紫外线与戊二醛双重交联法构建真皮支架的研究

目的 比较不同预冻温度及交联方法对胶原膜内部超微结构及成纤维细胞增殖的影响. 方法 将牛Ⅰ型胶原溶液(10 g/L)分别在-20℃和-80℃预冻12 h后,放入-70℃冻干机内冷冻干燥48 h.利用扫描电镜测量2种预冻温度下胶原膜的内部孔径,比较戊二醛交联法及紫外线+戊二醛双重交联法对胶原孔径的影响,通过噻唑蓝(MTT)法检测人成纤维细胞在不同交联法制备的胶原膜中的增殖情况. 结果 -20℃预冻胶原膜的孔径为(172±37)μm,-80℃预冻胶原膜孔径为(99±24)μm,选择后者进行后续实验.经戊二醛交联后胶原膜孔径缩小,种植后第8天,成纤维细胞的吸光度值为1.534±0.013;紫外线联合戊二醛双重交联后胶原膜原有孔径不变,种植后第8天成纤维细胞的吸光度值为3.778±0.010,与前者比较,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 -80℃预冻后经紫外线+戊二醛双重交联法构建的胶原膜,可作为体外真皮支架替代物.     

壳聚糖与Ⅱ型胶原复合制作组织工程软骨支架及其性能研究

目的探讨采用壳聚糖与Ⅱ型胶原复合制作新型组织工程软骨三维多孔支架的方法,并对其理化性能进行检测. 方法将精制88%脱乙酰度壳聚糖溶于0.2 mol/L醋酸溶液制成2%溶液,高纯度猪Ⅱ型胶原溶于0.5 mol/L醋酸溶液制成1%溶液,两者按4∶1(重量比)充分搅拌混合,采用冷冻干燥法制成壳聚糖与Ⅱ型胶原复合支架.采用碳化二亚胺/ N-羟基琥珀酰亚胺对支架进行交联,力学测定比较支架交联前后的强度变化,扫描电镜观察其超微结构,于2、4、6和8周经溶菌酶体外降解实验测定其体外降解性. 结果制备的复合支架成形良好,交联后其力学强度明显增加.扫描电镜显示壳聚糖与Ⅱ型胶原成分在支架内分布均匀,支架内孔洞相互连通似海绵状,孔径100～250 μm.各时间段复合支架体外降解较单纯壳聚糖支架快. 结论壳聚糖与Ⅱ型胶原复合成功地制作成了三维多孔复合支架.其理化性能及体外降解测定,可以作为支架载体,应用于组织工程软骨的构建.     

壳聚糖与型胶原复合制作组织工程软骨支架及其性能研究

目的　探讨采用壳聚糖与 型胶原复合制作新型组织工程软骨三维多孔支架的方法,并对其理化性能进行检测。　方法　将精制88%脱乙酰度壳聚糖溶于0 .2 mol/ L 醋酸溶液制成2 %溶液,高纯度猪 型胶原溶于0 .5 m ol/ L醋酸溶液制成1%溶液,两者按4∶1(重量比)充分搅拌混合,采用冷冻干燥法制成壳聚糖与 型胶原复合支架。采用碳化二亚胺/ N-羟基琥珀酰亚胺对支架进行交联,力学测定比较支架交联前后的强度变化,扫描电镜观察其超微结构,于2、4、6和8周经溶菌酶体外降解实验测定其体外降解性。　结果　制备的复合支架成形良好,交联后其力学强度明显增加。扫描电镜显示壳聚糖与 型胶原成分在支架内分布均匀,支架内孔洞相互连通似海绵状,孔径10 0～2 5 0 μm。各时间段复合支架体外降解较单纯壳聚糖支架快。　结论　壳聚糖与 型胶原复合成功地制作成了三维多孔复合支架。其理化性能及体外降解测定,可以作为支架载体,应用于组织工程软骨的构建。     

胶原-透明质酸钠-纤维蛋白胶复合去抗原松质骨支架的制备及特征

[目的]探索胶原-透明质酸钠-纤维蛋白胶多孔支架复合去抗原松质骨的骨软骨一体化材料的制备方法及其特征.[方法]将胶原、透明质酸钠及纤维蛋白胶混匀,利用纤维蛋白胶的粘合性与去抗原牛松质骨复合,成为骨软骨一体化的支架材料.通过大体观察和扫描电镜观察了解材料的孔径和交通情况;分离、增殖仔兔骨髓基质细胞(BMSCs),取第3代BMSCs接种至支架材料复合培养,1、3、5、7和10 d后,行MTT检测并绘制细胞生长曲线;取第7 d标本,行扫描电镜观察.[结果]经交联和复合的一体化骨软骨支架材料具有良好的三维多孔结构,骨相孔径约300～500μm,软骨相孔径约80～120μm,两部分连接紧密;电镜观察见骨相及软骨相均有细胞黏附,细胞周围有基质存在;MTF检测显示,各时间点的OD值在实验组与对照组之间无统计学差异(P＞0.05).[结论]胶原-透明质酸钠-纤维蛋白胶多孔支架复合去抗原牛松质骨的一体化材料具有良好的空间结构和生物相容性,可用于修复骨软骨联合缺损的组织工程支架材料的研究.     

自体BMSCs复合胶原膜修复猪全层皮肤缺损

目的 探讨自体BMSCs与胶原膜复合构建组织工程皮肤修复小型香猪全层皮肤缺损,为组织工程皮肤的临床应用提供实验依据.方法 取4只贵州小型香猪骨髓各20 mL培养BMSCs,传至第3代.取新鲜牛肌腱通过化学交联的方法制备成直径为5 cm的圆形Ⅰ型胶原膜.将密度为2×107个/mL第3代BMSCs用DAPI标记后种植到Ⅰ型胶原膜上孵育24 h,制备组织工程皮肤.在猪背部正中线两侧分别由前向后切取5个直径5 cm、深达筋膜的圆形全层皮肤缺损创面,随机分为两组(n=10).对照组行单纯Ⅰ型胶原膜修复,实验组行组织工程皮肤修复.于术后3、8周,观察创面愈合情况,并取材行HE染色及透射电镜观察,并于术后3周对实验组行荧光显微镜及糖原染色观察.结果 动物均存活至实验完成.术后3周对照组创面约40%皮肤发黑、结痂、坏死,8周时仍见坏死组织且瘢痕挛缩明显;术后3周实验组创面皮肤成活,无明显瘢痕形成,8周创面愈合良好;两组创面愈合率差异有统计学意义(P<0.01).组织学观察:术后3周对照组可见肉芽组织增生,无表皮层覆盖:实验组具有良好的表皮和真皮结构,糖原染色可见基底膜呈完整连续深红染色.术后8周两组均形成正常皮肤样结构.透射电镜观察:术后3周对照组真皮层有大量中性粒细胞和成纤维细胞,未见表皮超微结构;实验组可见大量表皮细胞并以桥粒相连,表皮基底细胞与基膜以半桥粒连接:真皮层可见大量成纤维细胞,以及细胞外大量胶原微纤维沉积,可见内皮细胞形成的毛细血管.术后3周实验组荧光显微镜观察,带有DAPI标记的BMSCs定位于重建的表皮和真皮组织中,表皮主要定位于基底膜附近,真皮层可见大量荧光标记的BMSCs.结论 以自体BMSCs为种子细胞与胶原膜复合构建组织工程皮肤,可有效修复猪全层皮肤缺损,有望成为一种较理想的组织工程皮肤.     

皮质骨Ⅰ型胶原的提取及胶原-明胶支架材料的制备

[目的] 探索一种较理想的皮质骨Ⅰ型胶原的提取方法并制备胶原-明胶支架材料.[方法] 以牛皮质骨为原料,经低温液氮粉碎、梯度脱水、脱脂、脱钙处理成为脱钙骨基质粉.通过酶溶解法处理脱钙骨基质粉,经溶解、离心、透析、冻干等步骤获得皮质骨胶原,SDS-PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定其特征;再以胶原、明胶通过冷冻干燥技术制备神经支架材料,扫描电镜观察其内部结构.[结果] 所得胶原经SDS-PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定符合Ⅰ型胶原特征;制备的支架材料外观呈圆柱状,内部为孔径均匀平行排列的微管结构,具有仿生效果.[结论] 皮质骨中能够获得纯度较高的Ⅰ型胶原,可用于胶原材料的制作.     

壳聚糖与Ⅰ型胶原复合制作新型人工神经支架材料及其性能研究

目的 探讨以壳聚糖复合Ⅰ型胶原蛋白结合冷冻干燥技术制备新型人工神经支架材料.方法 将壳聚糖与Ⅰ型胶原蛋白分别溶于0.05 mol/L的醋酸溶液中,利用冷冻干燥技术制备新型人工神经支架材料,并以紫外线照射的方法使其交联.经扫描电镜观察内部结构的排列规律及走行,比较其与周围神经的异同,测量其孔径大小、计算孔隙率等指标.观察在0.01 mol/L磷酸盐缓冲液中30 d体外降解率.并对材料进行力学及细胞毒性实验.结果 构建的材料为均匀圆柱状,内部为孔径均匀且平行排列的微观结构,其微孔直径为60-130μm,孔隙率为83.30%,体外降解率为16.95%,具有较好的力学性能与周阡司组织无毒性反应.结论 使用壳聚糖复合Ⅰ型胶原蛋白结合冷冻干燥技术,制备出具有良好三维空间构型的新型人工神经支架材料,其牛物相容性良好,具有应用潜力.     

表皮生长因子复合可降解胶原膜防止鸡鞘管区肌腱粘连的实验研究

目的观察和探索表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）复合胶原膜在预防鞘管区肌腱粘连、促进肌腱内源性愈合中的作用。方法将30只10个月龄的雄性leghorn鸡随机分为A、B、C三组，每组10只。将鸡的左侧第三趾造成挤压撕脱伤模型，用改良Kessler法进行缝接。A组：肌腱缝合口包裹EGF复合胶原膜；B组：缝合口包裹单纯的胶原膜；C组：缝合口不做任何处理。4周后取材，右侧第三趾为对照组。对标本进行肉眼观察、生物力学测定、光镜和电镜等观察。结果A组肌腱粘连程度较轻，肌腱缝合段内的胶原纤维数量多，以粗大的Ⅰ型胶原为主，成纤维细胞数量少，腱细胞成熟。B组肌腱粘连程度较轻，但肌腱缝合段内的胶原纤维数量少，排列稀疏，以纤细的Ⅲ型胶原为主。C组肌腱与周围组织粘连较严重，肌腱缝合段内的胶原纤维数量较多，排列紊乱，Ⅰ、Ⅲ型胶原交错排列。结论1.EGF复合胶原膜能起到屏障肌腱外源性愈合、防止肌腱粘连的作用，但同时也明显减慢了肌腱的愈合速度。2、EGF复合可降解胶原膜，同时也加快了肌腱的内源性愈合速度，起到了较理想的防止粘连的效果。     

经碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺交联的Ⅱ型胶原海绵的制备

[目的]用碳化二亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethyl ami-nopropyl)carbodiimide,EDC]/N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)对Ⅱ型胶原海绵进行交联,评价了交联前后材料理化性能的改变,探讨其在软骨组织工程方面应用的可行性。[方法]提取Ⅱ型胶原后,通过真空冷冻干燥法冻干成多孔海绵材料后,室温下交联24h,再次冻干成为Ⅱ型胶原海绵支架材料。采用激光共聚焦显微镜、扫描电镜、拉力测试机等手段对海绵材料的结构及性能进行分析。将绿色荧光蛋白(GFP)标记的兔软骨细胞种植到交联后的Ⅱ型胶原支架材料后,观察细胞生长状况。[结果](1)交联后的海绵材料的力学性能与未交联组相比明显提高,达到(2.18±0.47)MPa;(2)交联组材料的抗胶原酶降解能力显著提高,4h后仅降解了8.28%。交联后孔径大小约为90μm,孔隙率和平衡含水率平均为93.39%和97.78%;(3)软骨细胞在Ⅱ型胶原海绵上生长状况良好。[结论]交联后的Ⅱ型胶原海绵保持其优良的理化特性和生物相容性,同时又有效地提高了力学性能和抗降解能力。     

胶原膜与膀胱移行上皮细胞相容性的体外研究

目的检测制备的胶原膜与膀胱移行上皮细胞的细胞相容性,探讨胶原膜作为泌尿系腔道组织工程支架的可能性.方法①选用8～12周新西兰白兔中分离培养的原代膀胱移行上皮细胞,以1×105/cm2种植到制备胶原膜上,于种植后2、12和24小时通过倒置显微镜及扫描电镜观察细胞与胶原膜的黏附.②分别设立空白组(无细胞)、阴性对照组(培养基)、阳性对照组聚氯乙烯管(Polyvinyl chloride,PVC)浸提液和实验组(胶原膜浸提液).取2～4代对数生长期的膀胱移行上皮细胞,接种于96孔板中,每组各5孔,1×104个/孔,于接种后24、72和120小时,通过MTT法显色,并于酶标仪490 nm波长下检测吸光度值,计算相对增殖率,对胶原膜与膀胱移行上皮细胞的相容性进行评估.结果移行上皮细胞2小时后开始在胶原膜上黏附,随时间推移,黏附细胞数量增加;第24、72和120小时实验组吸光度值分别为0.590±0.024、1.065±0.040和1.129±0.074,阴性对照吸光度值分别为0.639±0.068、1.022±0.044和1.087±0.111,阳性对照组吸光度值分别为0.302±0.029、0.653±0.083和0.694±0.031,实验组吸光度值明显高于阳性对照组,有统计学意义(P＜0.01),与阴性对照组比较无明显差异(P>0.05).结论制备的胶原膜与膀胱移行上皮细胞相容性良好,具有作为泌尿系腔道组织工程支架的潜在运用价值.     

几丁质-胶原蛋白膜的制作及皮下埋植实验

目的 探讨几丁质—胶原蛋白膜作为真皮支架的可行性。方法 以酸溶法制备胶原溶液，添加一定比例的脱乙酰化几丁质，冻干成膜，0．05％戊二醛溶液浸泡交联，行体外酶降解实验，检测其耐受酶降解能力；将制备的几丁质—胶原蛋白膜包埋于36只SD大鼠皮下，术后3、5天，1、2、3、4、6、8和12周取材，捡a其组织相容性、血管化能力及材料在体内障解情况。结果 制备的几丁质—胶原蛋白膜，呈微黄、半透明状，纤维排列呈网状，一例较光滑，孔小，另一例孔稍大，孔径大小保持在50～250μm之间，其体外降解缓慢。皮下埋植实验术后5天～2周显示材料具有良好的组织相容性，无明显炎性反应，血管化早，体内障解缓慢；8周后经改建可形成纤维排列较规则的类真皮样结构。结论 几丁质—胶原蛋白膜具有较好的物理及生物学性能，组织相容性好，血管化能力强，体内、外降解缓慢，具有良好的真皮替代功能。     

胶原-透明质酸支架的制备及其与软骨细胞复合培养的实验研究

目的制备胶原-透明质酸支架,评价其与兔髁状突软骨细胞的生物相容性,探讨其应用于关节软骨组织工程的可行性。方法冷冻干燥法制备胶原-透明质酸复合多孔海绵支架材料,将其与碳化二亚胺[1-ethyl-3-（3-dimethyl aminopropyl）carbodiimide,EDC]进行化学交联。分别采用体积法和体外酶解实验测定支架材料孔隙率和降解率,扫描电镜观察交联前后支架材料的形态变化。取3周龄新西兰兔髁状突软骨细胞,体外培养5d后,甲苯胺蓝染色,倒置相差显微镜下观察行细胞鉴定。取消化后第2代软骨细胞接种至支架材料复合培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。复合培养1、3、5、7和10d后,PBS液清洗3次,置入24孔板并以0.25%胰酶和0.1%EDTA消化细胞,采集细胞进行细胞计数并绘制细胞生长曲线。另取部分样本继续培养5d,行组织学和扫描电镜观察。结果胶原-透明质酸支架材料经化学交联后,具有合适的三维多孔结构,孔隙率为83.7%,孔径100-120μm;交联后抗酶解能力显著增加。髁状突软骨细胞在其表面和内部贴附良好,形成细胞-材料复合体,细胞增殖实验显示,复合培养1d,材料中细胞数为3.7×104/支架,10d后增至8.2×104/支架。电镜观察见细胞周围有基质分泌。结论EDC交联后的胶原-透明质酸支架具有良好空间结构和生物相容性,可作为支架材料用于髁状突软骨组织工程的研究。     

胎盘间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性研究

目的探讨兔胎盘间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs)和兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived MSCs,BMSCs)体外分离培养、增殖,对其生物学性状进行比较观察。方法取足月待产新西兰大耳白兔1只,采用密度梯度离心法及贴壁培养技术从兔胎盘对PMSCs进行分离、纯化和传代培养。取2周龄新西兰大耳白兔1只,采用直接贴壁法从后肢骨髓中对BMSCs进行分离、纯化和传代培养。用倒置相差显微镜观察两种细胞形态。免疫组织化学染色对第3代细胞表面标志(CD44、CD105、CD34、CD40L)进行鉴定。将BMSCs与PMSCs第2代细胞分别与生物衍生骨进行复合培养5d,每条材料接种(1.0~1.5)×106个细胞,苏木素染色观察细胞与材料复合培养情况。扫描电镜观察两种细胞分别与材料复合培养3d和8d的情况。结果在倒置相差显微镜下观察,两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样。PMSCs增殖力强,细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,细胞体外培养10代后,生长速度减慢。两种细胞均表达CD44、CD105,不表达CD34、CD40L。复合培养5d,PMSCs和BMSCs在生物衍生骨表面生长,大量黏附,细胞积聚成团,相互连接成网状,孔隙内也可见细胞生长和增殖,并分泌基质。扫描电镜观察:复合培养3d,可见较多量的细胞在生物衍生骨上黏附,呈梭形或多角形;8d两种细胞均已大量增长,呈层状排列,细胞连接紧密,分泌大量基质,细胞周围有较多的网状胶原形成。结论PMSCs与BMSCs有相似的生物学特性,可作为组织工程的另一成体干细胞来源。     

hVEGF基因修饰的组织工程化复合物修复牙周组织缺损的实验研究

目的探讨hVEGF165基因修饰的BMSCs在SD大鼠急性牙周缺损模型中对牙周组织再生的作用。方法人工构建SD大鼠急性牙周缺损模型。设以下6组(36只SD大鼠,n=6):空白对照(A组);单纯e-PTFE膜(B组);BME+e-PTFE膜(C组);BMSCs+BME+e-PTFE膜(D组);空转BMSCs+BME+e-PTFE膜(E组);hVEGF165基因修饰的BMSCs+BME+e-PTFE膜(F组)。分别将转染hVEGF165基因的BMSCs与未转染的BMSCs接种于胶原膜BME-10X后,按各分组植入人工牙周缺损内,并以空白胶原膜和空载体为对照。4周后取材作病理切片,HE染色观察牙周组织再生情况,测量新生牙槽骨面积、新生牙骨质面积以及新生牙周膜宽度,结果进行统计学分析。结果各组均可见不同程度的牙周组织再生,A组、B组和C组三组新生牙槽骨面积(NB)、新生牙骨质面积(NC)和新生牙周膜宽度(NP)均无明显差别(P>0.05);与A组相比,D组、E组、F组的NB、NC均有显著增加(P<0.05);与E组相比,转染有hVEGF165基因组(F组)的NB、NC和NP均有显著增加(P<0.05)。结论 hVEGF165基因转染BMSCs与胶原膜复合物可促进大鼠牙周组织再生。     

The Chemical Protecting Group Concept Applied in Crosslinking of Natural Tissues with Glutaraldehyde Acetals

This work describes the results of the controlled crosslinking of collagen matrices by glutaraldehyde based on a double protection strategy, glutaraldehyde acetals and lysine protonation due to the acidic conditions of acetal formation. Materials crosslinked by this approach were characterized by thermal stability comparable to those obtained by conventional procedures with mechanical properties expected for bioprosthesis manufacture and with a higher stability toward collagenase hydrolysis. The integrity of the microfibrillar structure was confirmed by optical and scanning electronic microscopy. The results indicate that the glutaraldehyde acetals procedure may be of potential use for the crosslinking of bovine pericardium used in the manufacture of bioprosthetic devices. Advantages may be related to the production of materials with homogeneous crosslinking distributions, associated with better definition in the nature of the chemical link that they introduce, due to a better distribution of glutaraldehyde within the tissue matrix before the crosslinking reaction is allowed to occur. As a result, materials with improved biological and mechanical properties are expected.     

利用胶原构建皮肤组织工程支架的研究

目的利用胶原构建皮肤组织工程支架。方法用Na2S、弹性蛋白酶预处理胎牛皮得到胶原纤维；经蛋白酶M降解胶原纤维后，0．5mol／L醋酸溶液溶解得到酸溶性胶原；再用蛋白酶N处理上述酸溶性胶原，最终得到生物相容性良好的胶原溶液；将胶原溶液构建皮肤组织工程支架。通过SDS-PAGE试验，分析酸溶性胶原分子量及基本结构；用皮肤组织工程支架材料包覆大鼠创面，观察创面愈合情况，研究支架材料对大鼠创伤愈合的影响；在支架材料上种植成纤维细胞，观察细胞扩增情况，以及支架材料对细胞移植影响。结果通过特异性蛋白酶M处理得到的酸溶性胶原，显示典型的1型胶原SDS-PAGE图谱；构建的皮肤组织工程支架呈多孔海绵状，孔径为50～200μm；在支架材料上种植成纤维细胞扩增情况良好；用于修复大鼠创面，具有促进创面愈合作用。结论酸溶性胶原经蛋白酶N处理后，生物相容性良好，适合于皮肤组织工程支架的构建，并具有良好生物活性。     

增强型生物活性玻璃-胶原复合支架材料的成骨效能研究

目的 探讨增强型生物活性玻璃-胶原复合支架材料的体内外成骨效能.方法取第3代BMSCs种植于支架材料(支架组),以等量细胞常规培养作为非支架组,培养1、3、5、7、9、11 d采用阿尔玛蓝法动态检测细胞的增殖率.取第3代BMSCs种植于支架材料(体外实验组),以等量细胞常规培养作为体外对照组,培养4、7 d采用实时定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测细胞骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原的mRNA表达.裸鼠皮下植入复合成骨样细胞的支架材料(体内实验组),取正常骨组织作为体内对照组,6周后以X线片、qRT-PCR、绀织学染色评估成骨情况.结果培养7～11 d支架组细胞增殖率显著高于非支架组,差异均有统计学意义(P<0.05).体外实验组培养7 d BMP-2、ALP、Ⅰ型胶原的mRNA表达显著高于体外对照组,差异均有统计学意义(P<0.05).体内实验组X线片示植入区域有密度增高影,支架材料形成白色硬性组织;BMP-2、Ⅰ型胶原、骨钙素、骨桥蛋白的mRNA表达较体内埘照组均增高,差异有统计学意义(P<0.05);组织学染色示支架材料大部分降解,新生骨形成明显.结论增强型生物活性玻璃-胶原复合支架材料具有良好的生物相容性,体内外均具有成骨效应.

Abstract：

Objective To study the in vivo and vitro biocompatibility and osteogenetic capacity of enhanced bioactive glass/collagen composite scaffold. Methods Bone marrow stromal cells(BMSCs)were collected and induced to osteoblast-like cells.The growth rate of BMSCs was detected and compared progressively through Alamar Blue.The RNAs of the cells were collected and detected for bone morphogenetic protein-2(BMP-2),alkaline phosphatase(ALP),collagen Ⅰ(Col-Ⅰ)through qRT-PCR on the fourth and seventh days.Scaffolds with induced osteoblasts were embedded into 3 nude mice subcutaneously in vivo and detected after 6 weeks.X-ray,qRT-PCR and tissue staining were used to detect the mRNA expressions of BMP-2,Col Ⅰ,osteocalcin(OCN)and ostcopontin(OPN)and bone formation. Results SEM(scanning electronic microscopy)showed BMSCs attached to the scaffold tightly and viably and proliferated actively on the scaffold.The growth rate in the experimental group was significantly higher after 7 days(P<0.05)than in the control group.qRT-PCR showed that the mRNA expressions of BMP-2,ALP and Col-Ⅰ in the experimental group were significantly higher than in the control group on the seventh day(P<0.05).X-ray showed that the dense images of embedded scaffolds were locally similar to those of normal bone after 6 weeks.qRT-PCR showed that the mRNA expressions of BMP-2,Col Ⅰ,OCN and OPN in the experimental group were significantly higher than those of normal bone(P<0.05).HE and Massort staining of the paraffin sections showed the scaffolds degraded generally and osteoblasts and chondrocytes proliferated abundantly and distributed irregularly.Bone formation could be observed obviously. Conclusion Enhanced bioactive glass/collagen composite scaffolds have good biocompatibility and osteogenetic capacity in vitro and vivo.     

胶原膜联合自体骨髓基质细胞及富血小板血浆修复牙槽骨缺损的实验研究

目的初步探讨胶原膜与骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）、富血小板血浆（plateletrich plasma,PRP）复合后修复牙槽骨缺损的应用潜能。方法将犬BMSCs与BME-10X胶原膜复合培养。取3只雄性杂种犬,拔除双侧上下颌第1、2前磨牙,保留唇舌侧牙槽嵴,制备一近远中向15mm×5mm,冠根向8mm的骨内缺损,随机分为四组。A组（空白对照组）：直接缝合牙龈;B组：缺损区上覆盖Bio-Gide胶原膜;C组：缺损区植入BMSCs胶原膜复合物后覆盖Bio-Gide胶原膜;D组：缺损区注入PRP,覆盖Bio-Gide胶原膜。分别于术后4、8、12周进行大体、X线片和组织学观察。结果BMSCs与胶原膜复合培养1d,细胞近似圆形或短梭形,3d左右可见多数细胞有突起,呈多边形及长梭形。大体观察：术后4周A组见骨缺损中央有明显凹陷,骨缺损区内见明显血肿机化物;B、C及D组骨缺损区主要为新生骨样组织充填,间杂少量血肿机化物。8周A组见骨缺损区凹陷基本长平,骨缺损顶部为纤维组织,血肿机化物被新生骨组织所取代;B、C及D组膜边缘破裂,与深面组织稍粘连,针头均不能刺入骨缺损表面。12周各组骨缺损区凹陷完全长平,A组牙槽嵴顶部纤维组织较其他组厚。X线片观察：各组骨质均长满骨缺损区;A、B、C及D组灰度值,4周分别为68、50、56及49,8周时为46、30、24及30,12周时为24、17、15及20。组织学观察：术后4周,A组缺损区可见大量纤维结缔组织及及新生血管形成的肉芽组织,未见明显新骨生成;B、C及D组膜的胶原结构均存在,其内侧面有新骨生成。8周A组缺损区新生骨小梁呈团灶状、网状;B、C及D组膜的胶原结构不完整,多个骨岛和少量纤维结缔组织连接整个骨缺损区。12周各组骨缺损区均被新生骨充填。结论使用胶原膜引导骨再生（guided boneregeneration,GBR）技术可促进牙槽骨缺损区成骨,将骨修复时间缩短为8周,但单独应用GBR的成骨作用与胶原膜复合BMSCs或PRP的成骨作用差异不明显,提示二者与GBR的联合应用还有待进一步研究。     

Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation

OBJECTIVES: A collagen degradation activity (CDA) assay was developed to improve the biochemical characterization of purified collagenase used for islet isolation. MATERIALS AND METHODS: Purified class I collagenase (CI) or class II collagenase (CII) from Clostridium histolyticum cultures were used in all experiments. The CDA assay was performed by incubating 50 microg/mL of FITC fibrils with CI or CII for 60 minutes at 35 degrees C. The correlation of the molecular species of the enzyme to CDA was determined by fractionating CI:CII mixtures over an anion exchange column. Individual fractions were analyzed for A280, CDA activity, and by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to correlate chromatographic analysis of these enzyme mixtures to the molecular species of collagenase effective in collagen degradation. RESULTS: CI has approximately 6 to 17 x higher specific activity than CII in this assay. Assays of different individual fractions recovered after anion exchange chromatography showed that the CDA of collagenase was dependent on the molecular species of the enzyme. Only intact CII and CI with molecular weights >or=100 kDa could degrade collagen fibrils. CONCLUSIONS: This assay provides a more reliable assessment of the functional activity of collagenase enzymes than peptide substrates currently used today. Fractionation of purified collagenase mixtures by anion exchange chromatography followed by analysis of individual fractions by SDS-PAGE and CDA assays will provide a powerful tool to analyze the molecular species of CI and CII required for islet isolation.