基于PCR-LIS-SSCP的白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因比较研究

目的通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因PCR-LIS-SSCP图谱的比较,探讨两相细胞在DNA水平的差异。方法分别抽提16株来自同一亲本且对氟康唑敏感性不同的白念珠菌菌丝相与酵母相基因组DNA,根据ERG11基因序列设计7对引物,对其进行分段PCR扩增,扩增产物经单链变性后,以非变性聚丙烯酰胺凝胶进行SSCP分析。结果16株白念珠菌菌丝相与酵母相均能扩增出目的片段,SSCP图谱显示两相细胞的ERG11基因序列存在多位点差异。结论白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11,基因存在着差异。     

白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因差异性分析

目的 探讨白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因间的差异.方法 将16株同一亲本来源、对氟康唑敏感性不同的白念珠菌(CA-1～CA-9、CA-11～CA-17)进行菌丝相与酵母相培养后,分别抽提基因组DNA,设计引物扩增ERG11基因,扩增产物分别用Acc I、Mun I、Afl Ⅱ消化,电泳后比较两相细胞RFLP图谱,同时用下游引物P₂对ERG11基因扩增产物进行反向测序.结果 Acc I、Mun I、Afl Ⅱ RFLP图谱及基因测序结果均显示菌株CA-7、CA-8、CA-14、CA-16、CA-17的菌丝相与酵母相间存在差异,两相细胞ERG11基因在1547、1587、1617三位点存在差异,位点编号按照基因库中ERG11基因序列编号(登录号X13296).结论 白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因间存在差异,在进行白念珠菌体外研究时,选用其菌丝相更能反映体内真实情况.     

白念珠菌菌丝相和酵母相ERG11基因部分序列差异性的探讨

目的 研究白念珠菌菌丝相和酵母相细胞ERG11基因碱基序列上的差异，探讨两相细胞之间的差异性。方法 分别抽提从同—HIV阳性患者体内分离到的7株对氟康唑敏感程度不同的白念珠菌菌丝相和酵母相的DNA，此系白念珠菌经染色体水平及DNA水平证实来源于同一亲本。根据ERG11编码序列设计一对引物，对ERG11的近3’端的310bp的碱基序列进行PCR扩增，引物序列为：上游引物5’-GGGAAAGTTTCTAAAGGGG-3’：下游引物5’-TATGrITAATCCAACTAAGTAA-3’。经PCR产物直接测序比较两相细胞ERG11基因碱基序列上的差异。结果 1株氟康唑剂量依赖性敏感和2株氟康唑耐药白念珠菌的菌丝相与酵母相细胞间均出现ERG11基因1547位点、1587位点和1617位点的不一致。结论 白念珠菌的菌丝相和酵母相ERG11基因的部分序列存在差异。     

氟康唑对白念珠菌菌丝相与酵母相体外药物敏感性差异比较

目的:以同一亲本来源的7株白念珠菌为对象,研究氟康唑对其菌丝相与酵母相抗菌活性的差异。方法:参照NCCLS M27-A方案,测定氟康唑对7株白念珠菌菌丝相与酵母相的MIC值,并比较其差异。结果:白念珠菌菌丝相与酵母相对氟康唑的敏感性不同,对菌丝相的MIC值低于酵母相。结论:氟康唑对白念珠菌菌丝相的抗菌活性强于酵母相。     

两种培养基体外诱导白念珠菌菌丝相形成的比较

目的 寻找白念珠菌菌丝相理想的体外培养条件.方法 分别采用RPMI1640和DMEM培养基,在37℃条件下培养对氟康唑敏感性不同的16株白念珠菌,计算并比较白念珠菌菌丝相在两种培养基中的形成率.结果 在DMEM培养基中白念珠菌菌丝相的形成率低于在RPMI 1640培养基中的形成率.RPMI 1640培养基(pH7.5),37℃传代培养7d(转种12次)后,16株白念珠菌菌丝相细胞形成率均达99%以上.在DMEM培养基中,于同一观察时间,氟康唑剂量依赖性敏感和耐药株的菌丝相形成率低于氟康唑敏感株.结论 RPMI1640培养基(pH7.5),37℃传代培养7d(转种12次)是获得白念珠菌菌丝相的理想条件.     

白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因PCR-RFLP比较分析

目的通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因限制性片段长度多态性分析,比较两相细胞在DNA水平的差异。方法分别抽提来自同一亲本、对氟康唑敏感性不同的白念珠菌(CA-1,CA-2,CA-4,CA-6,CA-7,CA-9,CA-11,CA-13~CA-17)菌丝相与酵母相基因组DNA,根据ERG11基因序列设计一对引物,对其进行PCR扩增(包括部分上游和下游非编码区),扩增产物分别用AccⅠ和MunⅠ消化、琼脂糖凝胶电泳后观察。结果各株白念珠菌菌丝相与酵母相均能扩增出约1 734bp大小的目的片段,CA-7,CA-14,CA-16和CA-17株两相细胞ERG11基因RFLP图谱存在差异,其余受试菌株未见差异。结论从DNA全貌来看,白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因存在差异。     

真菌病

20071738白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因差异性分析/姜红浩(广州暨南大学附一院皮肤科),张宏,乔建军…∥中华皮肤科杂志.-2007,40(4).-217~220对白色念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因进行PCR-RELP及基因测序研究,结果表明,该菌两相ERG11无论在氟康唑敏感株(CA-7,CA-8),还是剂量     

白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因部分序列的比较研究

目的 通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因部分序列的比较,探讨两相在DNA水平的差异。方法 对5株分离自同一HIV阳性患者的白念珠菌分别进行菌丝相与酵母相培养后,抽提基因组DNA,PCR扩增ERG11基因(包括部分上游和下游非编码区),用下游引物对部分ERG11基因进行测序。结果CA-7菌丝相与酵母相ERG11基因序列存在差异,分别位于第1547,1587和1617位点。结论 白念球菌菌丝相与酵母相在DNA水平存在差异,在进行白念珠菌的病原真菌学研究中菌丝相为适宜的研究对象。     

白念珠菌临床株氟康唑敏感性试验与ERG11基因突变检测

目的 了解白念珠菌临床株对氟康唑的敏感性,筛查临床菌株的ERG11突变,探讨其与耐药的关系.方法 收集鉴定白念珠菌临床株,采用微量稀释法和药敏纸片法体外测定试验菌株对氟康唑的敏感性.分段扩增ERG11基因的第295～777bp(483bp)、第723～1204bp(482bp)和第1179～1667bp(489bp)等3个片段,并测序.结果 共收集念珠菌80株,分离白念珠菌52株,52株白念珠菌均为敏感株.经测序的5株敏感白念珠菌ERG11基因共出现19处突变,其中14处为同义突变,其余5处错义突变(T495A、A530C、G640A、A945C、G1609A)分别可引起羊毛甾醇14α-去甲基酶的下列氨基酸改变:D116E、K128T、E165K、E266D、V488I.结论 白念珠菌临床株对氟康唑敏感性较高;E165K和V488I可能与耐药无关.     

汉防己甲素对氟康唑抗白念珠菌活性的增效作用

目的 探讨体外汉防己甲素对氟康唑抗白念珠菌活性是否有增效作用.方法 参照微量稀释法确定汉防己甲素对白念珠菌的非细胞毒性剂量,并测定氟康唑单独及联合汉防己甲素时对16株白念珠菌的MIC.结果 在终质量浓度≤40μg/ml汉防己甲素的作用下,白念珠菌的存活率>95%.其中汉防己甲素(30～40μg/mL)可抑制白念珠菌菌丝相形成.氟康唑单独作用时,对16株白念珠菌的MIC值为0.250～64μg/mL;与汉防己甲素(40μg/mL)联合时,氟康唑对受试菌的MIC值降至0.125～16μg/mL,且终点清晰,“拖尾现象”消火.结论 汉防己甲素在体外对氟康唑的抗白念珠菌活性有增效作用.     

艾滋病患者白念珠菌ERG11基因突变的研究

目的 探讨艾滋病患者的白念珠菌唑类耐药株中唑类抗真菌药物(氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑)的作用靶位基因ERG 11基因突变与耐药的关系.方法 用PCR对临床分离的93株白念珠菌的Erg11基因进行扩增、测序,DNAman软件将测序结果与基因库中的X13296进行比对,将突变碱基翻译为氨基酸,确定是否发生错义突变.结果 共检出40个碱基突变位点,包括27个同义突变位点和13个错义突变位点.耐一种药物的突变菌株中每株菌只发生一处错义突变或无错义突变,而耐二种或三种药物的菌株中每株菌还可以同时出现两处或三处错义突变.结论 ERG 11基因错义突变与白念珠菌耐药有关.     

DNA芯片鉴定念珠菌种和氟康唑耐药基因ERG11突变

目的 建立DNA芯片技术鉴定念珠菌种和氟康唑耐药基因ERG11突变。方法 根据6种常见念珠菌内转录间隔（ITS2）区种特异性序列和白念珠菌ERG11基因中已证实可导致对氟康唑耐药的6种突变序列设计探针,制备DNA芯片,鉴定12条50 bp的念珠菌种特异性序列和ERG11突变序列及34株念珠菌（其中白念珠菌29株,热带念珠菌、光滑念珠菌、都柏林念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌各1株）。结果 ①芯片正确鉴定12条人工合成序列;②正确鉴定34株试验菌株的菌种;③正确鉴定29株白念珠菌ERG11基因中可致耐药的已知突变。敏感性和特异性均为100%。结论 用DNA芯片进行念珠菌菌种鉴定和白念珠菌ERG11突变筛查,结果可靠。     

白念珠菌菌丝相随机扩增多态性DNA分析

目的　以白念珠菌菌丝相为研究对象 ,比较对氟康唑敏感程度不同的白念珠菌之间随机扩增多态性DNA(RAPD)图谱的差异。方法　用随机引物 5′ TCACCACGGT 3′对同一亲本来源的 16株白念珠菌菌丝相基因组DNA进行扩增 ,扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳并拍照。结果　菌株CA 1～CA 13的电泳带型一致 ,均有 6条电泳带 ;CA 14～CA 17的电泳带型一致 ,均有 7条电泳带 ;CA 14～CA 17比CA 1～CA 13多 1条约 45 0bp的电泳带。 结论　氟康唑耐药株白念珠菌菌丝相基因组DNA的RAPD图谱与氟康唑敏感菌株的有差异     

汉防己甲素对氟康唑抗白念珠菌增效活性的分子机制探讨

目的 探讨汉防己甲素在体外对氟康唑增效作用的分子机制。方法 分别提取 16 株白念珠菌酵母相总 RNA，采用 RT-PCR 方法比较汉防己甲素作用前及作用24 h后白念珠菌药物外排泵基因 MDR1、FLU1、CDR1、CDR2在氟康唑敏感、剂量依赖性敏感、耐药株中的表达情况。结果 在汉防己甲素作用前，MDR1、FLU1、CDR1、CDR2表达水平在氟康唑敏感、剂量依赖性敏感、耐药株间的差异均有统计学意义（P < 0.05）。汉防己甲素作用24 h后，与作用前相比，MDR1 在氟康唑耐药株中、FLU1在氟康唑剂量依赖性敏感、耐药株中、CDR1和CDR2在氟康唑敏感、剂量依赖性敏感、耐药株中表达水平的差异均有统计学意义（P < 0.05）。结论 汉防己甲素在体外对氟康唑抗白念珠菌活性增效作用的分子机制与抑制药物外排泵基因MDR1、FLU1、CDR1、CDR2的表达均有关。