根癌农杆菌介导sHSP基因对半夏的遗传转化

目的:建立高效的半夏遗传转化体系.方法:以半夏试管苗的叶柄为外植体,采用根癌农杆菌介导法,探索了酚类物质、农杆菌菌液浓度、侵染时间、预培养时间及共培养时间等对半夏遗传转化效率的影响.结果与结论:不经过预培养阶段,用含AS 40 mg·L-1的根癌农杆菌菌液侵染15 min后共培养3d时可有效提高遗传转化效率.将转化后的叶柄接到含有100 mg·L-1 Kan和350 mg·L-1Carb的分化培养基上进行筛选培养,30 d左右在叶柄的两端分化出抗性的试管小块茎.对抗性转化植株进行Gus染色和PCR检测,结果表明外源基因sHSP已经整合到半夏基因组中.     

白藜芦醇合酶基因的克隆及丹参的转化

目的为探索利用分子生物学技术培育新型药用植物的新途径,将外源的白藜芦醇合酶(RS)基因导入到丹参中表达,以改善或增加丹参的效用。方法根据已公布的核苷酸序列,利用引物悬挂延伸法,经过3次扩增,最终从葡萄基因组DNA中获得完整的RScDNA基因序列;以质粒pBin438为基础,构建含有RS目的基因的组成型植物表达载体。在根癌农杆菌介导下,利用叶盘法转化丹参,进而通过PCR、PCR-Southern杂交对不同的转基因植株进行筛选与检测。结果总共得到了45棵卡那霉素抗性植株,经PCR和PCR-Southern杂交检测,确定葡萄RS基因已整合到部分转基因丹参苗的基因组中。结论成功建立了白藜芦醇合酶基因转化丹参的体系,并获得了转基因植株。     

青蒿反义鲨烯合酶基因植物表达载体PBI121-SS的构建

目的：利用基因工程对野生青蒿进行人工操纵来提高其青蒿素生产能力。方法：从已有载体PBI121-SS通过PCR获得鲨烯合酶基因（sS）,然后连接pMD—18载体,测序后,酶切,连接表达载体PBI121-SS,通过菌液PCR,抽取质粒,酶切检测。结果：通过上述方法植物表达载体PBI121-SS构建成功,并转化农杆菌LBA4404。     

基因枪转化双价防卫基因获得抗立枯病白术

目的 通过基因工程育种获得抗病转基因白术株系.方法 在已建立的高效白术茎尖再生体系基础上,利用基因枪介导法转化水稻几丁质酶基因(RCH10)和苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因(AGLU),对所获得的转基因株系进行PCR分析、GUS染色以及抗病性检测.结果 获得了25个PCR检测阳性的转基因株系,其中5个株系对白术立枯病抗性增强.结论 利用转基因技术获得抗病新株系,可以缩短抗病品种育种年限,同时拓宽了白术抗病育种的基因库.     

青蒿鲨烯合酶基因打靶研究

目的通过代谢途径工程调整代谢流向,试图增大转基因青蒿Artemisia annua植株中的青蒿素产量。方法利用青蒿鲨烯合酶(SS)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因和胞嘧啶脱氨酶(CodA)基因构建基因打靶载体,并通过冻融法将载体导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens。以叶盘法转化青蒿,采用"分段选择法"筛选转基因再生植株。结果对表达GFP基因后发出绿色荧光的转基因植株,采用PCR及PCR产物杂交法,在1棵转基因植株中检测到外源GFP基因,而未检测到内源SS基因。初步证据显示,在转基因青蒿植株中,突变型SS基因已取代野生型SS基因。结论青蒿鲨烯合酶基因打靶已取得初步成功。     

金属硫蛋白2基因在红花中表达的初步研究

目的 获得转金属硫蛋白2(metallothionein 2,MT2)红花植株,为MT药用蛋白的生产奠定基础。方法采用Nco I/HindⅢ酶切pEASY-oleosin-MT获得oleosin-MT融合基因,将其插入到植物油体高效表达载体pOP上,构建重组质粒pOP-oleosin-MT,进行PCR和双酶切鉴定。采用冻融法将重组质粒pOP-oleosin-MT转入根瘤农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化红花,对转MT基因红花植株进行PCR检测及Southern blotting检测。结果成功构建了MT基因的植物油体表达载体pOP-oleosin-MT,获得了3株PCR检测呈阳性的转MT基因红花植株。结论建立了完善的红花再生体系,获得了转MT基因的红花植株。     

转双价抗虫基因Bt-CpTI提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性

目的 将外源苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因CrylA(c)和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI共同转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫小菜蛾抗性.方法 构建了以CaMV 35S为启动子,新霉素磷酸转移酶(Npt-Ⅱ)为选择标记,带有CrylA(c)基因和CpTI基因的植物表达载体pGBI121S4ABC并转入根癌农杆菌LBA4404.采用叶盘法遗传转化四倍体菘蓝.转基因再生植株经PCR和Southern杂交检测,并进行抗小菜蛾实验.结果 T0代转化四倍体菘蓝的双基因阳性转化率达到16.67%.Southern杂交检测结果表明外源CrylA(c)基因和CpTI基因均已经随机整合到转基因菘蓝的基因组中.与野生对照相比,转基因四倍体菘蓝对小菜蛾显示出明显抗性.结论 转双价抗虫基因Bt-CpTl是提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性的有效手段.     

四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅱ.转半夏凝集素基因菘蓝的分子生物学检测

目的 获得转基因菘蓝的分子生物学证据。方法 对经卡那霉素筛选的抗性再生菘蓝苗进行聚合酶链式反应(PCR)，Southern杂交和RT—PCR检测。结果 PCR和Southern杂交检测结果表明，外源半夏凝集素基因已经整合到转基因菘蓝的基因组中，RT—PCR结果表明其DNA可以正常转录成mRNA。结论 可以利用农杆菌介导的基因转化技术培育抗虫的菘蓝新品系。     

桑黄鲨烯环氧酶基因原核表达及过表达载体的构建

目的构建桑黄三萜生物合成途径中的关键酶——鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因的原核表达和过表达载体。方法将克隆到的桑黄SE基因构建到原核表达载体p ET-32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),使用异丙基硫代-β-D-呋喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达2~10 h后,通过SDS-PAGE进行检测。根据Gen Bank中提交的香菇3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)启动子序列设计引物,利用PCR技术克隆获得香菇gpd启动子片段,以植物双元表达载体p CAMBIA1301为基础载体,通过酶切、连接等方法将其中的35 S启动子替换为香菇gpd启动子,再将SE基因编码区序列构建到gpd启动子下游,构建桑黄SE基因的过表达载体。结果成功构建了SE基因的原核表达载体p ET-32a-SE,SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约为55 000,与预测的蛋白相对分子质量基本一致。PCR检测、酶切鉴定和测序分析可知,成功构建了适宜食用菌遗传转化的中间载体p CAMBIA1301-gpd-gpd及SE基因的过表达载体p CAMBIA1301-gpd-gpd-SE。结论为后期研究SE基因在桑黄三萜生物合成方面所发挥的功能奠定基础。     

抗草甘膦半夏的获得及其草甘膦筛选体系的建立

目的 将抗草甘膦突变基因(aroA-M12)转入半夏,获得草甘膦抗性植株.方法 用携带植物表达载体pASM12的根癌农杆菌LBA4404对半夏进行叶盘法转化;在选择培养基中加入10 mg/L草甘膦进行筛选,获得草甘膦抗性的再生植株;对再生植株进行PCR检测和草甘膦抗性实验.结果 PCR检测表明幼叶的转化频率达23%,叶柄的转化频率达33%,对PCR阳性植株进行草甘膦抗性实验,多数植株在不同程度上表现出对草甘膦的抗性.结论 本实验建立了半夏的遗传转化方法及草甘膦筛选的转化体系.为培育抗除草剂的半夏新品种及草甘膦筛选体系在半夏基因工程中的应用奠定了基础.     

四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅰ.根癌农杆菌介导的转基因菘蓝

目的：将外源半夏凝集素基因（PTA）转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫抗性。方法：构建了以CaMV 35S为启动子，新霉素磷酸转移酶（Npt-Ⅱ）为选择标记，带有半夏凝集素基因PTA的pCAMB I A2200植物双元表达载体，应用根癌农杆菌EHA 105遗传转化四倍体菘蓝。结果：菘 外植体植株再生率达到95％以上，转化率有10％。结论：建立了以6－BA和NAA为主要激素组合的四倍体菘蓝离体分化再生系统和农杆菌介导的转化系统。     

蜜环菌遗传转化体系的建立

目的:利用农杆菌介导法,建立蜜环菌的遗传转化体系,为分子学研究奠定基础。方法:将含有EGFP的表达载体转入农杆菌EHA105中,构建农杆菌工程菌。把成熟的蜜环菌菌索剪断并浸泡在农杆菌中,在乙酰丁香酮的作用下,农杆菌工程菌将EGFP基因整合到蜜环菌基因组中。利用PCR法和荧光观察法筛选并检测蜜环菌菌株的转化情况。结果:转化成功的蜜环菌其基因组中含有EGFP基因,并且其后代遗传稳定,通过荧光显微镜能够检测到绿色的荧光点。结论:农杆菌介导的蜜环菌遗传转化体系是一种效率较高,简便快速的转化方法,能够将目的基因转入到蜜环菌中并成功表达。     

大豆24 kDa油体蛋白基因与aFGF融合转化红花的研究

目的: 利用红花表达酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF),为利用植物生物反应器规模化生产aFGF奠定基础. 方法: 将人源aFGF基因改造为植物偏好性的aFGF基因序列,通过PCR搭桥技术克隆植物偏好的aFGF基因,利用酶切连接方法构建植物油体表达载体,通过冻融法转到根瘤农杆菌EHA105,利用农杆菌介导的方法转化到塔城红花中,对转化红花进行PCR,Southern杂交,RT-PCR分子检测. 结果: 扩增出植物偏好的aFGF基因的全长序列,并与大豆油体蛋白基因Doil基因融合,成功地插入到改造好的含有大豆油体蛋白启动子表达载体中, 探索了进行红花遗传转化的最佳条件,成功获得单位点插入的3个独立转化红花植株,在转录水平都有大小一致的aFGF的表达. 结论: 该实验成功构建了含aFGF植物油体表达载体,并筛选出最佳的遗传转化条件,A为0.6,侵染时间为10 min,共培养3 d,获得了aFGF转录水平表达的转基因红花植株,这将红花油体蛋白本身的皮肤保护作用,与FGFs的创伤修复作用累加,快速开发出外用创伤药物奠定基础.     

农杆菌介导的抗菌肽基因转化阳春砂愈伤组织的研究

目的确定遗传转化条件,将抗菌肽CN基因转入阳春砂愈伤组织。方法以阳春砂愈伤组织为受体材料,以农杆菌EHA105/pCAMBIA1305.2-CN工程细胞介导抗菌肽CN基因转化阳春砂,设计正交实验,通过分析gus报告基因的瞬时表达比较转化影响因素,并对目的基因CN进行PCR检测。结果农杆菌浓度、侵染时间、共培养温度、共培养时间及乙酰丁香酮浓度对转化率的影响有显著差异性。阳春砂愈伤组织遗传转化的最佳条件组合是:农杆菌浓度为OD600=0.5,侵染时间10 min,共培养温度24℃,共培养时间4 d,共培养培养基添加乙酰丁香酮200μmol.L-1。gus基因瞬时表达呈阳性的愈伤组织DNA经目的基因CN的PCR检测可见清晰的目的条带。结论建立了农杆菌介导的阳春砂愈伤组织的转化条件,目的基因CN已转入阳春砂愈伤组织。     

蚯蚓溶栓酶重组质粒遗传稳定性的研究

通过蚯蚓溶栓酶重组质粒pBV220-P30在大肠杆菌DH5α中20代培养，提取每一代质粒，进行双酶切实验，利用Agarose电泳，在紫外灯下观察，得到每一代质粒酶切结果。确定蚯蚓溶栓酶重组质粒pBV220-P30在大肠杆菌DH5α中稳定遗传 的代次，结果表明：蚯蚓溶栓酶重组质粒可以在大肠杆菌中稳定遗传13代，在13-20代外源的蚯蚓溶栓酶基因丢失或复制量不足，在Agarose电泳上不能显示。     

蚯蚓溶栓酶重组质粒遗传稳定性的研究

通过蚯蚓溶栓酶重组质粒 pBV2 2 0 -P30 在大肠杆菌DH5α中 2 0代培养 ,提取每一代质粒 ,进行双酶切实验 ,利用Agarose电泳 ,在紫外灯下观察 ,得到每一代质粒酶切结果 ,确定蚯蚓溶栓酶重组质粒 pBV2 2 0 -P30 在大肠杆菌DH5α中稳定遗传的代次。结果表明 :蚯蚓溶栓酶重组质粒可以在大肠杆菌中稳定遗传 1 3代 ,在 1 3～ 2 0代外源的蚯蚓溶栓酶基因丢失或复制量不足 ,在Agarose电泳上不能显示     

农杆菌介导枳壳转化系统的建立及PCR鉴定

目的：建立农杆菌介导的枳壳转化体系。方法：以枳壳实生苗上胚轴为转化体外植体，农杆菌Ti质粒上插入了外源目的基因--柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因（CTV-cp），转化植株用GUS（β-葡萄苷酸酶）染色及PCR进行鉴定。结果：枳壳转化试验中，20d苗龄的外植体转化再生率较高；外植体与农杆菌共培养时间以2-3d为宜；乙酰丁香酮能较大提高转化效率，转化再生频率为27.5％。转化获得的抗性植株中，GUS反应呈阳性所占比例为70.0％。PCR分析证实外源目的基因已速合到枳壳转化株的核基因组中。结论：成功地建立了农杆菌介导的枳壳转化系统，为利用基因工程的手段进行枳壳的抗病育种奠定了基础。     

重组人细胞因子基因在转基因中药细胞中的瞬时表达

目的 利用转基因中药表达人细胞因子基因，探讨培育基因修饰（GM）中药的可行性，方法 将体外扩增分别获得的人α-干扰素基因与RANTES基因酶切回收后插入中间载体，用EcoRI和HindⅢ双酶切鉴定重组子，由大肠杆菌分离重组质粒并导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens，通过加入卡那霉素（Km)和利福平（Rif)筛选含重组双元载体的转化子，用叶盘共培养法转化苦瓜和夏枯草外植体。结果 经RT-PCR检测到人α-干扰素基因与RANTES基因在中药转化愈伤组织中的瞬时表达。结论 首次报道了重组人α-干扰素基因与RANTES基因在转基因苦瓜和夏枯草细胞中的表达。为探讨利用转基因中药抗病毒尤其是抗艾滋病开创了新途径。     

黄芪遗传转化受体系统的建立及aFGF转化黄芪的研究

目的:建立黄芪的高频再生体系,并在其基础上建立aFGF转化黄芪的体系.方法:以黄芪的子叶节为外植体通过器官发生途径建立高频再生体系,采用农杆菌GV3101转化黄芪子叶节,将aFGF基因导入黄芪,再生株系经过PCR初步检测.结果:以全部子叶节为外植体,在培养基为MS+2.0 mg·L~(-1) BA+0.5 mg·L~(-1) IBA诱导不定芽;在培养基为1/2M+5.0mg·L~(-1) NAA生根,获得高频再生体系;全部子叶节在培养基上预培养3 d,农杆菌浓度为A_(600)0.3时侵染10 min后共培养2d,转移至筛选培养基培养,检测证实aFGF基因整合到黄芪基因组中.结论:在黄芪子叶节高效再生体系基础上,建立黄芪遗传转化受体体系,为黄芪作为植物生物反应器的研究奠定了基础.     

三七几丁质酶基因PnCHI1的功能分析

几丁质酶(chitinase)是一种能够将几丁质水解成N-乙酰葡糖胺的糖苷酶,广泛存在于植物细胞中,是抗真菌防卫反应体系的重要组成部分。该文深入分析了1种三七几丁质酶基因PnCHI1的功能。构建PnCHI1的亚细胞定位载体,转入洋葱表皮细胞中瞬时表达,在激光扫描共聚焦显微镜下发现PnCHI1定位于细胞壁中。构建PnCHI1的原核表达载体,诱导并纯化获得重组蛋白,体外平板抑菌实验结果显示PnCHI1原核重组蛋白对尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌、轮枝镰刀菌3种三七根腐病菌的菌丝生长具有很强的抑制活性。采用反向遗传学技术验证PnCHI1的功能,通过根癌农杆菌介导将PnCHI1转入烟草中过量表达。qRT-PCR分析结果表明PnCHI1在T2代转基因烟草中大量表达,同时叶片接种实验显示PnCHI1转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性增强明显。结论:PnCHI1是定位于细胞壁的几丁质酶,体外能抑制几种三七根腐病真菌,在烟草过表达大大提高了烟草对茄腐镰刀菌的抗性,推测PnCHI1是三七中参与根腐病防卫反应的重要抗病基因。