血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制肝癌的血管形成

目的 研究血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸（ODN）是否可以抑制人肝癌细胞系VEGF的蛋白表达,进而抑制肝癌的血管形成,探讨肝癌基因治疗的新方法。方法 人肝癌细胞系7721能表达VEGF,其培养上清液对牛主动脉内皮细胞（BAEC）的生长有促进作用。采用人工合成反义、正义ODN分别加入7721细胞培养液,比较7721细胞VEGF的表达以及各上清液刺激内皮细胞生长的受抑情况,即可了解ODN通过抑制VEGF的表达抑制肝癌的血管形成情况。结果 VEGF反义ODN明显抑制了人肝癌细胞VEGF的表达（灰度值：反义组122．6,正义组101．3,对照组106．3,P＜0．01）,且抑制率与剂量呈性关系（当剂量为1、2、5、10μmol/L时抑制率分别为：63．2％、82．4％、210．0％、287．5％）。结论 VEGF反义ODN能够抑制肝癌的血管形成,其有望成为抗肝癌的新一代基因治疗手段。     

脂质体介导c-myc基因反义寡核苷酸对人肝癌细胞的生物学影响

目的 探讨应用脂质体（ＬＲ）介导ｃ－ｍｙｃ基因反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）对人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１（７７２１细胞）的生物学影响。方法 利用１ｍｇ／Ｌ ＬＲ包裹２μｍｏｌ／Ｌ ｃ－ｍｙｃ ＡＳＯＤＮ转染于培养的人肝癌细胞,观察其对瘤细胞的作用。结果 四唑盐比色实验（ＭＴＴ）法测定ＬＲ－ＡＳＯＤＮ组作用４８ｈ对瘤细胞生长抑制率（５５％）较无ＬＲ的ＡＳＯＤＮ组的生长抑制率（１５％）显著提高（Ｐ〈０．     

靶向端粒酶催化亚单位基因hEST2反义寡核苷酸对人肝癌细胞生长的抑制作用

目的观察靶向端粒酶催化亚单位基因hEST2反义寡核苷酸对人肝癌细胞生长的抑制作用。方法从Genebank中钓取人端粒酶催化亚单位基因hEST2的mRNA序列，通过计算机模建二级结构辅助设计并合成硫化修饰反义寡核苷酸（癌泰得）。采用人肝癌裸小鼠原位移植模型（HCM—Y89）。实验分为生理盐水组，5-Fu10mg／kg组，癌泰得50mg／kg组、75mg／kg组，癌泰得75mg／kg联合5-Fu10mg／kg组、50mg／kg联合5-Fu10mg／kg组。尾静脉给药，每天1次，连续20d。观察移植瘤质量和抑瘤率、移植瘤体积、AFP浓度和移植瘤组织学。结果（1）5-Fu10mg／kg组的抑瘤率为27．85％，其他各治疗组的抑瘤率均在42．14％～74．29％之间；（2）各治疗组瘤质量、瘤体积和AFP浓度均低于生理盐水组且差异有统计学意义；（3）瘤体积和AFP浓度之间呈直线关系，为显著正相关（r=0．9977）；（4）癌泰得和5-FU治疗人肝细胞癌后，肝癌细胞出现不同程度的凋亡、坏死，同时伴有纤维组织增生。结论癌泰得对肝癌细胞生长具有抑制作用，疗效优于5-FU；与5-FU合用具有协同抗肿瘤效应。     

肝细胞生长因子受体反义寡核苷酸影响胶质瘤细胞对丝裂霉素C敏感性的研究

目的探讨肝细胞生长因子受体(c-Met)反义寡核苷酸(ASODN)增强胶质瘤细胞系 U251细胞对丝裂霉素C(MMC)敏感性的作用。方法用5 μmol／L c-Met ASODN封闭U251细胞 c-Met mRNA,将50μg/L的MMC与其共培养,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测c- Met mRNA表达,噻唑蓝(MTT)试验检测U251细胞的生长情况,免疫组织化学法检测细胞PCNA 蛋白的表达,体外检测细胞黏附率。以无义寡核苷酸处理及未处理U251细胞为对照。结果经 c-Met ASODN处理的U251细胞 ,c-Met mRNA的表达(吸光度值为62±21)明显低于经无义寡核苷酸处理U251细胞(吸光度值为150±25,P<0．05);对MMC的敏感性,细胞生长抑制率、细胞黏附率及PCNA指数分别为(53．84±12．21)％、(14．61±3．82)％和(0．35±0．02)％,明显高于相应的无义[(9．86±3．42)％、(24．84±5．90)％和(0．55±0．04)％,P<0．05]。结论 c-Met ASODN能增强胶质瘤细胞系U251细胞对MMC的敏感性,其分子机制可能与c-Met反义寡核苷酸下调了c- Met基因和PCNA蛋白的表达有关。     

生存素反义寡核苷酸对胃癌细胞的抑制作用

目的研究生存素(Survivin)反义寡核苷酸(ASODN)对胃癌细胞系HS746T的抑制作用。方法应用SurvivinASODN转染胃癌细胞,设空白、脂质体和正义链对照组,100、200和400nmol/L反义链组。电镜下观察细胞超微结构,流质细胞术、四甲基偶氮唑盐(MTT)法、逆转录聚合酶链反应(RTPCR)及Westernblot法检测转染后2～48h细胞凋亡指数(AI),生长抑制率(IR),SurvivinmRNA和蛋白表达的变化。结果转染后反义链组均能够下调SurvivinmRNA含量和蛋白表达,凋亡细胞增多。转染后24h100、200和400nmol/L反义链组AI为14.8%、19.4%及53.8%;IR(%)为45.98±2.99、50.96±3.38、72.79±2.48,反义链组高于其他对照组。结论Survivin反义寡核苷酸能够抑制胃癌细胞增殖。     

靶向survivin的反义寡核苷酸联合三苯氧胺治疗乳腺癌的研究

目的研究联合应用靶向survivin的反义寡核苷酸(ASODN)和三苯氧胺(TAM)对MCF-7乳腺癌细胞的作用。方法将一条20mer的ASODN序列与TAM作用于MCF-7乳腺癌细胞,分别为TAM组(单独应用TAM)、ASODN组(单独应用ASODN)及TAM+ASOND联合组(联合应用TAM+ASODN).运用四甲基偶氮唑盐比色试验(MTT)、流式细胞仪(FCM)、原位杂交以及分光光度法分别检测各组MCF-7细胞的抑制率、细胞周期和凋亡率、survivin mRNA表达和caspase-3活性。结果 TAM+ASOND联合组对MCF-7细胞的抑制率〔(62.26±3.92)%〕明显高于TAM组〔(42.30±6.63)%〕及ASODN组〔(54.77±9.99)%〕,P0.05.TAM+ASOND联合组的细胞凋亡率为(28.08±4.32)%,明显高于TAM组〔(18.94±4.01)%〕及ASODN组〔(21.12±3.95)%〕,P0.01.TAM+ASODN联合组对MCF-7细胞的G0/G1期阻滞作用明显强于TAM组和ASODN组(P0.05,P0.01);TAM+ASODN联合组survivin mRNA表达阳性率为(13.38±3.45)%,明显低于TAM组〔(39.67±7.42)%〕或ASODN组〔(27.50±5.80)%〕,P0.01.TAM+ASOND联合组MCF-7细胞的caspase-3活性(0.93±0.13)高于TAM组(0.50±0.09)或ASODN组(0.64±0.08),P0.01.结论靶向survivin的反义寡核苷酸能够促进MCF-7乳腺癌细胞凋亡,增加其对TAM治疗的敏感性。     

肝细胞生长因子及其受体反义寡核苷酸对胶质瘤血管形成的影响

肝细胞生长因子（HGF）与其受体c-Met蛋白相结合，启动一系列跨膜信号传导通路，刺激多种类型细胞和肿瘤的发生、发展、血管形成、侵袭及耐药密切相关。本研究旨在观察促血管形成因子HGF在胶质瘤中的作用，并通过建立裸鼠U251胶质瘤皮下模型探讨c-Met反义寡核苷酸（c-Met-ASODNs）对肿瘤血管形成的影响。     

反义寡核苷酸技术在肿瘤中的应用研究进展

随着分子生物学的迅猛发展,基因技术已应用于肿瘤研究领域,反义寡核苷酸(ASODN)技术具有特异性高、副作用少的特点.发展迅速.已逐渐从实验室走向临床.本文对反义寡核苷酸技术的作用机制、设计及在肿瘤中的研究应用等方面作一综述,并提出目前该领域存在的问题及其应用前景.     

survivin反义寡核苷酸诱导胆囊癌细胞凋亡的研究

目的研究survivin反义寡核苷酸(ASODN)对胆囊癌细胞凋亡的诱导作用。方法采用脂质体介导survivinASODN转染人胆囊癌细胞株GBC SD,采用流式细胞仪技术检查细胞凋亡变化,采用电镜技术观察细胞的形态变化,采用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)检测survivin基因表达的变化。结果脂质体介导转染survivinASODN后,胆囊癌细胞内survivinmRNA表达相对系数为0.512±0.011,明显低于未转染者的0.980±0.012(P<0.01),平均下调了47.83%(P<0.01),凋亡细胞比率为(26.28±3.91)%,明显高于未转染者的(0.50±0.23)%,P<0.01,电镜下可见胆囊癌细胞呈典型凋亡样改变。结论survivinASODN转染后能下调survivin的表达,可有效诱导GBC SD细胞凋亡。     

RelA反义寡核苷酸对胰腺癌细胞增殖活性的影响

目的 研究核因子-κBp65(RelA)反义寡核苷酸对胰腺癌细胞株Capan-2增殖活性的影响。方法 噻唑蓝(MTT)还原法、克隆形成试验观察RelA反义寡核苷酸对细胞的生长抑制,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Rel AmRNA变化,细胞免疫组织化学检测RelA蛋白表达,流式细胞仪检测细胞周期。结果 RelA反义寡核苷酸作用后,细胞生长抑制率可达43.5％,克隆形成率下降(47.3±8.2 vs 26.7±5.5,P<0.05),RelA mRNA表达降低,RelA蛋白表达下降(70.8±6.5 vs 49.5±6.0,P<0.01),G_0/G_1期细胞由56.54％增至82.83％,S期细胞由39.06％减至11.29％。结论 RelA反义寡核苷酸能够抑制胰腺癌细胞的生长。     

中期因子mRNA在原发性肝癌中的表达及其意义

目的：探讨中期因子（MK）mRNA在原发性肝细胞癌（HCC）中的表达及其意义。方法：收集33例人肝细胞癌组织、配对癌旁肝组织及10例肝良性肿瘤组织、5例正常肝组织、采用TRIzol一步抽提法提取总RNA，应用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测MKmRNA的表达。结果：28例肝细胞癌可见MKmRNA表达，阳性率为84．8％，而配对的癌旁组织中仅见3例表达，正常肝脏和肝脏良性肿瘤细胞无1例阳性。统计学分析表明，肝细胞癌肝细胞癌MKmRNA表达率与其他各组的差异有非常显著性（P＜0．01），但肝细胞癌MKmRNA表达与其组织学类型、病理分级、瘤体大小、包膜状况及其甲胎蛋白（AFP）值之间差异无显著性（P＞0．05）。结论：肝细胞癌在mRNA水平上表达MK增加，检测MK表达情况可作为HCC的辅助诊断指标之一，对术后制定进一步治疗方案也有参考价值。     

细胞周期素D1反义cDNA治疗肝癌的研究

目的 通过基因反义封闭技术抑制细胞周期素D1（CydinD1）的表达，研究其对肝癌细胞增殖以及成瘤性的影响。方法 以肝癌HepG2细胞株为研究对象，通过转染可表达CyclinD1反义互补脱氧核苷酸（AScDNA）的质粒后，观察CyclinD1反义cDNA对肝癌细胞CyclinD1基因表达、体外增殖活性及裸鼠体内成瘤性的影响。结果 噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖活性显示转染表达反义CydinD1的质粒后，HepG2细胞的增殖受到抑制．抑制作用在48h左右最强；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测显示CyclinD1 mRNA基因的表达明显被抑制；间接免疫荧光检测结果显示CyclinD1蛋白表达显著降低；流式细胞仪检测结果显示G0／G1期的细胞比例增高，G2＋M和S期的细胞比例下降，HepG2细胞周期在G1期被阻滞；裸鼠成瘤试验显示肝癌HepG2细胞的成瘤性受到明显抑制。结论 CyclinD1反义cDNA可以特异性的抑制肝癌HepG2细胞株CyclinD1蛋白的表达，从而调控细胞周期，抑制肝癌细胞增殖及体内成瘤性。CyclinD1反义cDNA对于肝细胞癌的生物治疗具有一定的应用前景。     

陷阱受体3反义寡核苷酸对胶质瘤U251细胞凋亡的影响

目的 观察陷阱受体3(DcR3)反义核苷酸(ASODN)在胶质瘤细胞凋亡中的作用.方法 构建并挑选DcR3反义核苷酸,转染U251细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot方法 观察DcR3 mRNA和蛋白有无降低,流式细胞仪观察细胞凋亡的变化.结果 经1.2 μmol/L AS20DN处理的U251细胞可有效地降低DcR3 mRNA和蛋白表达,DcR3/β-actin比值分别为(12.4±3.1)%和(13.5±4.2)%,错义链组、脂质体组、对照组mRNA和蛋白分别为(68.8±4.5)%、(74.5±5.0)%、(71.3±6.4)%和(78.2±6.8)%、(79.8±4.5)%、(76.4±5.6)%,差异有统计学意义(P＜0.05),同时,传染DcR3反义核苷酸的U251细胞凋亡率为(42.9±13.1)%,明显高于错义链组(15.8±4.8)%、脂质体组(15.7±3.7)%和对照组(14.6±4.0)%,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 DcR3反义核苷酸可使U251细胞凋亡增多.     

反义DcR3寡核苷酸协同顺铂诱导胶质瘤细胞凋亡

目的 观察陷阱受体3(DcR3)反义核苷酸(ASODN)与顺铂对胶质瘤细胞的影响.方法 设计DcR3反义核苷酸,转染U251细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot方法观察DcR3 mRNA和蛋白有无降低,用噻唑蓝(MTT)比色法、荧光显微镜DAPI染色分别检测对照组、顺铂组、反义核苷酸组、协同作用组对胶质瘤细胞U251的影响.结果 反义DcR3寡核苷酸组可有效地降低DcR3 mRNA和蛋白表达,DcR3/β-actin比值分别为(12.4±3.1)%和(13.5±4.2)%,错义链组、脂质体组、对照组mRNA和蛋白分别为(68.8±4.5)%、(74.5±5.0)%、(71.3±6.4)%和(78.2±6.8)%、(79.8±4.5)%、(76.4±5.6)%,差异有统计学意义(P<0.05).顺铂与反义寡核苷酸组细胞凋亡率分别为(18.32±2.32)%和(20.43±3.45)%,较对照组(5.21±0.45)%,差异有统计学意义(P<0.05),两者与协同处理组(45.23±6.78)%比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 DcR3反义核苷酸与顺铂协同作用可有较强的促胶质瘤细胞凋亡作用.     

survivin基因反义寡核苷酸对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡与细胞周期的调控作用

目的研究survivin基因反义寡核苷酸转染对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞周期、细胞凋亡的作用及其可能的作用机制。方法采用脂质体介导survivin基因反义寡核苷酸转染人肝癌SMMC-7721细胞,透射电镜观察细胞超微结构,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡,RT-PCR方法检测cyclin B1 mRNA的表达。结果survivin反义寡核苷酸转染后细胞内cyclin B1表达由0.36±0.03增加至0.91±0.03,同时G2-M期细胞及凋亡细胞比例分别由5.81%及0.7%明显增加至42.11%及31.35%,同时细胞超微结构呈典型凋亡样改变。结论survivin基因反义寡核苷酸转染细胞后可以通过诱导cyclinB1的表达,导致G2-M期阻滞,从而诱导细胞凋亡的发生。survivin基因反义寡核苷酸转染可以作为治疗肝癌的重要新方法。     

转染反义DcR3真核表达载体协同氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡

目的研究DeR3反义mRNA与氟尿嘧啶对肝癌细胞的影响。方法用M1vr、TUNEL、流式细胞术分别检测反义重组体组、氟尿嘧啶处理组、协同作用组对肝癌细胞株SMMC7721的影响。结果协同作用组促凋亡作用明显强于其余二组。结论PVAXⅠ-as-DeR3与氟尿嘧啶协同作用可使在氟尿嘧啶浓度降低的同时保持较强的促肝癌细胞凋亡作用。     

反义微小RNA-21寡核苷酸对食管癌EC9706细胞生长的抑制作用

目的 观察微小RNA-21 (miRNA-21)反义寡核苷酸对食管癌EC9706细胞的生长抑制作用.方法 反义寡核苷酸转染食管癌EC9706细胞,噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长抑制率,实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测细胞miRNA-21水平,流式细胞仪检测细胞凋亡,FQ-PCR检测程序性细胞死亡因子4 (PDCD4) mRNA表达水平,免疫荧光检测PDCD4蛋白表达.结果 反义寡核苷酸抑制细胞活性的最佳浓度为0.5 μmol/L,转染反义寡核苷酸后细胞内miRNA-21的表达水平明显下调为无义组的0.045 ±0.021,细胞凋亡明显增加为12.95％,生存率显著降低为(48.21±9.56)％,差异有统计学意义(P＜0.05).反义寡核苷酸组中PDCD4 mRNA相对表达增高为0.452±0.002,且蛋白质表达水平增高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 miRNA-21反义寡核苷酸可通过上调PDCD4有效抑制食管癌EC9706细胞增殖并促进凋亡.     

反义局部粘着斑激酶抑制肝癌侵袭生长的研究

目的　观察反义局部粘着斑激酶 (FAK)脱氧寡核苷酸 (ODN)转染对Bel740 2肝癌移植瘤侵袭性生长的影响 ,并探讨其作用机制。方法　以LipofectAMINE介导的反义FAKODN转染Bel 740 2肝癌细胞株后 ,于 6只裸鼠双侧颈背部、髋部共 4处皮下接种 ,观察移植瘤生长情况 ,并行肿瘤微血管密度 (MVD)的免疫组织化学检测及MMP2与TIMP2表达的逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)检测。结果　反义FAKODN转染使裸鼠皮下移植瘤的生长受到显著抑制 ,抑瘤率为3 5 .7% ;MVD在反义转染组 ( 9.5 99± 1.2 84)显著低于对照组 [( 13 .915± 2 .618) ,P <0 .0 5 ] ;MMP2表达在反义转染组 ( 0 .199± 0 .0 61)显著低于对照组 ( 0 .42 1± 0 .118) ,TIMP2表达在反义转染组( 0 .461± 0 .15 3 )则显著高于对照组 [( 0 .2 98± 0 .10 4) ,P <0 .0 5 ]。结论　信号转导分子FAK表达阻断可显著抑制Bel 740 2肝癌细胞株在裸鼠体内的侵袭性生长 ,病理性肿瘤血管生成减少及MMP2、TIMP2表达改变与其抗肿瘤作用密切相关。     

端粒酶催化亚单位基因反义寡核苷酸诱导前列腺癌细胞凋亡的研究

目的 探讨端粒酶催化亚单位(hTRT)基因反义寡核苷酸(ASODN)对前列腺癌细胞的诱导凋亡作用。方法合成针对hTRT的28mer ASODN,转染前列腺癌细胞12～36 h后,细胞计数、透射电镜、DNA Ladder、原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测癌细胞凋亡;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验(PCR-ELISA)技术检测hTRT基因表达和端粒酶活性。结果0.5～2.0μmol/L ASODN转染后,癌细胞体外生长抑制16.08％～53.41％(P<0.05),部分癌细胞呈现凋亡形态学改变和DNA片段化,凋亡率为9.36％～37.54％(P<0.05),hTRT表达减弱24.48％～86.73％(P<0.01),端粒酶活性降低24.74％～76.72％(P<0.01)。 结论运用ASODN阻断端粒酶hTRT基因表达,能降低端粒酶活性,显著诱导前列腺癌细胞凋亡。     

半乳糖受体介导的增殖细胞核抗原反义核酸对肝癌Bel-7402细胞增殖的靶向抑制作用

目的探讨半乳糖受体介导的增殖细胞核抗原（PCNA）反义核酸（ASODN）对肝癌Bel-7402细胞增殖的靶向抑制作用。方法选择来源于3个不同系统的肿瘤细胞：肝癌Bel-7402细胞、肺腺癌GLC-82细胞、慢性髓系白血病K562细胞，将半乳糖-聚乙烯亚胺（Gal-PEI）与PCNA反义核酸结合形成交联复合物Gal-PEI-ASODN，台盼兰拒染计数法观察不同浓度Gal-PEI-ASODN对这3种细胞增殖的影响；流式细胞仪检测3种细胞对羧基荧光素（FAM）标记的Gal-PEI-ASODN的摄取率及细胞内平均荧光强度；相差／荧光显微镜观察FAM标记的Gal-PEI-ASODN及ASODN进入3种不同细胞的情况。结果浓度从10μmol／L到40μmol／L的ASODN作用于Bel-7402细胞48h后，可抑制其增殖，IC50为29．3μmol／L。浓度从0．05μmol／L到0．25μmol／L的ASODN作用于Bel-7402细胞48h后，均未显著抑制其增殖；相同浓度的Gal-PEI-ASODN作用于3种不同细胞48h后，对GLC-82细胞、K562细胞的增殖未产生显著抑制作用，而Bel-7402细胞的增殖却受到明显抑制。对于Bel-7402细胞，Gal-PEI-ASODN的IC50为0．06μmol／L，与单纯ASODN组相比。增敏倍数为488倍。FAM标记的Gal-PEI-ASODN或ASODN与不同细胞孵育0．5h到2．0h内，Gal-PEI-ASODN-Bel-7402细胞组所有时间点的细胞荧光摄取率、胞内平均荧光强度均显著高于A-SODN-Bel-7402细胞组、Gal-PEI-ASODN-GLC-82细胞组和Gal-PEI-ASODN-K562细胞组。FAM标记的Gal-PEI-ASODN或ASODN与Bel-7402、GLC-82、K562细胞作用1h后．Gal-PEI-ASODN-Bel-7402组的细胞荧光摄取率较高（反义核酸大量分布于细胞的胞浆内），其他各组细胞荧光摄取率较低。结论半乳糖受体介导的PCNA反义核酸能被肝癌Bel-7402细胞高效地摄取。抑制Bel-7402细胞的增殖，增强反义核酸的作用效果，具有靶向性。