pcDNA3/NT-3真核表达载体的构建及其表达

目的构建大鼠神经营养因子3（NT-3）基因真核表达载体并观察其在真核细胞内的表达情况。方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以阳离子脂质体Li-pofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NT-3在细胞内的表达。结果RT-PCR产物为822bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/NT-3酶切后产生822bp和5.2kb的片段,DNA测序证实822bp片段的碱基序列与大鼠NT-3基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/NT-3重组质粒。将其转染真核细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NT-3能在真核细胞中正确表达。结论成功构建了重组真核表达质粒载体pcDNA3/NT-3,为后续的研究奠定基础。     

pcDNA3-hNGFb真核表达载体的构建及其表达

目的构建人神经生长因子β（NGF-β）基因真核表达载体并观察其在L929细胞内的表达。方法以RT-PCR从人脑组织总RNA中扩增NGF-βcDNA,将其克隆到真核表达载体pcD-NA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以Lipofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NGF-β在细胞内的表达。结果RT-PCR产物为750bp的特异片段,重组质粒pcDNA3-hNGFb酶切后产生750bp和5.2kb的片段,DNA测序证实750bp片段的碱基序列与人NGF-βcDNA完全一致。将其转染L929细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NGF-β及其前体proNGF-β能在真核细胞中正确表达。结论成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-hNGFb,为后续的研究奠定基础。     

空肠弯曲菌cdtA、cdtB及cdtC真核表达重组载体的构建与表达

目的以空肠弯曲菌(CJ)细胞扩张毒素(cytolethal distending toxi,CDT)cdtA、cdtB及cdtC为目的基因,构建CJ-cdtA、cdtB及cdtC基因的真核表达重组载体pcDNA3.1(+)-cdtA,pcDNA3.1(+)-cdtB,pcDNA3.1(+)-cdtC,为CJ核酸疫苗的研制提供实验材料。方法用Primer5.0软件分析GenBank中空肠弯曲菌细胞扩张毒素cdtA、cdtB及cdtC基因序列,设计合成相应特异性引物,引入EcoRI、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,PCR扩增cdtA、cdtB及cdtC目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1(+)-cdtA、pcDNA3.1(+)-cdtB及pcDNA3.1(+)-cdtC;通过酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果扩增出特异的cdtA、cdtB及cdtC基因片段,大小约为807bp、798bp、570bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了CJ真核表达重组载体pcDNA3.1(+)-cdtA、pcDNA3.1(+)-cdtB及pcDNA3.1(+)-cdtC。结论 PCR扩增得到了大小约为807bp、798bp、570bp的CJ-cdtA、cdtB及cdtC目的基因片段;并成功构建了pcDNA3.1(+)-cdtA、cdtB及cdtC真核表达重组载体。     

pEGFPN1-GDNF真核表达载体的构建及其表达

目的 构建人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因真核表达载体并观察其在COS-7细胞内的表达.方法 应用RT-PCR从U251细胞总RNA中扩增GDNF cDNA,将其克隆至真核表达载体pEGFPN1,经酶切鉴定及序列分析后,以Fugene HD介导转染COS-7细胞,应用免疫细胞化学和Western blot鉴定其在细胞内的表达.结果 RT-PCR产物为650bp的特异片段,重组质粒pEGFPN1-GDNF经双酶切产生650bp和4.7kb的片段,测序分析结果与文献报道结果完全一致.将其转染COS-7细胞后,免疫细胞化学、Western blot结果表明GDNF蛋白能在COS-7细胞中正确表达.结论 成功构建了pEGFPN1-GDNF真核表达载体,为进一步开展帕金森病的基因治疗研究奠定了基础.     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2) 是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。 目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。 设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07/2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。 材料：pcDNA3.1(+)载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。 方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录-聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM-T- hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T- hBMP-2质粒和pcDNA3.1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3.1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP-2的表达。 主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA 反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM-T-hBMP-2 和pcDNA3.1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。 结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1.2 kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3.1- hBMP-2构建正确;该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

构建pcDNA3.1/Hygro(+)-Lefty A真核表达载体及Lefty A的稳定表达细胞系

背景：Lefty基因可能通过拮抗转化生长因子β1信号通路发挥抗肾纤维化作用。 目的：为验证其抗纤维化作用,构建pcDNA3.1/Hygro(+)-Lefty A真核表达载体,并建立Lefty A稳定表达细胞系。 设计、时间及地点：基因克隆构建,单一样本观察,于2008-04/07在武汉大学人民医院中心实验室完成。 材料：人肾小管上皮细胞株购于中国协和医科大学细胞库;真核表达载体pcDNA3.1/Hygro(+)由美国纽约州石溪大学Siamak Tabibzadeh教授惠赠;Lefty A克隆载体pCMV-SPORT6购自武汉晶赛公司。 方法：以pCMV-SPORT6为模板经PCR反应获得Lefty A编码区DNA,将其插入pcDNA3.1/Hygro(+)中构建Lefty A真核表达载体;通过LipofectamineTM 2000将此重组质粒转染入人肾小管上皮细胞中,通过Hygromycin筛选挑取阳性表达克隆从而构建Lefty A稳定表达细胞系。 主要观察指标：PCR扩增产物电泳鉴定结果。重组质粒的酶切鉴定结果。重组质粒基因测序结果。Lefty A稳定表达细胞系的筛选及其细胞内Lefty A mRNA 表达。 结果：pCMV-SPORT6经针对人Lefty A基因编码区序列的上下游引物PCR扩增后,10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,在1.0 kb条带处出现稍大于1.0 kb的特异性扩增条带,与预期1.1 kb目的片段大小相符。重组质粒分别被Hind Ⅲ、BamH Ⅰ单酶切后所得片段大小一致,均为6.7 kb,与重组质粒理论大小一致;经双酶切后得到大小分别为5.6 kb和1.1 kb的2条片段,与pcDNA3.1/Hygro(+)及Lefty A片段大小相符。将酶切鉴定阳性重组质粒测序,对测序结果进行生物信息学分析,发现与人Lefty A基因编码区序列完全一致。稳定转染Lefty A重组质粒的人肾小管上皮细胞高表达Lefty A mRNA。 结论：pcDNA3.1/Hygro(+)-Lefty A真核表达载体构建成功,并建立了Lefty A稳定表达细胞系。     

人β-神经生长因子前体基因重组真核表达载体的构建

目的构建人β-神经生长因子(β-NGF)前体基因重组真核表达载体,为其在真核细胞中表达并获得具有神经生长因子活性的蛋白及临床应用打下基础。方法利用基因重组技术,将质粒PUC18-β-NGF进行酶切获得β-NGF基因片段,将其插入真核表达载体pcDNA3.0;用PCR技术以及酶切和测序对插入片段进行分析和进一步鉴定。结果人β-神经生长因子前体基因成功的插入真核表达载体pcDNA3.0。结论人β-神经生长因子前体基因重组真核表达载体pcDNA3.0-β-NGF构建成功,为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础。     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于-淀粉样多肽的异常。 目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。 方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞(SH-SY5Y)的总cDNA中,扩增出约1.0 kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。 结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

增强型绿色荧光蛋白-神经标识真核表达载体构建及在细胞内的表达

目的 构建可转染神经胶质细胞和神经元的增强型绿色荧光蛋白-神经标识(EGFP-ID)真核表达载体,为神经突起损伤活体研究提供技术方法. 方法 采用PCR方法分别从质粒pEGFP-N1载体和大鼠脑组织基因组DNA中扩增EGFP和ID序列.通过T4 DNA连接酶将纯化后的PCR产物EGFP与经过BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的pcDNA4.1-hisB载体连接.将经克隆测序确定的pcDNA4.1-EGFP经由NotⅠ和Xba Ⅰ双酶切并与纯化的PCR产物ID连接,再次克隆测序确定为pcDNA4.1-EGFP-ID.将pcDNA4.1-EGFP与pcDNA4.1-EGFP-ID在转染试剂Fugene6 介导下转染人神经胶质瘤U87细胞和小鼠原代培养神经元,通过倒置荧光显微镜观察EGFP在2种细胞内的分布.此外,用50 μmol/L核苷类似物司他夫定处理神经元8d,第8天末观察EGFP-ID 示踪细胞突起发育情况,并与免疫荧光检测结果作比较. 结果 成功扩增得到EGFP和ID基因片段,重组得到EGFP-ID真核表达载体,该载体携带的EGFP基因在U87细胞和神经元内表达并布满细胞突起,示踪神经元突起形态变化的结果与免疫荧光观察结果一致. 结论 pcDNA4.1-EGFP-ID能够介导EGFP基因在神经元和胶质细胞突起内表达,从而直观再现神经突起形态特征.     

GDNF基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞的建立

目的 建立脑源性神经营养因子(GDNF)基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞.方法以RT-PCR扩增GDNF基因编码序列,将其克隆至质粒pEGFPN1构建重组质粒pEGFPN1一GDNF,经酶切鉴定及序列分析后,以FuGENE HD转染试剂介导转染大鼠胚胎中脑神经干细胞.免疫细胞化学、western blot鉴定GDNF的表达,诱导分化后免疫细胞化学鉴定其分化能力.结果 RT-PCR产物为650bp的特异片段,重组质粒pEGFPN1-GDNF经酶切产生650bp和4.7kb的片段,序列分析结果与文献报道一致.免疫细胞化学、western blot表明GDNF基因修饰细胞能正确表达GDNF且基因修饰不影响其增殖与分化.结论建立GDNF基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞,为进一步应用其开展帕金森病的细胞移植治疗研究奠定基础.     

Dickopff-1的真核表达载体构建及其对SHG44的作用

目的 构建Diekopff-1(DKK-1)的真核表达质粒,研究SHG44转染DKK-1并经BCNU处理后其生物学特性的变化.方法 将纯化扩增的人DKK-1与真核表达载体peDNA3.1连接后转化人大肠杆菌DH5α感受态扩增重组,以LipofectamineTM2000介导将重组质粒转染SHG44细胞,经G418筛选后进行鉴定.BCNU处理转染DKK-1基因后的SHG44细胞,流式细胞仪检测细胞特性变化.结果 扩增获得的816 bp特异片段,重组质粒经鉴定及测序分析结果 完全一致.重组载体转染SHG44细胞经G418筛选后,转染细胞在DNA、mRNA、蛋白水平均有DKK-1的表达.BCNU处理后的未转染、空质粒转染、重组质粒转染的三组SHG44细胞,平均凋亡率分别为1.0%、1.4%、8.0%.结论 本实验成功构建了pcDNA3.1-DKK-1真核表达质粒,并建立稳定表达DKK-1蛋白的胶质瘤细胞株(SHG44-DKK-1).转染DKK-1能增强SHG44对BCNU的敏感性,促进肿瘤细胞的凋亡.     

人类GAD67基因转染骨髓基质源性神经干细胞及初步检测

目的利用转基因技术将人类谷氨酸脱羧酶（GAD）67基因转染骨髓基质源性神经干细胞仍MSCs-D-NSCs），获得GAD67修饰的成体专能干细胞。方法以PCR、双酶切及测序鉴定pEGFP-C2-GAD67和pcDNA3.1-GAD67重组子；利用密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs并促其向NSCs方向分化，将编码人类GAD67基因的真核表达质粒pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3．1-GAD67分别转染BMSCs-D-NSCs，荧光显微镜下观察并用流式细胞仪检测转染效率。结果pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3.1-GAD6，均可扩增出约1800bp目的条带，经双酶切和基因测序证实。荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光细胞，两种载体转染效率分别为39.3％和40.5％。结论pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3.1-GAD67真核表达载体重组正确，利用脂质体介导人类GAD6，基因能有效转染BMSCs-D-NSCs，为进一步观察其GAD67基因和蛋白的表达提供了前提条件。     

C99引导淀粉样蛋白前体裂解过程的活体细胞研究

目的 构建含有Swedish突变和Flemish突变的荧光真核表达系统,研究淀粉样蛋白前体(APP)酶解过程.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)得到编码Flemish突变的APP最后300个碱基片段(C99)、蓝色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白碱基序列(YFP),生物合成含有Swedish突变的APP中间54个碱基片段(54 bp),利用基因工程技术将CFP、54 bp、YFP、C99片段克隆至载体质粒pcDNA3.0中,通过酶切、PCR、测序鉴定最终得到重组质粒pcDNA3.0-CFP-54 bp-YFP-C99,并将其转染至人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中,利用激光共聚焦显微镜观察荧光表达;检测荧光共振能量转移(FRET),以及进行β淀粉样蛋白(Aβ)免疫细胞化学染色.结果 (1)基因序列分析证明重组质粒构建成功.(2)利用激光共聚焦显微镜观察转染细胞,发现融合基因能够准确表达蓝色和黄色荧光.(3)FRET检测发现CFP-54bp-YFP-C99可以发生β和γ裂解产生Aβ,沉积在细胞内、胞膜上以及细胞间隙;CFP-54bp-YFP不能发生β裂解.(4)免疫细胞化学染色证实Aβ在细胞膜、胞浆内以及细胞间隙聚集沉积.结论 (1)重组质粒能够完成APP的有序裂解产生Aβ.(2)成功实现在活体细胞中观察APP裂解.(3)Aβ有可能产生于APP由胞浆至胞膜的运输过程中.(4)C99对于APP被裂解有重要意义,可能起到信号肽样的引导定位作用.     

突变型APP双荧光融合基因的构建和FRET对其表达的研究

目的探讨Alzheimer病的发病机制,研究淀粉样蛋白前体(APP)酶解过程,构建含有Swedish突变的双荧光真核表达系统。方法通过聚合酶链式反应(PCR)得到蓝色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白碱基序列(YFP),生物合成含有Swedish突变的APP中间54个碱基片段(54bp),利用基因工程技术将CFP、54bp、YFP片段克隆至载体质粒pcDNA3.0中,得到重组质粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP,将其转染至人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中,利用激光共聚焦显微镜观察荧光表达,检测荧光共振能量转移(FRET)。结果酶切和基因序列分析证明重组质粒构建成功;对转染细胞的荧光和FRET检测发现融合基因能够准确表达荧光,同时可以观测到FRET现象。结论含有Swedish突变的荧光融合基因的构建为探索AD的发病机制、活体观察APP裂解奠定了基础。     

GDNF基因真核表达载体的构建及其在脐血CD34+干细胞的表达

目的构建人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因的新型真核表达载体,为进行GDNF基因修饰的脐血干细胞移植治疗脑梗死奠定基础。方法将GDNF基因克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达载体中,进行酶切鉴定及DNA测序分析,并将携带有GDNF基因的该真核表达载体,通过脂质体介导,转染人脐血CD34 细胞,荧光显微镜、ELISA检测转基因脐血干细胞GDNF的表达与释放。结果经双酶切鉴定和测序证实已将GDNF基因DNA片段正确插入到真核表达载体中,并能在脐血CD34 干细胞中表达、分泌有活性的GDNF。结论成功构建pEGFP/GDNF基因新型真核表达载体。     

白细胞介素12基因修饰大鼠胶质瘤9L/rIL-12细胞的建立

目的 构建大鼠白细胞介素12（rIL-12）基因真核表达载体质粒,建立rIL-12基因修饰并稳定表达的大鼠胶质瘤9L/rIL-12细胞.方法 用Trizol提取大鼠腹腔巨噬细胞总RNA,RT-PCR方法分别获取rp40和rp35 cDNA,依次克隆人pcDNA3.1（-）/mycHis A质粒中,以IRES连接双亚基,构建成双顺反子真核表达载体质粒pcDNA3.1/rIL-12.将构建的重组质粒转染大鼠胶质瘤9L细胞,G418筛选单克隆细胞株,ELISA法检测其培养上清rIL-12（p70）蛋白含量,同时抽提细胞RNA,RT-pCR方法检测rp40、rp35基因在9L/rIL-12细胞中的表达.结果 所得rp40cDNA序列与Gene Bank NM022611及AF133197、rp35cDNA序列与Gene Bank NM053390及AF177031均一致,构建的质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确.质粒转染9L细胞后,获得2个rIL-12基因稳定、高效表达的9L/rIL-12单克隆细胞株,其培养上清rIL-12（p70）蛋白含量分别为139.0、162.1 pg/ml,RT-PCR结果显示细胞中rIL-12基因表达呈阳性.结论 成功构建了rIL-12真核表达质粒pcDNA3.1/rIL-12,并建立了9L/rIL-12细胞株,为rIL-12基因修饰的胶质瘤疫苗研究打下了基础.     

Livin基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胶质瘤Livin基因表达的影响

目的构建凋亡抑制基因livin基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞中对livin基因表达的抑制。方法设计有小发夹结构的2条livinβ siRNA对应的DNA序列,将其克隆入pSliencer 3.1质粒,构建重组质粒pSliencer-livinβ,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。以脂质体法将pSliencer-livinβ转染人胶质瘤细胞。采用RT-PCR和Western-blot检测Livinβ蛋白的表达,筛选最有效的一组pSliencer-livinβ质粒。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-livinβ构建成功。转染后胶质瘤细胞livinβmRNA和蛋白表达均受到明显抑制。结论成功构建livinβ基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体能够显著抑制人胶质瘤细胞livinβ基因的表达。