血小板膜糖蛋白αⅡb基因A2334 C突变对αⅡ bβ3复合物合成及转运的影响--附一例报告

目的探讨血小板膜糖蛋白αⅡb基因A2334C突变对αⅡbβ3复合物合成的影响。方法构建αⅡb基因A2334C真核表达载体，测序正确后用脂质体将其与表达人整合素β3亚基的真核表达质粒αⅡbβ3共转染CH0细胞，对转染后细胞用Westelmblot法鉴定αⅡb基因A2334C突变体在CH0细胞中的总体表达；用流式细胞仪分析转运至细胞膜表面的αⅡb基因A2334C亚基；为了明确突变亚基的亚细胞定位，构建了αⅡb基因A2334C GFP融合蛋白表达质粒并用激光共聚焦显微镜确定GFP融合蛋白的细胞内定位。结果Western blot证明转基因CH0细胞有αⅡb A2334C基因的表达，但是成熟αⅡb的比例较正常对照低；流式细胞仪检测发现在细胞膜上有该亚基的分布，但是只有正常的25％；进一步的融合蛋白细胞内定位研究显示，αⅡb基因．A2334C GFP可以由内质网转运至高尔基体。结论αⅡb基因A2334C突变没有影响αⅡb的合成及其与B3的结合，但是仅有少部分前体αⅡb能够进一步形成成熟的αⅡb，其膜上的表达仅为正常的25％。该突变不影响αⅡbβ3由内质网向高尔基体的转运。该突变的致病机制可能是αⅡb的折叠错误使其容易降解导致膜上αⅡbβ3复合物减少及血小板功能减弱。     

利用显性阴性模型对整合素αⅡbβ3介导的信号转导的初步研究

本研究目的是明确整合素β3亚单位胞浆段序列在整合素αⅡbβ3介导的信号转导中的重要作用,并进一步了解在无αⅡb亚单位存在的条件下其对信号转导及特异性的影响程度。运用由IL-2R胞外段和跨膜段（Tac）与整合素β3胞浆段组成的融合蛋白（Tac／β3）,使其在表达GPIbIX、整合素αⅡbβ3的CHO细胞株（1bIX／ⅡbⅢa—CHO细胞株）中稳定表达（即得到IbIX／ⅡbⅢa—CHO／Tac-762细胞）,并进行多项试验,包括在固相纤维蛋白原的伸展、稳定黏附试验、细胞纤维蛋白凝块回缩功能试验以及游离纤维蛋白原结合试验（分别代表了外向内及内向外信号转导事件）。结果表明,在稳定表达有Tac／133的IbIX／ⅡbⅢa—CHO／Tac-762细胞中αⅡbβ3介导的双向信号转导严重受到抑制。结论：Tac／β3可以在IbIX／ⅡbⅢa—CHO／Tac-762细胞中发挥显著有效的显性阴性作用,并且证实整合素p3亚单位胞浆段的单独存在即可影响由αⅡbβ3介导的双向信号转导。     

血小板膜糖蛋白Ⅱb L721R和Q860X复合杂合突变导致血小板无力症的分子机制

目的 探讨血小板膜糖蛋白Ⅱ b L721R和Q860X复合杂合突变导致血小板无力症的分子机制.方法 应用PCR法对先证者αⅡ b和β3基因所有外显子及其侧翼序列进行扩增;PCR产物纯化后直接测序,检测其突变基因.突变位点经直接测序证实排除基因多态性.采用PCR定点突变法构建αⅡ b L721 R和Q860X突变真核表达载体,测序正确后用脂质体将其分别与表达β3亚基的真核表达载体共转染293T和CHO细胞.采用流式细胞术检测转染细胞膜上αⅡ bβ3的表达,用Westernblot法鉴定αⅡ b L721R和Q860X突变体在转染细胞内的总体表达,采用免疫荧光共聚焦显微镜确定αⅡb L721R和QS60X突变体的细胞内定位.结果 先证者在αⅡ b基因存在T2255G(L721R)和C2671T(Q860x)复合杂合突变.PCDM8 Ⅱ bL721R/PCDM8Ⅲa转染的293T细胞表面αⅡ b为野生型的2.1%,133为野生型的11.0%.PCDM8Ⅱ bQ860X/PCDⅢ8ma转染的293T细胞表面αⅡb为野生型的31.9%,B3为野生型的18.0%.Western blot法证实突变αⅡ b L721R与β3共表达后,可检测到前体αⅡ b(pro-αⅡb),但未检测出成熟αⅡb.αⅡ b Q860X与β3共表达后,检测到截短型αⅡ b蛋白.免疫荧光细胞内共定位研究显示L721R和Q860X突变αⅡ bβ3蛋白大部分分布于内质网,仅有少量在高尔基体中.结论 αⅡb L721R和Q860X突变不影响αⅡ b蛋白的合成和pro-αⅡbβ3复合物的形成,但阻碍了pro-αⅡbβ3复合物由内质网向高尔基体的转运,导致细胞内滞留,从而影响了αⅡbβ3在细胞表面的表达,是导致血小板表面缺乏αⅡbβ3复合物、产生血小板无力症的分子机制.     

SARS病毒S蛋白编码基因表达载体的构建及在Veto细胞中的表达

目的 构建含SARS病毒S蛋白编码基因片段的表达载体，并将其置于Vero细胞中表达。方法 设计1对PCR引物，在其下游引入Flag序列。通过PCR方法从质粒pGEX-6P-1-SARS-S中扩增出s蛋白编码基因，PCR产物经酶切后，插入表达载体peDNA3．1（＋）中，构建重组表达质粒peDNA3．1（＋）-SARS-S。重组质粒经酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析后转染Vero细胞，用抗Flag单克隆抗体通过Westernblot检测S蛋白片段在Vero细胞中的表达。结果 酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析示重组质粒构建完全正确；Western blot证实重组S蛋白片段能够在Veto细胞表达。结论 融合Flag序列的SAPS病毒S蛋白片段在Vero细胞中获得了正确表达。     

SARS病毒S蛋白编码基因表达载体的构建及在Vero细胞中的表达

目的构建含SARS病毒S蛋白编码基因片段的表达载体,并将其置于Vero细胞中表达。方法设计1对PCR引物,在其下游引入Flag序列,通过PCR方法从质粒pGEX-6P-1-SARS-S中扩增出S蛋白编码基因,PCR产物经酶切后,插入表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SARS-S。重组质粒经酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析后转染Vero细胞,用抗Flag单克隆抗体通过Western blot检测S蛋白片段在Vero细胞中的表达。结果酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析示重组质粒构建完全正确;Western blot证实重组S蛋白片段能够在Vero细胞表达。结论融合Flag序列的SARS病毒S蛋白片段在Vero细胞中获得了正确表达。     

表达血小板膜糖蛋白GPIb—IX复合物的中国仓鼠卵巢细胞株研究模型的建立

本研究旨在建立表达重组野生型和突变型血小板膜糖蛋白GPIb—IX复合物的中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary,CHO）细胞研究模型,为进行GPIb-Ⅸ生理功能的相关研究奠定基础。从表达野生型或缺失突变型GPIbα的大肠杆菌宿主茵中抽提质粒并用EcoRI酶切鉴定,然后将分别表达GP／bα、GPIbβ和GP／X3种基因的质粒共转染到中国仓鼠卵巢细胞中,通过免疫共沉淀、Western blot和流式细胞仪检测其表达效果。结果表明,转染48小时后,CHO细胞裂解物和细胞表面均可检测到GPIb-Ⅸ复合物的表达。结论：成功构建了表达血小板膜糖蛋白GPIb—IX复合物的CHO细胞研究模型。     

ICAM-1-GFP的构建及其与Molt-4细胞的结合

本研究构建人细胞间黏附分子1（ICAM-1）全长基因的真核表达载体pEGFP—CI—ICAM—1,转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO—K1）细胞株,并检测其在cH0细胞中的表达及与Molt-4细胞的结合。采用RT—PCR法从健康人外周血中分离单个核细胞,钓取ICAM-1全长基因（1622bp）,与pMD18-T载体连接做全自动序列测定。将测序正确的克隆质粒pMD18-T—ICAM-1和表达载体pEGFP—C1分别用HindⅢ和Ⅰ进行双酶切,应用基因重组技术构建ICAM-1全长基因真核表达载体pEGFP—C1-ICAM-1,质粒经Hindm和SacⅡ双酶切和PCR电泳鉴定后,采用脂质体转染法转染CHO细胞,并进行G418筛选。用RT—PCR、流式细胞术和荧光显微术检测ICAM-1-GFP的表达及亚细胞的定位,用检测ICAM-1-GFP／CHO细胞与Molt-4细胞的结合能力评价ICAM．1-GFP融合蛋白的功能。结果表明：重组质粒经限制性酶切鉴定得到与ICAM—1全长基因长度-致（1622bp）的酶切产物;测序分析证实,PCR产物与GenBank上登录的ICAM-1基因（NM-000201）序列完全-致,表明成功地完成了ICAM-1的扩增和表达载体的构建;荧光显微镜下可见转染的CHO细胞有绿色荧光蛋白的表达,表达的融合蛋白较均匀地分布于整个细胞：FACS检测ICAM．1-GFP的荧光转染率为（13±5．5）％,表明ICAM—1—GFP基因进入到CHO细胞并获得了有效表达,成功构建了ICAM-1-GFP／CHO细胞,并且ICAM-1-GFP／CHO细胞能够结合PMA处理的Molt-4细胞。结论：成功构建了ICAM-1-GFP真核表达载体,构建的ICAM—1—GFP真核表达载体在CHO细胞内稳定表达,／CAM—1—GFP／CHO细胞能与M0lt-4细胞结合,这为进-步研究ICAM-1分子的功能打下基础。     

重组分泌型人类免疫缺陷病毒Tat蛋白在真核细胞中的表达及活性检测

目的 构建人类免疫缺陷病毒病毒 tat基因的重组分泌型真核表达载体并在真核细胞中表达,检测表达的重组蛋白活性。方法 聚合酶链反应（PCR）从重组质粒pcDNA3．1（＋）/Tat中扩增tat基因,利用 HindⅢ和Bam HⅠ酶切位点分别将tat基因正向、反向插入分泌型载体pSecT ag ,获得正向插入克隆（pSecT at ）和反向插入克隆（pSecTat-AS）,经双酶切鉴定连接成功后,利用测序鉴定其序列和插入方向。将构建的重组质粒转染293细胞,利用Western blot法检测Tat蛋白的表达。进而将重组质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞,CAT-酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其细胞内CAT表达,从而检测Tat蛋白的活性。最后将转染重组质粒的293细胞与转染LTR-CAT报告质粒的BCBL-1细胞用Transwell培养系统共培养,CAT-ELISA检测分泌型Tat蛋白的旁分泌调控活性。结果 PCR扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶上约300 bp位置出现条带,与预期的324 bp大小相符;经HindⅢ和BamHⅠ分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的 tat基因序列与Gen-Bank中登记的HIV-1 tat基因100％同源。正向克隆质粒转染293细胞后,Western blot法检测观察到约19×10^3蛋白条带。正向克隆质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞CAT 表达量高于反向克隆质粒转染细胞（P＜0．05）。与反向克隆对照相比,与正向克隆转染的293细胞共培养的BCBL-1细胞CAT表达量更高（P＜0．05）。结论 成功构建 HIV-1 tat基因基因分泌型真核表达载体,该载体不但可在真核细胞内表达具有调控活性的T at蛋白,表达的Tat蛋白还可分泌至细胞外并具有调控活性。     

老年神经变性疾病机制研究的基础：人α—突触核蛋白基因在原核细胞中的蛋白表达

目的：为提供人α—突触核蛋白(α—synuclein)抗原，制备抗体以研究其自身聚集在老年神经变性疾病病理机制中所起作用，重组质粒载体、进行DNA测序，以用于α—突触核蛋白基因在原核细胞中的蛋白表达。方法：将质粒pcDNA3NACO(pcDNA3α-svnuclein cDNA)和质粒载体proEXMTHT1分别进行酶切，取α—突触核蛋白cDNA片段，重组于proEX MTHT1质粒载体上；酶切鉴定后测序；再将重组质粒proEXNACP转染进入DH5α大肠杆菌体内；用IPTG诱导α—突触核蛋白基因产生蛋白；将α突触核蛋白纯化后行Western杂交。结果：质粒pnoEX MTHT1和pcDNA3NACP经限制性内切酶消化分别得到4750bp和550bp DNA片段。α—突触核蛋白基因在原核细胞中蛋白表达量为10mg／L。表达蛋白经Western杂交证实为α—突触核蛋白。结论：α—突触核蛋白基因在原核细胞的蛋白表达可作为体内外研究老年神经变性疾病病理机制的基础研究。     

CHO细胞模型中整合素β3胞浆段尾部NITY基序对αⅡbβ3介导的细胞功能的影响

目的:探讨整合素β3胞浆段尾部NITY基序对αⅡbβ3介导的细胞功能的影响。方法:利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞模型建立共表达人类野生型整合素αⅡb和野生型β3或突变型β3ΔNITY(β3胞浆段缺失NITY基序)稳转的细胞株,通过细胞在固相化纤维蛋白原上的黏附及伸展试验检测各稳转细胞株的黏附及伸展功能,通过免疫共沉淀方法检测蛋白相互作用。结果:成功建立了CHO-αⅡbβ3和CHO-αⅡbβ3ΔNITY细胞株,稳定表达野生型整合素αⅡbβ3的CHO细胞具有在固相化纤维蛋白原上的黏附和伸展能力,与CHO-αⅡbβ3细胞株相比,CHO-αⅡbβ3ΔNITY细胞株的黏附能力减弱,但是黏附后的伸展能力无明显改变。免疫共沉淀结果显示,kindlin-2能够结合野生型整合素β3,但与突变型整合素β3结合的量显著减少。结论:整合素β3胞浆段缺失NITY基序引起细胞黏附功能受损,这种缺失突变导致整合素β3与kindlin-2蛋白的结合受到抑制,从而部分抑制了整合素β3的信号转导。     

带J链的α-防御素-1基因转染COS-7细胞后的表达检测

目的将α-防御索-1（HNP-1）基因与J链基因重组为一种新的杀菌肽分子J-HNP-1，观察J-HNP-1在细胞内的表达及分泌情况。方法采用聚合酶链反应（PCR）方法分别从pCH-J质粒和pBabeNco-HNP-1质粒中扩增出J链和HNP-1；进行重组PCR，获取J-HNP-1 DNA片段．并插入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3．1（-）／Myc-HisC中；用脂质体转染法将此重组真核表达载体导入COS-7细胞。然后应用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测His-tag标签基因。结果用抗His抗体检测到细胞可溶性蛋白及培养上清在约24ku处均有强反应条带显示，其大小与预测相符；对照组未见相应条带显示。结论采用Western blot检测到新的杀菌肽分子J-HNP-1在细胞内得到表达并分泌到细胞外．为进一步研究J-HNP-1杀菌肽的抗菌活性奠定了基础。     

SARS病毒M蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并检测其在Vero细胞中的表达.方法 在PCR引物下游引入Flag序列,以PCR从质粒pGEX-6P-1-SARS-M中扩增M蛋白编码基因片段,将酶切后的PCR产物克隆至pcDNA3.1(+)中,构建并鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-SARS-M.重组质粒经Superfect转染Vero细胞,Western blot检测基因表达情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和基因测序显示构建正确;Western blot检测表明重组M蛋白片段在Vero细胞中获得正确表达.结论 成功构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并在Vero细胞中获得正确表达,为进一步研究M蛋白的功能奠定了基础.     

抗热休克蛋白72多克隆抗体血清的制备和检测

目的 探讨在大肠杆菌中表达人热休克蛋白72（hHSP72）与组氨酸（His）的融合蛋白并制备其抗体血清的方法。方法 将hHSP72片断插入His融合表达载体pPROEX-1^TM，重组载体酶切鉴定后，在大肠杆菌中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达获得His-hHSP72融合蛋白。采用纯化后的HSP72免疫新西兰白兔，制备抗血清；蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测重组抗原的免疫活性。结果 重组质粒酶切鉴定结果表明，hHSP72基因已正确插入到pPROEX-1^TM中，经IPTG诱导后，表达出分子质量约为73ku的蛋白，获得了效价为1：100000的多克隆抗体。Western blot检测证明，所制备的多克隆抗体可以与hHSP72特异性结合，其效价高于市售的单克隆抗体。结论 用hHSP72片断在大肠杆菌中能成功表达，并能制备得到多克隆抗体；这种多克隆抗体是一种新的高特异性和高灵敏度的试剂。     

重组糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂的表达和纯化

观察糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂重组GST KGDX(谷胱甘肽S 转移酶 赖 甘 天冬 X)融合蛋白对血小板聚集的抑制作用。设计合成了两条编码KGDX(赖 甘 天冬 X)的寡核苷酸链 ,两端分别为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。将该基因插入原核高效表达载体pGEX 4T 1的tac启动子下游 ,获得重组质粒 pGEX 4T 1KGDX ,转化大肠杆菌DH5a,37℃诱导使重组子表达。GST KGDX融合蛋白具有可溶性 ,产量为 35mg/L培养基 ,表达量占菌体总蛋白的 48.0 2 %。破碎菌体上清经谷胱甘肽 琼脂糖悬珠亲和层析法获得纯度为 95 %的重组蛋白。血小板凝聚仪检测活性表明 ,在体外GST KGDX融合蛋白抑制ADP诱导的人血小板聚集作用强于GST(P <0 .0 5或 <0 .0 1 )。全血流式细胞术结果表明 ,GST KGDX能与GPⅡb/Ⅲa受体特异性结合。结论 :大肠杆菌中能够表达出较高产量的GST KGDX融合蛋白 ,为抗血小板药物提供了一个很好的蛋白质来源     

重组变异体二氢叶酸还原酶和绿色荧光蛋白腺相关病毒载体的构建及外源基因表达

构建携带变异体二氢叶酸还原酶（mDHFR)和绿色荧光蛋白（GFP）融合基因的重组腺相关病毒（AAV）载体，并使其在NIH3T3细胞中表达，观察NIH3T3细胞的耐药性变化。先分别扩增mDHFR和GFP基因片段，并用甘氨酸接头以PCR的方法将其连接在一起，插入T载体，酶切后插入AAV载体，包装成病毒后感染NIH3T3细胞，通过PCR、荧光显微镜和流式细胞术对融合基因的表达进行观察，结果：PCR检测到NIH3T3细胞DNA基因组中mDHFR和GFPcDNA，荧光显微镜和流式细胞仪观察到绿色荧光蛋白表达的比率约为25％，MTT法检测转基因组对MTX的耐药性增强，结论：AAV载体可将mDHFR和GFP融合基因导入NIH3T3细胞并成功表达，使其对MTX的耐药性增强，为mDHFR基因和AAV载体在基因治疗中的应用提供了理论依据。     

白细胞介素13对HEL细胞分化和转录因子c-fos表达的影响

目的研究白细胞介素13（IL-13）对红白血病细胞系HEL细胞分化作用及对HEL细胞转录因子c-fos表达的影响。方法用RT—PCR方法检测HEL细胞IL-13受体仪1、GPⅡb、vWF和c-fos基因mRNA表达，用Western blot和流式细胞术分别检测IL-13受体α1、c-fos、GPⅡb和vwF蛋白水平的表达。结果HEL细胞表达IL-13受体α1，用IL-13（100ng／ml）作用于HEL细胞，GPⅡb和vWF基因mRNA表达上调，实验组和对照组GPⅡb／β-actin吸光度比值分别为2．912，1．303，实验组为对照组的2．23倍（P〈0．05）；实验组和对照组vWV／f3一actin吸光度比值分别为0．506，0．217，实验组为对照组的2．33倍（P〈0．05）。流式细胞术分析结果显示，实验组GPⅡb和vWF蛋白表达明显高于对照组。IL-13作用于HEL细胞30min，c—fos基因mRNA表达水平达高峰，IL-13作用HEL细胞60min，c—fos蛋白表达达高峰，30min组、60min组c-fos/β-actin吸光度比值高于其它各组（P〈0．05）。结论IL-13可促进HEL细胞分化，并上调c-fos表达。     

肿瘤标记蛋白Prdx1-pMSCV质粒的构建和鉴定

目的构建含有过氧化物氧化还原酶1(Prdx1)基因的pMSCV重组质粒,转染至人气道上皮细胞内,并进行鉴定,为进一步研究Prdx1在细胞内的功能奠定基础。方法构建Prdx1-pMSCV质粒,将Prdx1mRNA编码区序列克隆至pMSCV载体上,测序验证后大量提取,转染至BEAS-2B细胞内,细胞内可高表达Prdx1蛋白,收集总mRNA和蛋白裂解液分别进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Prdx1-mRNA和蛋白质印迹(Western blot)检测Prdx1蛋白变化。观察质粒转染后细胞内Prdx1高表达。结果重组质粒经限制性内切酶EcoRⅠ和BglⅡ双酶切及测序鉴定均证实Prdx1基因已正确克隆到pMSCV质粒载体中。Western blot结果进一步证实Prdx1-pMSCV重组质粒构建正确。结论本研究正确构建了Prdx1-pMSCV质粒。     

转化生长因子-βⅡ型受体特异性短发夹状RNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的：针对转化生长因子-β（TGF-β）Ⅱ型受体基因的不同部位，构建不同TG-βⅡ型受体特异性短发夹状RNA（shRNA）表达质粒载体，在转录后水平抑制TGF-βⅡ型受体的表达，对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。方法：用DNA重组技术将针对人TGF-βⅡ型受体基因不同部位所设计的4对shRNA序列克隆到真核表达质粒pSilencer^TM 3．1-H1 neo vector中，构建TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencer^TM3．1-H1-TGF-β R ⅡshRNA1、2、3、4。脂质体介导转染成人原代成纤维细胞，经G418筛选抑制TGF-βⅡ型受体表达的稳定细胞克隆。结果：3个TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencer^TM3．1-H1-TGF-βRⅡ shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RT-PCR、Westem blotting均证实3种shRNA重组质粒中pSilencer^TM3．1-H1—TGF-βRⅡshRNA2可明显降低细胞内TGF-βⅡ型受体mRNA峰度及TGF-βⅡ型受体蛋白表达。结论：成功构建了TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilenceir^M3.1—H1-TGF-βRⅡshRNA1、2、3，并筛选出特异而高效的阻断TGF-βⅡ型受体表达的克隆。此实验结果为进一步研究TGF-βⅡ型受体蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础。     

PSNAV2.0-TNFα重组质粒的构建及其在体外的表达

目的:在前期微囊化基因工程细胞制备平台的基础上,构建分泌型人肿瘤坏死因子α的真核表达载体PSNAV2.0-TNFα重组质粒,并鉴定其蛋白的体外瞬时表达,为进一步利用该基因进行微囊化细胞移植治疗和改善疾病奠定基础。方法:实验于2006-06/2007-05在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学实验室完成。①以含有人肿瘤坏死因子αcDNA序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得人肿瘤坏死因子α基因片段;将其定向插入真核表达载体PSNAV2.0中,获得重组质粒PSNAV2.0-TNFα。采用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切法、PCR法及插入片段序列测定法鉴定该质粒。②利用阳离子脂质体介导法,将其转染到人胚胎肾细胞HEK-293细胞中,构建可持续分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞,采用RT-PCR法和Western blot法检测转染细胞培养上清液中人肿瘤坏死因子蛋白的体外瞬时表达。结果:①通过SalⅠ和EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证明:在HEK-293中插入片段正确。②采用RT-PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有人肿瘤坏死因子α蛋白,Mr17000。结论:成功构建了重组质粒PSNAV2.0-TNFα真核表达载体,转染HEK-293细胞后可有效分泌人肿瘤坏死因子α蛋白,并能分泌到细胞外。     

重组pEGFP-C1-Smad4表达载体的构建及在SGC7901细胞中的表达

目的：构建pEGFP-C1-Smad4表达载体,并观察其在人胃癌SGC7901细胞中的表达。方法： 应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白与Smad4的融合表达载体,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析,用基因转染技术将其转入人胃癌SGC7901细胞,荧光显微镜、Western blot检测其表达。结果： 酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入的目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确,在转染的人胃癌SGC7901细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测到Smad4在蛋白水平的表达。结论：pEGFP-C1-Smad4表达载体便于观察转染细胞中EGFP-C1-Smad4融合蛋白的表达情况,为进一步研究Smad4在胃癌发生中的作用奠定基础。