PCR-SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

目的　应用PCRSSCP技术快速检测耐INH,RFP,SM结核分支杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32株耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及25株结核分支杆菌敏感分离株用PCRSSCP方法分别检测,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中,rpoB、KatG、rpsL PCR扩增产物PCR-SSCP分别有28株(87.5%)rpoB基因,19株(59.3%)KatG基因和23株(71.9%)rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H₃₇Rv电泳条带相比有明显差异,而25株结核分支杆菌敏感株的PCR-SSCP条带与结核分支杆菌H₃₇Rv相似,特异性为100%。结论 PCR-SSCP方法敏感、特异,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变,有利于耐多药结核分支杆菌耐药性的快速检测。     

聚合酶链反应—单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

应用PCR-SSCP技术快速检测耐INH,RFP,SM结核分支杆菌分离株rpoB、KatG、rpsL基因突变,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32侏耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及25侏结核分支杆菌敏感分离株用PCR-SSCP方法分别检测,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中,rpoB、KatG、rpsL PCR扩增产物PCR-SSCP分别有28株（87.5%)rpoB基因,19株（59.3%)KatG基因和23株（71.9%)rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H37Rv电泳条带相比有明显差异,而25株结核分支杆菌敏感株的PCR-SSCP条带与结核分支杆菌H37Rv相似,特异性为100%。结论 PCR-SSCP方法敏感、特异,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变,有利于耐多药结核分支杆菌耐药性的快速检测。     

应用PCR-SSCP技术检测痰中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变的研究

目的应用PCR-SSCP技术检测痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变,探索其临床应用价值。方法以结核分枝杆菌标准株H₃₇R_V为对照,应用套式PCR扩增目的基因,并使用SSCP技术直接检测100例耐药患者和10例敏感患者痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变并进行基因测序,将SSCP结果及测序结果与细菌培养药敏结果进行比较分析。结果PCR-SSCP直接检测痰样本中的结核分枝杆菌katG基因突变的敏感性和特异性分别是55.9%和70.0%,rpoB为76.0%和90.0%,embB为46.4%和60.0%。结论PCR-SSCP操作快速、简单,敏感性和特异性较高,可用来直接检测临床痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变。     

套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测

目的应用套式PCR-DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法,并评价其临床应用价值。方法采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色,罗氏培养及菌型鉴定。结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性,产物DNA测序31例有rpoB基因突变,其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变,耐药突变率90.6%(29/32),39例菌阴(涂阴培阴)痰中有2例发生突变。分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变,20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性,特异性100%。结论套式PCR-DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。     

应用PCR-SSCP技术检测痰中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术检测痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变,探索其临床应用价值.方法 以结核分枝杆菌标准株H37Rv为对照,应用套式PCR扩增目的基因,并使用SSCP技术直接检测100例耐药患者和10例敏感患者痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变并进行基因测序,将SSCP结果及测序结果与细菌培养药敏结果进行比较分析.结果 PCR-SSCP直接检测痰样本中的结核分枝杆菌katG基因突变的敏感性和特异性分别是55.9%和70.0%,rpoB为76.0%和90.0%,embB为46.4%和60.0%.结论 PCR-SSCP操作快速、简单,敏感性和特异性较高,可用来直接检测临床痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变.     

三种结核分支杆菌耐药基因的检测方法

目的　建立3种结核分支杆菌耐药基因的检测方法,了解耐药基因突变和耐药水平的关系。方法 108例临床痰标本分离株均做聚合酶链反应-单链构象多态性 (PCR-SSCP)和传统梯度药敏试验。结果 耐SM (rpsL)、RFP (rpoB)、INH (KatG)基因突变率分别为78.5%,68.2%,70.5%,其中,高耐SM,RFP,INH分离株分别为86.5%,89.3%,84.3%;低耐分离株分别为28.5%,16.5%,7.1%。结论 结核分支杆菌耐药基因突变与耐药水平有密切联系,绝大多数结核分支杆菌耐药基因突变发生在高耐药株,少部分在低耐药株发生基因突变。     

应用基因阵列法快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的　研制一种新型的基因阵列 ,用于结核分枝杆菌耐利福平分离株rpoB基因突变的快速检测。方法　根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计寡核苷酸探针并制作基因阵列 ,用生物素标记的引物扩增结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的目的片断 ,与基因阵列杂交 ,同时以聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术及DNA测序法为对照。结果　 111株结核分枝杆菌临床分离株经PCR SSCP分析 ,4 1株RFP敏感株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同 ;70株耐RFP菌株中 ,6 3株(90 % )SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株不同 ,其余 7株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同。基因阵列检测结果 4 1株RFP敏感株杂交图谱与标准株完全相同 ,70株耐RFP临床分离株中 ,6 3株检测到rpoB基因突变 ,检出率为 90 % ;其中 37株 (5 3% ) 5 31位丝氨酸 (Ser)置换 ,15株 (2 1% ) 5 2 6位组氨酸(His)置换 ,11株 (16 % )其他位置的氨基酸置换。基因阵列检测结果与PCR SSCP及测序结果一致。结论　用基因阵列法可简便、快速、准确地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变。     

套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测

目的应用套式PCR—DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变，以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法，并评价其临床应用价值。方法采用套武PCR—DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰、标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色，罗氏培养及菌型鉴定。结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性，产物DNA测序31例有rpoB基因突变。其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变，耐药突变率90．6％（29／32），39例菌阴（涂阴培阴）痰中有2例发生突变。分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变，20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性，特异性100％。结论套式PCR—DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区(Rifampicin Resistance Determining Region,RRDR)526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针(526CAC,526TAC,531TCG和531TTG),应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而,应用该技术检测84份肺结核病例痰标本,与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较,部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中,其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100%。在84份肺结核病例的痰标本中,罗氏培养阳性62株,其中利福平耐药株48份,荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到531密码子TTG突变65例,526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中,荧光定量PCR检测43株为531TTG突变,3株为526TAC突变,另2株利福平耐药株,经测序证实,1株514密码子TTC插入突变,1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变,并能作为临床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。     

DNA序列分析与PCR-SSCP分析结核分支杆菌利福平敏感性的比较

目的　了解DNA序列分析与PCR-SSCP法分析利福平敏感性的价值。方法 应用DNA序列分析与PCR-SSCP法检测利福平敏感的结核分支杆菌临床分离株 25株、耐药株 41株的利福平耐药相关基因rpoB基因核心区域的突变情况。 结果 25株利福平敏感株DNA序列分析未检测到rpoB基因突变,41株耐利福平株中 38株发生突变,突变率为 92.7% (38/41);25株利福平敏感的结核分支杆菌菌株PCR-SSCP带型与对照H₃₇R_v株相同,41株耐利福平结核分支杆菌菌株中38株SSCP带型不同于对照株,提示有突变存在。与DNA序列分析相比,PCR-SSCP检测准确率为 93.9% (62/66),敏感度为 92.1% (35/38);特异度是 96.4% (27/28)。结论 DNA序列分析对判断结核分支杆菌耐利福平非常有价值;PCR-SSCP可用于利福平耐药结核分支杆菌的初步筛选。     

等位基因特异性多重聚合酶链反应方法用于快速检测结核分枝杆菌利福平耐药株

目的建立检测耐利福平(RFP)结核分枝杆菌的等位基因特异性多重聚合酶链反应(multiplex allele specific polymerase chain reaction,MAS-PCR)方法,快速、特异地检测rpoB基因核心突变区的主要突变,用于快速诊断结核分枝杆菌对利福平的耐药性。方法根据结核分枝杆菌的rpoB序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用MAS-PCR技术,分别检测rpoB基因上531、526、516这3个最常见的突变位点的突变。结果对临床分离的利福平敏感株(15株)及利福平突变株(81株)进行检测,以直接测序结果为参照,对利福平耐药株的总检出率为81.5%(66/81)。结论MAS-PCR方法敏感、特异,可快速、简便地检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,有利于耐药结核分枝杆菌的快速检测。     

目标管理在提高初治肺结核患者痰标本留取质量上的价值

目的 探讨目标管理在初治肺结核患者痰标本留取质量控制中的应用效果。方法 收集2017年7—12月在上海市肺科医院结核科因疑似肺结核住院后确诊并接受治疗的338例初治肺结核患者作为研究对象。将入住结核科一病区的173例患者作为对照组,入住结核科五病区的165例患者作为观察组。对照组采取结核科常规护理管理及痰标本留取宣传教育,同时对患者痰标本留取及规范送检等情况进行督导检查;观察组在采取常规护理管理措施的基础上对患者痰标本的留取实施目标管理,即医生、护士和患者共同参与并确定痰标本留取的总目标,并将总目标分解成分目标,通过分目标的设定、目标实施、信息反馈处理、检查实施结果最终达到总目标。对两组患者住院期间痰标本留取的完成情况、合格情况及痰细菌学检测阳性情况进行比较。结果 观察组患者住院期间应留取痰标本502份,实际留取476份,合格432份,痰细菌学检测阳性312份;对照组患者住院期间应留取痰标本524份,实际留取431份,合格307份,痰细菌学检测阳性172份。观察组痰标本留取的完成率为94.82%(476/502),合格率为90.76%(432/476),痰细菌学检测阳性率为72.22%(312/432),均明显高于对照组的82.25%(431/524)、71.23%(307/431)、56.03%(172/307),两组比较差异均有统计学意义(χ ²值分别为39.50、57.15、20.83,P值均<0.01)。结论 目标管理能提高患者痰标本留取的主动性,提高痰标本留取的质量及痰细菌学检测的阳性率,有利于疑似肺结核患者尽早明确诊断。     

BACTEC MGIT 960和BACT/ALERT 3D系统快速培养和鉴定痰中抗酸杆菌

目的对抗酸染色阳性痰行分枝杆菌培养和鉴定。方法采用萋一尼氏抗酸染色法对临床诊断肺结核患者的晨痰涂片直接镜检,抗酸染色阳性痰经BACTEC960和BACT/ALERT3D系统进行分枝杆菌培养,分别经对硝基苯甲酸（PNB）和噻吩-2-羧基肼（TCH）培养基生长试验行分枝杆菌菌群和结核分枝杆菌复合群菌种鉴定。结果抗酸染色阳性痰标本的分枝杆菌培养阳性率100％,大多数为结核分枝杆菌（9／10）,少数为非结核分枝杆菌（1／10）,最快6天即可报告分枝杆菌阳性培养。结论BACTEC 960和BACT／ALERT3D系统具有快速培养分枝杆菌作用,抗酸染色阳性痰有必要行分枝杆菌培养和鉴定,有利于肺结核与非结核分枝杆菌病的鉴别诊断、结核分枝杆菌菌种鉴定和抗结核药物敏感性试验。     

康乐霉素A体外抗结核活性的初步研究

目的发现新安莎类抗生素,康乐霉素A体外抗结核活性。方法应用色谱技术从地中海诺卡氏菌康乐变株1747-64发酵液中分离康乐霉素A,并采用试管二倍稀释法,进行康乐霉素A对耻垢分枝杆菌（ATCC14468）,结核分枝杆菌H₃₇Rv（ATCC27294）,H₃₇Ra（ATCC25177）,临床分离的氧氟沙星（OFLX）敏感结核分枝杆菌以及临床分离的耐氧氟沙星结核分枝杆菌最低抑制浓度（Minimal Inhibitor Concentration,MIC）的试验。结果康乐霉素A对耻垢分枝杆菌活性弱,MIC为64μg/ml,对结核分枝杆菌H₃₇Rv,H₃₇Ra的MIC为8μg/ml,对临床分离的氧氟沙星敏感结核分枝杆菌菌株的MIC范围为18μg/ml,临床分离的耐氧氟沙星结核分枝杆菌菌株的MIC范围为116μg/ml。结论新安莎类抗生素,康乐霉素A体外具有明显的抗结核活性,有望成为新抗结核药物或先导化合物。     

177例复治肺结核使用标准复治方案的疗效分析

目的 对标准复治方案治疗北京市复治肺结核患者的疗效进行评价。 方法 采用回顾性调查方法,对2009-2010年全市登记管理的复治菌阳肺结核患者,根据药敏试验结果将其分为利福平敏感组（138例）和利福平耐药组（39例）,每组又分为异烟肼敏感组和异烟肼耐药组,其中异烟肼、利福平均敏感组114例,异烟肼耐药、利福平敏感组24例,异烟肼敏感、利福平耐药组12例,异烟肼、利福平均耐药组27例,对其使用2HRZE（S）/6HRE标准复治化疗方案的疗效进行回顾性分析。 结果 异烟肼敏感组与异烟肼耐药组比较,痰菌阴转率分别为92.9%（117/126）、66.7%（34/51）,治疗成功率分别为87.3%（110/126）、60.8%（31/51）。两组在痰菌阴转情况及治疗转归方面差异均无统计学意义（χ²_MH值分别为2.183、1.974,P_MH值均＞0.05）。利福平敏感组与利福平耐药组比较,痰菌阴转率分别为94.2%（130/138）、53.8%（21/39）,治疗成功率分别为88.4%（122/138）、48.7%（19/39）,两组在痰菌阴转情况及治疗转归等方面差异均有统计学意义（χ²_MH值分别为16.199、12.686,P_MH值均＜0.001）。 结论 利福平敏感的复治肺结核患者采用标准复治方案治疗,效果良好;对利福平耐药的复治肺结核患者采用标准复治方案治疗的合理性值得探讨,还需要进行更多的研究。     

结核分枝杆菌Km基因突变与耐卡那霉素药物的研究

目的　分析结核分枝杆菌(T.M)耐卡那霉素(KM)和(Km)基因突变情况。方法 通过传统梯度药敏试验和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析127株分枝杆菌临床分离株耐KM情况和Km基因的变化。结果 药敏试验卡那霉素耐药率为35.4%(45/127),127株分枝杆菌临床分离株的16S rDNA SSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同。45株耐卡那霉素分离株中,12株(26.6%)Km基因SSCP泳动异常。结论 T.M对抗结核二线药物中的KM药物已出现耐药,其部分耐药原因可能是由于T.M耐KM药物的Km基因突变所致。