RNA干扰技术抑制smad4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：探讨用RNA干扰技术下调smad4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响。方法：用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的三对短发夹状RNA（shorthairpinRNA，shRNA）序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中，构建smad4shRNA表达载体pGenesil—smad4一shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa，经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测抑制smad4基因对宫颈癌细胞增殖的影响。结果：成功构建分别携带三段shRNA及空载体对照的重组质粒pGenesil—smad4-shRNA1、2、3和pGenesil-con，三种shRNA重组质粒中pGenesil—smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4mRNA及smad4蛋白表达，筛选出的HeLa／shRNA2细胞增殖能力明显增强。结论：应用RNA干扰技术能筛选出特异而高效阻断smad4基因表达及功能的shRNA，smad4基因表达下调能明显促进宫颈癌细胞生长。     

STAT3特异性小干扰RNA表达载体的构建及其对STAT3表达的抑制

目的　构建特异性抑制信号转导与转录激活因子3(STAT3)的小干扰RNA(siRNA)表达载体并检测其对STAT3表达及PC 3细胞增殖的抑制作用。方法　设计、合成STAT3特异性的短链寡核苷酸,经退火形成双链DNA片段,克隆到pSilencerTM2.1 U6载体中,构建STAT3特异siRNA的表达载体,HindIII和BamHI双酶切及测序鉴定重组体,并转染PC 3细胞,G418筛选出稳定表达细胞株,半定量反转录聚合酶链反应(RT PCR)方法和免疫印迹法检测STAT3mRNA和蛋白的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖活性。结果　经双酶切与测序鉴定成功构建STAT3 siRNA表达载体,转染前列腺癌细胞株PC 3可显著抑制细胞中STAT3mRNA和蛋白的表达水平(抑制率分别为52.4% 及50.5% ),且细胞增殖活性亦较未转染PC 3细胞显著降低(p<0.05)。结论　运用pSilencerTM2.1 U6载体构建的STAT3 siRNA表达载体可有效抑制STAT3的表达及前列腺癌细胞的增殖。     

RNA干扰Hedgehog信号通路对胃癌细胞增殖和凋亡影响及其机制的探讨

目的:观察RNA干扰Hedgehog信号通路关键因子Glil对胃癌细胞的生物学行为的影响并分析相关机制.方法:人工合成靶向Hedgehog信号通路活化关键因子Glil的siRNA(Glil siRNA)和对照无关siRNA(Con siRNA),应用脂质体将其转入人胃癌细胞SGC-7901,48 h后收集细胞,分别应用MTT法和流式细胞仪检测对细胞增殖、周期和凋亡的影响,同时应用TaqMan探针实时定量PCR检测靶基因Glil、Hedgehog活化标志基因PTCH1、细胞周期负调控蛋白基因CDKN1A(p21)和抗凋亡基因Bel-2的表达变化.结果:以单纯转染剂对照组为参照,siRNA转染后48 h,Glil siRNA和Con siRNA的抑制率分别为(53.33±6.06)%和(13.33±6.11)%,两组差异有统计学意义,t=5.701,P=0.005,n=3;G0/G1期分别为(80.67±4.51)%和(66.00±3.10)%,两组差异有统计学意义,t=5.500,P=0.005,n=3;凋亡率分别为(15.97±1.76)%和(7.77±1.11)%,两组差异有统计学意义,t=4.671,P=0.01,n=3;GlilsiRNA转染细胞内Glil、PTCH1、Bcl-2和CDKN1A(p21)基因的相对(参照单纯转染剂)表达分别为对照的0.24±0.11、0.43±0.09、0.52±0.13和2.10±0.30.分别与Con siRNA相比4条基因表达均差异有统计学意义,t=9.759,P=0.001,n=3;t=8.645,P=0.001,n=3;t=4.940,P=0.008,n=3;t=5.962,P=0.004,n=3.结论:应用RNA干扰技术可以阻断Hedgehog信号通路关键因子Glil的表达,抑制Hedgehog信号通路活化,从而有效地抑制胃癌细胞的增长,诱导凋亡,可能成为治疗胃癌新的生物靶向治疗途径.     

RNA干扰TBX4基因对肺癌H460细胞增殖迁移及侵袭能力影响的研究

目的:探讨TBX4基因表达对肺癌H460细胞增殖和侵袭转移能力等生物学行为的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法:采用RNA干扰的方法降低肺癌H460细胞TBX4的基因表达,采用磺酰罗丹明B(SRB)法检测细胞增殖能力;Transwell小室法检测肿瘤细胞迁移和侵袭能力的变化;蛋白质印迹法检查干扰前后TBX4及细胞增殖和转移相关基因CDKN2A、MTA2和MTSS1的表达。结果:RNA干扰TBX4后H460细胞增殖活性显著降低;RNA干扰TBX4组迁移和侵袭细胞数较对照组减少,但差异无统计学意义;TBX4表达下调后抑癌基因CDKN2A表达上调,但转移相关基因MTA2和MTSS1表达无明显变化。结论:TBX4对肿瘤细胞的恶性生物学行为可能具有促进作用,其机制有待进一步研究。     

RNA干扰Nodal基因对胃癌细胞凋亡及血管生成的影响

目的构建并鉴定Nodal基因的RNA慢病毒表达载体,探讨Nodal基因对胃癌及血管生成的作用。方法针对Nodal mRNA设计siRNA,构建慢病毒质粒,测序鉴定质粒构建成功。将构建的慢病毒质粒及包装质粒共转染293T细胞,鉴定慢病毒包装成功,并测定其滴度。将慢病毒转染人胃腺癌细胞株MKN-45,通过qPCR检测Nodal基因表达。流式细胞仪检测细胞凋亡。Cellomics仪观察人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管生成。结果通过测序显示,插入Nodal基因RNAi序列正确。包装后测定病毒滴度达(5.0×10~8)TU/ml,qPCR检测提示RNA干扰病毒转染MKN-45细胞株后,Nodal基因表达水平显著下降。干扰后胃癌细胞凋亡率明显上升(P<0.05),干扰Nodal基因对血管生成无显著影响(P>0.05)。结论成功构建了人Nodal基因的RNAi慢病毒表达系统。干扰Nodal基因显著增加胃癌细胞凋亡。     

Caveolin-1RNA干扰真核表达载体的构建及其对人类胃癌细胞生物学行为的影响

 目的　构建针对Caveolin-1（CAV1）基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体psilence 4.1-CMV-neo-CAV1并转染胃癌细胞株SGC7901,探讨siRNA抑制CAV1表达对人类胃癌细胞株SGC7901生物学行为的影响。方法　根据 GeneBank提供的CAV1基因核苷酸序列,设计并化学合成3对双链siRNA,瞬时转染胃癌细胞株SGC7901,通过半定量RT-PCR检测各转染细胞CAV1表达,筛选一个有效的siRNA序列。设计并合成能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA序列,构建CAV1基因的RNA干扰真核表达载体,稳定转染胃癌细胞株SGC7901, RT-PCR法鉴定SGC7901细胞中CAV1基因的表达,通过细胞生长曲线、克隆形成实验及流式细胞术检测抑制CAV1的表达对胃癌细胞生长增殖的影响。结果　成功构建CAV1 RNA干扰真核表达载体psilence4.1-CMV-neo-CAV1,稳定转染靶细胞后显著降低CAV1的表达,与转染空载体组比较,增生指数及集落形成率增高,差异有统计学意义（分别为t＝7.98,P＜0.05;t＝13.19,P＜0.01）,生长速度亦增快。结论　RNA干扰胃癌细胞CAV1的表达促进了胃癌细胞生长增殖能力。     

RNA干扰技术沉默Smad4基因表达对ECV304细胞增殖和迁移的影响

目的：探讨利用RNA干扰技术下调Smad4基因表达对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移能力的影响，初步了解Smad4在血管生成中的作用。方法：设计并合成靶向人Smad4基因的小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）片段siRNA1和siRNA2，脂质体介导转染入人脐静脉内皮细胞株ECV304。应用实时定量RT-PCR和Western印迹法检测转染前后Smad4基因表达水平；应用细胞周期分析和羧乙基锗倍半氧化物（6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）－流式细胞仪检测ECV304细胞转染前后细胞增殖能力的变化；通过单层细胞划痕实验观察细胞转染前后迁移能力的变化。结果：从2条siRNA中成功筛选出1条siRNA，于RNA和蛋白水平可明显下调Smad4基因的表达；ECV304细胞转染Smad4的siRNA后，细胞的增殖和迂移能力明显增强。结论：利用RNA干扰技术能够筛选出高效的特异阻断Smad4基因表达的siRNA；Smad4基因表达下调能够明显促进血管内皮细胞的增殖和迁移。     

X线照射联合RNA干扰STAT3基因对人食管癌细胞增殖、凋亡的影响

背景与目的：STAT3是近期研究较多的一类癌基因,在多种实体瘤如头颈部鳞癌、食管癌、前列腺癌等中均有异常表达和活性增强。本研究探讨X线照射联合RNA干扰STAT3基因对人食管癌Eca-109细胞增殖、凋亡的影响。方法：针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA（siRNA）的DNA模板,构建pRNAT-U6.1-siRNA-STAT3重组质粒,转染Eca-109细胞,G418筛选获得阳性克隆,分别用RT-PCR和Western blot方法检测细胞STAT3 mRNA和蛋白表达。转染细胞分别接受0、2、4、6和8GyX线照射,平板克隆形成实验检测细胞存活分数,流式细胞仪检测4GyX线照射的细胞凋亡。结果：成功构建了pRNAT-U6.1-siRNA-STAT3重组质粒,经测序鉴定正确;RT-PCR和Western blot检测显示,STAT3-siRNA有效地抑制了肿瘤细胞STAT3 mRNA和蛋白表达;平板克隆形成实验和流式细胞仪分析表明,不同剂量X线照射联合STAT3-siRNA可抑制肿瘤细胞增殖,4GyX线照射可诱导肿瘤细胞凋亡。结论：X线照射联合RNA干扰STAT3基因表达可抑制人食管癌Eca-109细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

RNA干扰抑制RPS12基因表达对胃癌细胞凋亡的影响及分子机制探讨

目的: 探讨RPS12基因特异的RNA干扰对胃癌BGC823细胞凋亡的影响及机制。 方法: 设计并构建RPS12特异性shRNA表达载体(RPS12-shRNA),以Lipofectamine2000介导将RPS12特异性shRNA及Scram-ble-shRNA表达载体分别转染胃癌细胞。RT-PCR方法检测BGC823细胞中RPS12基因及凋亡相关基因Bcl-2和Bax mRNA的表达,流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析RNA干扰对细胞凋亡的影响。 结果: RT-PCR结果显示,RPS12-shRNA表达载体转染第3、5、7天后,RPS12基因表达低于对照组,其中第5天下调最明显。RPS12特异性RNA干扰第5天、第7天后,Bcl-2 mRNA表达明显下调,BaxmRNA表达无明显改变。流式细胞术分析结果显示,RNA干扰RPS12基因第7天后,胃癌细胞凋亡率(17.84%)明显高于对照组(1.89%)。 结论: RNA干扰RPS12基因促进胃癌细胞凋亡作用可能是其作为上游基因通过下调Bcl-2基因表达而实现的。     

Chk1/2基因沉默对人胃癌MGC803细胞增殖及周期的影响

目的:观察Chk1/2基因沉默对人胃癌MGC803细胞增殖及周期的影响.方法:采用RNAi技术在MGC803细胞中分别将Chk1和Chk2基因沉默,运用蛋白质印变法验证,然后采用MTT实验、流式细胞术分析Chk1和Chk2基因沉默对人胃癌MGC803细胞增殖及周期的影响.结果:蛋白质印迹法结果显示,转染靶向Chk1和Chk2 siRNA 24 h的Chk1、Chk2蛋白相对灰度值分别为0.09±0.04和0.12±0.01,明显弱于未转染对照组(0.39±0.09)和脂质体转染组(0.38±0.17),P均<0.05,而未转染对照组和脂质体转染组之间比较差异无统计学意义,P=0.458.转染Chk1、Chk2 siRNA的MGC803细胞Chk1和Chk2蛋白表达分别下降85.0%和83.4%.MTT实验证明,Chk1蛋白表达缺失导致MGC803细胞增殖活性下降,其增殖抑制率为38.0%(t=26.797,P<0.05);Chk2蛋白表达缺失对细胞增殖无明显抑制作用(t=6.098,P>0.05).Chk1基因沉默后细胞周期在G0/G1期发生停滞,但并不引发凋亡,而Chk2基因沉默后对细胞周期影响不明显.结论:Chk1基因沉默可明显抑制人胃癌细胞增殖,且其抑制增殖作用与诱导G0/G1期阻滞有关.     

应用可调控Notch1干扰载体诱导HeLa细胞增殖抑制

背景与目的:Notch信号转导途径与细胞增殖与分化的调控密切相关,它的功能失调在肿瘤细胞的增殖分化中发挥着重要的作用.本研究构建了针对Notch1的可调控RNA干扰载体,并从分子水平及细胞水平上研究其对HeLa细胞的影响.方法:利用受CRE重组调控的RNA干扰载体pSico和pSicoR构建针对GAPDH和Notch1的shRNA表达载体,以pBS185-CRE作为CRE蛋白的表达载体,将HeLa细胞分为pSico、pSico/CRE、pSicoR和pSicoR/CRE 4组,分别转染相应质粒,RT-PCR和Western blot法检测干扰效率,CBF-1荧光素酶报告载体检测细胞内活性Notch信号水平,MTS实验检测细胞增殖状态.结果:各组细胞在转染重组质粒pSico(R)-GAPDH和pSico(R)-Notch1后,EGFP的表达均表现出明显的CRE依赖性;RT-PCR和Western blot实验显示,pSico(R)-Notch1载体能在CRE蛋白的调控下抑制Notch1基因的表达,CBF-1荧光素酶报告载体实验可见,Notch1的干扰作用使细胞内Notch信号水平下降;MTS实验可见Notch1干扰引起的HeLa细胞增殖抑制.结论:由可调控RNA干扰载体介导的CRE依赖性Notch1表达降低能降低细胞内Notch信号水平并抑制HeLa细胞增殖.     

小干扰RNA靶向MIF对胃癌细胞SGC 7901增殖和凋亡的影响#br#

目的探讨靶向巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的小干扰RNA（siRNA）对胃癌细胞SGC 7901增殖和凋亡的影响。 方法取对数生长期的SGC 7901细胞,采用脂质体法分别转染靶向人MIF的siRNA（siMIF组）或阴性对照序列（NC组）,48 h后采用Western blotting检测MIF蛋白的表达情况,MTT法观察转染后24、48、72 h的细胞增殖情况,流式细胞仪检测转染后72 h的细胞凋亡率,Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl 2和Bax的表达变化。 结果siMIF组转染48 h后的MIF相对表达量为0321±0104,低于NC组的1078±0212,差异有统计学意义（P＜005）。siMIF组转染48～72 h后的细胞增殖率低于NC组,差异有统计学意义（P＜005）。转染MIF siRNA 72 h后,siMIF组的细胞凋亡率为（235±36）％,高于NC组的（47±17）％,差异有统计学意义（P＜005）。siMIF组Bcl 2的相对表达量为0663±0209,低于NC组的1129±0178,而Bax相对表达量为0981±0225,高于NC组的0587±0254,以上差异均有统计学意义（P＜005）。 结论siRNA靶向沉默MIF能够降低SGC 7901细胞中MIF蛋白表达,抑制SGC 7901细胞的增殖并促进凋亡,在胃癌的靶向治疗中有一定前景。     

HER2基因沉默抑制人胃癌细胞SGC-7901的生长和侵袭

目的：探讨针对HER2基因的RNA干涉对人胃癌细胞生长和侵袭的影响。方法：构建了针对癌基因HER2的siRNA表达载体,分别命名为pcDNA3-sihe1和pcDNA3-sihe2,将构建的干涉载体与对照载体转染胃癌SGC-7901细胞,通过间接免疫荧光实验确定干涉效果;以软琼脂集落形成实验检测干涉后细胞的集落形成能力,以流式细胞术检测细胞在悬浮培养条件下的凋亡情况;并以Boyden chamber法检测转染后细胞的侵袭能力。结果：成功构建针对癌基因HER2的siRNA表达载体,siRNA表达载体转染SGC-7901细胞后HER2表达水平明显降低,证实siRNA成功抑制HER2蛋白的表达。HER2低表达的细胞株集落形成能力降低,流式细胞术检测发现HER2下调可引起胃癌细胞的凋亡,Boydenchamber实验表明针对HER2的RNA干涉可抑制胃癌细胞SGC-7901的侵袭能力。结论：RNA干涉有效地抑制了HER2分子的表达,进而影响SGC-7901细胞的生长和侵袭,本实验为进一步研究HER2分子与肿瘤细胞生长和转移的关系奠定了基础。     

siRNA沉默hTERT基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的应用小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT的表达，探讨其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的效应。方法体外化学合成针对hTERT基因的siRNA序列，在脂质体介导下转染MCF-7细胞，实时定量PCR检测hTERTmRNA表达水平，Westernblot检测hTERT蛋白表达水平，流式细胞仪检测细胞凋亡状况，MTT法检测细胞增殖活性，平板克隆形成实验检测克隆形成率。结果所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比均可有效抑制hTERT的表达，hTERTsiRNA转染MCF-7细胞48h后，siRNAl-siRNA3组hTERTmRNA表达分别为（35．3±4．2）％、（30．7±2．8）％、（31．3±3．6）％，与阴性对照组（96．4±2．8％）相比，差异有统计学意义。MTT结果显示MCF-7细胞增殖能力显著降低，转染48h后，siRNAl～siRNA4细胞抑制率分别为（57．6±3．6）％、（61．3±4．3）％、（65．6±6．3）％和（3．1±4．5）％，细胞克隆形成能力下降，凋亡率明显增加。结论体外化学合成的hTERTsiRNA可以有效地抑制MCF-7细胞hTERT的表达，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。     

MicroRNA-21靶向PDCD4对胃癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨MicroRNA-21对胃癌细胞中PDCD4表达、细胞增殖与凋亡的影响。方法将MGC-803人胃癌细胞分为5组,分别为空白对照组(不转染)、阴性对照组(转染不相关siRNA)、mir 21组(转染miRNA-21质粒)、mir 21 Inhibitor组(转染miRNA-21抑制物)、PDCD4 siRNA组(转染PDCD4 siRNA)。分别于转染后36、48、72小时收集细胞,采用实时定量PCR及细胞爬片免疫组织化学检测细胞中PDCD4基因及蛋白水平,运用MTS法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果与空白、阴性对照组比较,mir 21组PDCD4表达量下降,细胞增殖能力增强(均P<0.05);mir 21 Inhibitor组PDCD4表达量增多(P<0.05),细胞增殖受到抑制(P<0.01),细胞总凋亡比例增高(P<0.05);PDCD4 siRNA组PDCD4表达几乎完全被抑制,细胞增殖能力增强(均P<0.01),36小时时细胞总凋亡比例减少(P<0.05)。而阴性和空白对照组比较,细胞PDCD4表达量、细胞增殖与凋亡都无明显差异(P>0.05)。结论 MicroRNA-21能靶向调控PDCD4,抑制胃癌细胞MicroRNA-21的表达后可上调PDCD4表达,发挥抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡的作用。     

VEGFR-3 siRNA腺病毒载体对结肠癌细胞增殖和迁移影响研究

目的 探讨血管内皮生长因子受体-3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3)siRNA腺病毒载体对结肠癌细胞增殖和迁移的影响.方法 将VEGFR-3 siRNA腺病毒转染结肠癌LoVo细胞,采用qRT-PCR测定各组结肠癌LoVo细胞VEGFR-3 mRNA的表达,蛋白质印迹法检测各组细胞VEGFR-3蛋白的表达,MTT比色法测定各组细胞增殖状况,划痕实验检测LoVo细胞的迁移能力.结果 空白对照组VEGFR-3 mRNA表达量为0.94±0.12,阴性对照组为0.97±0.14,实验组为0.13±0.19,实验组VEGFR-3 mRNA的表达水平明显降低,F=65.389,P＜0.001.蛋白质印迹法检测结果表明,实验组VEGFR-3蛋白的表达量为0.12±0.14,空白对照组为0.94±0.15,阴性对照组为0.97±0.16,实验组VEGFR-3蛋白的表达水平明显下降,F=68.050,P＜0.001.空白对照组LoVo细胞增殖活性为0.89±0.03,阴性对照组为0.87±0.05,实验组为0.52±0.06,实验组增殖明显抑制,F=80.135,P＜0.001.实验组LoVo细胞相对迁移率为(25.26±1.52)％,空白对照组为(68.24±1.51)％,阴性对照组为(65.18±1.73)％,实验组细胞迁移距离明显缩短,F=63.809,P＜0.001.结论 腺病毒介导的VEGFR-3 siRNA可以通过下调结肠癌细胞VEGFR-3的表达从而抑制结肠癌细胞的增殖和迁移能力.     

RNAi在胃癌基因治疗中的研究

RNA干扰(RNAi)又称转录后基因沉默,是由外源或内源性的双链RNA(dsRNA)导入细胞而引起同源的mRNA降解,进而抑制其相应的基因表达。作为一项新技术,目前广泛地应用于生物体基因功能研究和多种肿瘤的研究。在胃癌方面,现针对胃癌相关基因治疗进行了积极的探索,并取得了一些突破性的进展。     

RNAi在胃癌基因治疗中的研究

RNA干扰（RNAi）又称转录后基因沉默,是由外源或内源性的双链RNA（dsRNA）导入细胞而引起同源的mRNA降解,进而抑制其相应的基因表达。作为一项新技术,目前广泛地应用于生物体基因功能研究和多种肿瘤的研究。在胃癌方面,现针对胃癌相关基因治疗进行了积极的探索,并取得了一些突破性的进展。