正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库的构建及差异基因的初步筛选

目的构建人正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.方法采用抑制削减杂交技术,以正常肝组织及有肝癌背景的肝硬化组织作为对比材料.分离出mRNA,经反转录后,通过两轮杂交、两次PCR和T/A克隆构建了两种组织间差异表达基因的cDNA削减文库.结果挑取70个克隆进行酶切和PCR鉴定,显示65个克隆有250～2000 bp插入片段.结论用SSH和T/A克隆技术成功构建了正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.该文库的建立为进一步筛选、鉴定出肝癌发生过程中的相关调控基因奠定了基础,也有助于阐明肝硬化在肝癌发生过程中所起的作用.     

人胃癌细胞定向克隆表达cDNA文库的构建及鉴定

目的：克隆胃癌的相关基因。方法：提取人胃癌细胞总RNA，分离其mRN。以NatI／oligo（dT）12-18为引物合成双链。cDNA，除去小于400bp的cDNA片段后，连接EcoRⅠ人工接头，经NotⅠ酶酶切，插入定向克隆表达载体λExcellNotI／EcoRI／CIP，体外包装后转染大肠杆菌NM522，构建了人胃癌细胞MGC－803定向克隆表达。cDNA文库。结果：文库含1．2×106个重组子，重组率为96．7％。用PCR技术鉴定，文库中插入cDNA的平均大小为1kbc结论：该文库适于筛选各种丰度mRNA的cDNA克隆。     

筛选cDNA文库获取肿瘤相关基因

全文分绍普通cDNA文库、消减cDNA文库与时间间隔cDNA文库(TSS cDNA文库)进行核酸探针杂交筛选、免疫学筛选目的基因及其片段的方法和相关的新进展；对cDNA文库在肿瘤相关基因研究方面的具体应用作了简单的举例说明。     

鼻咽癌组织差异表达cDNA序列的克隆与鉴定

目的：分析鼻咽癌组织中的差异基因,寻找与鼻咽癌病理过程相关的新的癌基因的抑癌基因。方法：应用抑制性消减杂交法,构建了鼻咽组织与正常鼻咽组织的消减库;用差异筛选技术筛选出阳性克隆;用Southern blot和Northern blot杂交证实了阳性克隆的可靠性,用序列分析确定了阳性克隆的性质。结果：从消减库中获得了12个阳性克隆;序列分析表明,8个克隆与已知基因高度同源,2个为新的候选基因,2个新的候选基因在两个不同的消减库中确实存在差异,而其中的一个新基因在鼻咽癌组织和细胞系中下调表达。结论：抑制性消减杂交是分析相关基因的较好的方法,发现了两个与鼻咽癌病理过程有关的新的cDNA。     

人胃癌细胞定向克隆表达cDNA文库的构建及鉴定

克隆胃癌的相关基因，方法，提取人胃癌细胞总ＲＮＡ，分离共ｍＲＮＡ。以ＮｏｔｔＩ／ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２－１８为引物合成双链ｃＤＮＡ，除去小于４００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段后，连接ＥｃｏＲＩ接头，经ＮｏｔＩ酶酶切，插入定向克隆表达载体λＥｘｃｅｌｌＮｏｔＩ／ＥｃｏｒＲＩ／ＣＩＰ，体外包装后转染大肠杆菌ＮＭ５２２，构建了人胃癌细胞ＭＧＣ－８０３定向克隆表达ｃＤＮＡ文库。结果：文库含１．２＊１０＾６个重组子，     

人肝癌细胞定向克隆表达cDNA文库的构建及鉴定

为克隆人肝癌相关基因，本实验从提取人肝癌细胞总ＲＮＡ入手，分离其ｍＲＮＡ。以ＮｏｔＩ／ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２－１８为引物合成双链ｃＤＮＡ，除去小于４００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段后，连接ＥｃｏＲＩ人工接头，经ＮｏｔＩ酶酶切，     

人脑胶质瘤SHG—44cDNA文库的构建和鉴定

从人脑胶质瘤体外细胞系SHG－44中抽提总RNA，亲和纯化分离mRNA．逆转录合成cDNA，经重组连接，体外包装，感染大肠杆菌Y1090后建成的SHG－44cDNA文库，其库容量含9．25×105原代重组子，重组百分比94．9％，克隆效率为1．04×10pfu／μgcDNA．同时，以兔抗牛GFAP多抗为探针对该文库进行免疫筛选，得到了两个GFAP相关基因的cDNA克隆，在表达水平上，该cDNA文库含GFAP基因的频率为1．2×10-5，从而证实文库中有目的基因的有效表达，为与此相关的分子生物学研究提供了一个有用的工具。     

nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株抑制消减cDNA文库的构建

背景与目的 已有的研究表明,nm23-H1基因是一个重要的肺癌转移抑制基因,为了筛选与该基因表达相关的差异表达基因.本研究拟构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆与nm23-H1转移相关的基因奠定基础.方法利用抑制消减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)技术构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)间差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库,经蓝白菌落筛选克隆,并PCR反应鉴定.结果 成功构建了该两株细胞株差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选,正向消减文库总共获得约300个白斑克隆,反向消减文库总共获得约400个白斑克隆,从正反向消减文库中各挑选96个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示在挑选的正向文库中有84个克隆有插入片段,反向文库中有83个克隆有插入片段.其片段大小范围为(300-750)bp.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,我们应用SSH法和T/A克隆技术成功建立了nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库.nm23-H1基因在肺癌细胞中的表达可能影响某些转移相关基因的差异表达.     

K562细胞消减cDNA文库的构建及初步鉴定

背景与目的:消减杂交技术是一种寻找和克隆差异基因的方法。本研究目的是通过快速、高质量构建消减cDNA文库,筛选K562细胞中差异表达基因。方法:以用限制性显示(restriction display,RD)技术制备的K562细胞cDNA片段作为消减对象,以正常人淋巴细胞的Sau3AⅠ酶解cDNA片段对其进行消减。经过消减后的RD片段被分组扩增出来,并克隆于T载体中,挑选阳性克隆进行测序并进行初步分析。结果:构建的K562细胞消减cDNA文库,包含360个阳性克隆,插入片断大小范围在200～800bp之间,选取50个克隆进行测序分析,结果为来源于42个已知基因。结论:利用自行建立的消减杂交法,成功构建了特异性K562细胞消减cDNA文库,文库质量可靠,可用于进一步筛选及克隆K562细胞中差异表达基因。     

人鼻咽上皮细胞株HNE—1染色体高分辨显带的研究

作者首次采用高分辨染色体G显带技术,对本室建立的人鼻咽癌上皮细胞株“湖南一号”(HNE-1)进行了细胞遗传学研究。HNE-1细胞株在第15代时,染色体数目变异在68—78之间,众数为74。所检细胞均含有结构异常的染色体。出现频率比较高的标记染色体15条,其中某些标记染色体只有在高分辨染色体上才清楚地显示出结构重排。此外还发现少数细胞内存在双微体和核内复制。与其它鼻咽癌上皮细胞株比较,发现7号染色体部分缺失del(7)(q32)在CNE、HNE-1及鼻咽癌活检组织中同时存在,这一标记染色体可能与鼻咽癌的发生有重要联系。     

COPS3基因cDNA的克隆及表达

目的：克隆COPS3基因cDNA,构建其原核融合蛋白表达载体并表达和鉴定。方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得COPS3基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定。将COPS3基因插入pET28a融合蛋白表达载体中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析。免疫印迹法鉴定COPS3蛋白的表达。结果：cDNA测序证明,获得了COPS3基因cDNA,其序列与Genebank中报道序列完全一致。酶切分析表明,成功构建了含COPS3基因的pET28a融合蛋白表达载体。SDS-PAGE以及免疫印迹法鉴定分析表明,COPS3蛋白获得高效表达,分子质量为51Ku,表达量约占菌体总蛋白的30%。结论：成功克隆和表达了COPS3 cDNA。     

人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因消减cDNA文库的构建和初步筛选

背景与目的 筛选肺癌转移相关基因有助于阐明肺癌侵袭转移的分子机理.为了筛选不同转移潜能肺癌的转移相关差异表达基因,本研究构建不同转移潜能的人大细胞肺癌细胞株NL9980和L9981间差异表达基因的消减cDNA文库,并对消减文库进行初步筛选.方法 应用抑制消减杂交技术构建人大细胞肺癌高低转移株NL9980与L9981间差异表达基因的正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库,利用α互补原理,经蓝白菌落初步筛选获得阳性克隆,应用斑点杂交的方法对正向和反向消减cDNA文库进行杂交筛选.结果 成功构建了人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因的正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选和斑点杂交,正向消减文库获得了307个阳性克隆,反向消减文库获得了78个阳性克隆.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,利用此方法可以成功构建人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因消减cDNA文库.不同转移潜能人大细胞肺癌细胞株中存在可能与转移相关的差异表达基因.     

鼻咽癌患者血清抗体相关抗原优势表位的筛选

背景与目的：EB病毒与鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)密切相关。可应用多种血清学方法检测鼻咽癌患者血清EBV抗体,本研究利用鼻咽癌患者血清中纯化的EB病毒相关多抗,从噬菌体展示的随机肽库中筛选相关的优势抗原表位,在表位水平为鼻咽癌患者血清抗体的检测寻找新的检测抗原。方法：以B95-8细胞EBV蛋白为抗原,从鼻咽癌患者血清中洗脱EB病毒相关多抗,对噬菌体展示的随机12肽库进行三轮生物淘洗。用夹心ELISA法和竞争抑制实验筛选阳性克隆,对这些阳性克隆进行测序,并将其展示的外源多肽与EB病毒蛋白的抗原性区域进行同源序列比对分析。结果：从第三轮的淘洗洗脱液中随机挑取64个噬菌体克隆,用夹心ELISA法筛选到25个阳性克隆,阳性率为39．06％,选取其中13个克隆进行竞争ELISA实验,有11个克隆出现抑制现象,抑制率在18．09％～65．94％之问。选取吸光度(A)值和抑制率均较高的5个克隆为阳性克隆,它们所展示的外源多肽序列分别为-A-T-S-H-L-H-V-R-L-P-W-T-(d15／d18)、-G-S-T-H-K-H-N-H-F-N-K-T-(d19)、-K-P-I-H-E-H-P-H-R-F-K-S-(e8)、-H-T-H-K一1-K-I-P-LP-I-Q-(e23)。这些多肽序列分别与EB病毒膜蛋白(d15／d18)、EB病毒胸苷激酶(d19)、EB病毒主要壳蛋白(e8,e23)抗原区域的氨基酸存在序列相似性。结论：利用鼻咽癌患者血清中的特异多抗可以从噬菌体展示的随机肽库中筛选到EB病毒相关抗原表位。     

鼻咽癌克隆株裸鼠移植瘤自发性转移及群体增殖能力的研究

将鼻咽癌克隆细胞ＣＮＥ－２Ｚ－Ｈ５、Ｆ１及Ｈ５移植瘤之淋巴结及肺转移灶组织，移植入裸鼠皮下，观察其自发性转移、同时研究了转移组和非转移组移植瘤之间，不同生长时间瘤重，体积倍增时间及增殖细胞核抗原表达的差异。结果显示：各类移植瘤的转移能力及途径均不同；在一定生长时间内，转移组移植瘤重大于非转移组（Ｐ〈０．０５），体积倍增时间较非转移组短（Ｐ〈０．０５），增殖细胞核抗原表达较非转移组强。提示：淋巴结及     

NGAL基因cDNA的克隆及其表达载体的构建

目的：克隆NGAL基因的cDNA,并构建其表达载体。方法：应用RT－PCR技术,从食管癌细胞系SHEEC中扩增出NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因的cDNA,并重组到中间载体pT-Adv中,经测序和与NCBI数据库比较证实是NGAL基因的全编序列。然后把它分别插入到真核表达载体pcDNA3和原核表达载体pGEX-4T-3中。结果：获得了NGAL基因的cDNA全序列,构建了NGAL的正、反向真核表达载体pcDNA-NGAL( /-)和原核表达载体pGEX－NGAL,并在大肠埃希菌TOP10F′中成功地表达出NGAL融合蛋白。结论：为研究NGAL基因的新功能和制备其抗体,进而阐明NGAL在食管癌等肿瘤中的生物学作用提供了有利工具。     

EBV-LMP1上调Ezrin表达对鼻咽癌细胞转移潜能的影响

背景与目的:细胞骨架相关蛋白Ezrin的异常表达与肿瘤侵袭转移密切相关,既往研究已证实EB病毒潜伏膜蛋白1(Epstein-Barr virus latent membrane protein1,EBV-LMP1)可促进鼻咽癌细胞的转移能力。本研究旨在进一步探讨EBV-LMP1是否通过改变Ezrin的表达来影响鼻咽癌细胞的转移能力。方法:采用免疫细胞化学和Western blot检测两种鼻咽癌细胞株-CNE1细胞(EBV阴性)和CNE1-GL细胞(稳定转染EBV-LMP1)中LMP1和Ezrin的表达;细胞-基质粘附实验检测CNE1、CNE1-GL和经Ezrin抗体预处理的CNE1-GL细胞(AntiEzrin-CNE1-GL)对细胞外基质的粘附力;Transwell小室法检测上述3种细胞的运动和对重组基底膜侵袭能力。结果:CNE1细胞中Ezrin阴性表达,而CNE1-GL细胞中Ezrin强阳性表达。CNE1-GL细胞对细胞外基质的粘附率[(89.38±6.12)%]强于CNE1细胞[(49.42±5.37)%](P<0.001),而AntiEzrin-CNE1-GL细胞对基质的粘附率[(56.94±4.08)%]明显下降,与CNE1-GL相比,差异有统计学意义(P<0.05)。运动实验和侵袭实验均提示CNE1-GL细胞运动、侵袭能力(107±11和179±25)强于CNE1细胞(27±3和46±6),差异均有统计学意义(P<0.001),而AntiEzrin-CNE1-GL细胞的运动、侵袭能力(38±4和51±5)较CNE1-GL细胞显均显著下降(P<0.001)。结论:CNE1细胞中EBV-LMP1可通过上调Ezrin表达来促进细胞转移。     

p16基因的表达上调对鼻咽癌细胞恶性表型的影响：p16基因在鼻咽癌中的改变

探讨上调Ｐ１６基因的表达对鼻咽癌细胞恶性表型逆转的作用,为Ｐ１６基因在处鼻咽癌发病过程中具有一定的作用提供直接的语气方法,本文采用电穿孔的方法向Ｐ１６基因表达下调的鼻咽癌细胞系ＨＮＥ１中导入全长野生型的Ｐ１６ｃＤＮＡ,通过Ｇ４１８筛选获得可以稳定传代的转当细胞系,对其中４个转染细胞系以ＰＣＲ和Ｎｏｒｈｅｒｎ杂交鉴定转染细胞系中外源Ｐ１６ｃＤＮＡ整合以及Ｐ１６基因表达的状况,并借助比较细胞倍增时间,     

NGAL基因cDNA的克隆及其表达载体的构建

目的 :克隆NGAL基因的cDNA ,并构建其表达载体。方法 :应用RT PCR技术 ,从食管癌细胞系SHEEC中扩增出NGAL(neutrophilgelatinase associatedlipocalin)基因的cDNA ,并重组到中间载体pT Adv中 ,经测序和与NCBI数据库比较证实是NGAL基因的全编序列。然后把它分别插入到真核表达载体pcDNA 3和原核表达载体pGEX 4T 3中。结果 :获得了NGAL基因的cDNA全序列 ,构建了NGAL的正、反向真核表达载体pcDNA NGAL( - )和原核表达载体pGEX NGAL ,并在大肠埃希菌TOP10F′中成功地表达出NGAL融合蛋白。结论 :为研究NGAL基因的新功能和制备其抗体 ,进而阐明NGAL在食管癌等肿瘤中的生物学作用提供了有利工具。     

DMBT1在鼻咽癌中的表达及临床意义

目的 探讨脑恶性肿瘤缺失基因1（DMBT1） 在鼻咽癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法 采用免疫组化法检测69例鼻咽癌及36例癌旁正常组织中DMBT1蛋白表达。分析DMBT1表达与鼻咽癌临床病理特征及预后的关系。结果 DMBT1蛋白在鼻咽癌及癌旁正常组织中的阳性表达率分别为33.3％（23／69） 和75.0％（27／36）,差异有统计学意义（P＜0.05）。DMBT1表达与T分期、分化程度、淋巴结转移及临床分期有关（P＜0.05）。Kaplan-Meier法分析显示,23例DMBT1阳性表达者的中位生存时间（OS）为60.0个月,而46例DMBT1阴性表达者的中位OS为47.0个月,差异有统计学意义（P＜0.05）。Cox多因素回归分析显示,DMBT1表达是影响鼻咽癌预后的独立因素（P＜005）。结论 DMBT1在鼻咽癌发生发展过程中有重要作用,可作为判断鼻咽癌患者预后的指标。