment variable (ScFv) phage display library against ovarian tumor, by using RT-PCR, the human heavy chain variable region genes (VH) and light chain variable region genes (VL) were amplified from lymphocytes of ovarian tumor patients and subsequently assembled into ScFv genes by SOE. The resulting ScFv genes were electrotransformed into E. coli TG1 and amplified with the co-infection of helper phage M13KO7 to obtain phage display library. The capacity and titer of the resulting library were detected. The phage antibody library with a capacity of approximately 3×109cfu/μg was obtained. After amplification with helper phage, the titer of antibody library reached 5×1012cfu/mL. Human ScFv library against ovarian tumor was constructed successfully, which laid a foundation for the screening of ovarian tumor specific ScFv for the radioimmunoimaging diagnosis of ovarian tumor.     

抗广州管圆线虫噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的以广州管圆线虫感染的小鼠脾细胞为源,构建抗广州管圆线虫抗体库,并筛选可用于广州管圆线虫病早期诊断的目的抗体。方法提取感染广州管圆线虫的小鼠脾细胞RNA,并逆转录合成cDNA第一链,PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻、重链基因先后连接到表达载体pComb3上,转化大肠杆菌XLI-Blue,构建组合文库。用广州管圆线虫排泄分泌抗原(EsAg)作为筛选抗原,进行富集筛选,用ELISA法鉴定阳性克隆。结果成功构建了小鼠抗广州管圆线虫噬菌体抗体文库,库容为2.32×106,滴度为1.7×1013cfu/ml。筛选到了抗广州管圆线虫排泄分泌抗原特异性抗体克隆5株,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行初步鉴定,具有一定的特异性。结论构建的抗广州管圆线虫噬菌体抗体库达到了要求,为研制广州管圆线虫金标诊断试剂盒奠定了基础。