转化生长因子β1对人肾小管上皮细胞表达桩蛋白的影响

目的探讨重组人类转化生长因子β1（rhTGF-β1）对人近端肾小管上皮细胞（HKC）桩蛋白（Pax）表达时相的影响。方法将体外培养的HKC随机分为4组。对照组（C组）：无血清培养基（FSM）培养;rhTGF-β1培养组（T1、T2、T3组）：分别用含10ng／ml TGF-β1的FSM培养,取不同时相点（T1组24h,T2组48h,T3组72h）终止培养。MTT法检测rhTGF-β1诱导HKC增殖的时效关系,RT-PCR检测HKC的Pax mRNA表达,免疫组化和Western blot检测Pax蛋白的表达。结果C组可检测到PaxmRNA和蛋白表达;Pax mRNA和蛋白表达T组明显高于C组,且T2、T3组明显高于T1组（P〈0．01）。结论TGF-β1诱导HKC合成Pax具有时间依赖性。     

激活素A刺激肾小管上皮细胞转分化的研究

目的研究激活素A对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化的影响。方法取人肾小管上皮细胞株进行体外培养,分为ACT—A组（含不同浓度激活素A）、FS组（含不同浓度卯泡抑素）、ACT—A＋Fs组（含30ng／mlACT＋不同浓度卵泡抑素）和对照组（含无血清培养基及0ng／mlACT—A和0ng／mlFS）,应用免疫组化法检测培养细胞转化生长因子β蛋白（TGF—β）的表达,以观察肾小管上皮细胞转分化的情况。结果与对照组和卵泡抑素组相比,激活素组。肾小管—巳皮细胞表达的TGF-β蛋白显著增多（P〈0．05）。结论激活素A能促进肾小管上皮细胞增殖、转分化,激活素A可能在肾小管问质纤维化中起重要作用。     

成纤维细胞生长因子对关节软骨细胞转化生长因子β1作用的免疫组织化学观察

目的观察成纤维细胞生长因子对培养兔关节软骨细胞转化生长因子β１的表达。方法培养１月龄新西兰兔关节软骨细胞，在每次换液时加入成纤维细胞生长因子１００ｎｇ／ｍｌ，铺满后收集细胞，作关节软骨细胞转化生长因子β１常规及电镜免疫组织化学观察。结果光镜下实验组细胞明显呈棕色，电镜下细胞膜表面有明显的胶金颗粒黏附。结论成纤维细胞生长因子能促进关节软骨细胞转化生长因子β１的表达。     

激活素A刺激肾小管上皮细胞转分化的研究

目的研究激活素A对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化的影响。方法取人肾小管上皮细胞株进行体外培养,分别向培养液中加入激活素A或激活素A＋卵泡抑素,应用免疫组化法检测培养细胞转化生长因子β蛋白（TGF-β）的表达,以观察肾小管上皮细胞转分化的情况。结果与对照组和卵泡抑素组相比,激活素组肾小管上皮细胞表达的TGF—β蛋白显著增多。结论激活素A能促进肾小管上皮细胞增殖、转分化,提示激活素A可能在肾小管间质纤维化中起重要作用。     

转化生长因子-β1Ⅱ型受体同源序列1对瘢痕疙瘩中成纤维细胞胶原合成的影响

目的　初步探讨转化生长因子 - β1(TGF - β1)Ⅱ型受体同源序列 1(TRH1)的生物学功能。　方法　根据已知序列合成TRH1多肽 ,以瘢痕疙瘩成纤维细胞为靶细胞 ,分别于蛋白水平和mRNA水平检测该多肽对TGF - β1所诱导的细胞胶原合成的拮抗作用。　 结果　TRH1可以明显抑制TGF - β1所诱导的瘢痕疙瘩成纤维细胞的胶原合成及细胞Ⅰ型前胶原mRNA的表达。结论　TRH1可能通过模拟TGF - β1Ⅱ型受体的结构来竞争性结合TGF - β1,从而拮抗或降低了TGF -β1对细胞的诱导作用。     

酸性成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子在肝干细胞分化成熟中的作用

目的　初步探讨了酸性成纤维细胞生长因子 (aFGF)及肝细胞生长因子 (HGF)对大鼠胎肝干细胞分化成熟的影响。方法　采用胶原酶消化法分离胎龄 13d的SD大鼠胎肝细胞 ,分别接种于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组细胞培养瓶中进行体外培养。Ⅰ组 :培养液中含酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和肝细胞生长因子 (HGF) ;Ⅱ组 :培养液中含aFGF ;Ⅲ组 :培养液中含HGF ;Ⅳ组培养液中无细胞因子 ,此组作为对照组。检测在相同培养时间 (第 3、5、7、9、11天 )细胞培养上清液中甲胎蛋白(AFP)和白蛋白 (ALB)的含量 ;并用免疫细胞化学法鉴定在无细胞因子干预培养 3d后 ,胎肝干细胞对细胞角质素 19(CK 19)的表达。结果　Ⅰ组、Ⅱ组及Ⅲ组分别与Ⅳ组比较 ,在相同培养时间的培养上清液中AFP的含量均较少 ,而ALB的含量均较多 ,且差异均有显著性意义 (AFP :t=6 2 6 4 ,3 2 2 1,2 5 91,P <0 0 5 ;ALB :t=6 32 4 ,2 14 5 ,2 95 4 ,P <0 0 5 ) ;Ⅱ组和Ⅲ组相同培养时间的培养上清液中AFP及ALB的含量差异均无显著性意义 (AFP :t =0 5 0 1,P >0 0 5 ;ALB :t =0 6 16 ,P >0 0 5 ) ;而Ⅳ组分别与Ⅱ组和Ⅲ组比较 ,在相同培养时间的培养上清液中ALB的含量均较少 ,而AFP的含量均较多 ,差异也均有显著性意义 (AFP :t =3 2 2 1,2 5 91,P <0     

RNA干扰阻滞胸腺素β4表达对TGF-β1诱导人肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化的抑制作用

目的 探讨RNA干扰阻滞胸腺素β1表达对TGF-β1诱导人肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化(EMT)的抑制作用.方法 构建能表达针对胸腺素β1的小干扰RNA(siRNA)的重组腺病毒载体,以及表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照载体,分别感染人肾小管上皮细胞株(HKC),得到胸腺素β1表达受抑制的HKC-siTβ4和胸腺素β4表达未受影响的HKC-siC.根据用TGF-β1处理HKC、HKC-siTβ4和HKC-siC的情况,将培养的细胞分为4组:正常HKC组(C组),TGF-β1处理HKC组(T C组),TGF-β1处理HKC-siTβ1组(T siTβ1组)和TGF-β1处理HKC-sic组(T siC组).48h后,分别采用RT-PCR和Western blotting检测各组胸腺素β1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏素表达,并分析胸腺素β1和α-SMA表达量的相关性.结果 C组胸腺素β4表达弱阳性,α-SMA表达阴性,E-钙黏素表达强阳性;T C组胸腺素β1和α-SMA表达强阳性,E_钙黏素表达较C组减弱(P＜0.01);T siTβ1组胸腺素β1和α-SMA表达弱阳性,表达量显著低于T C组(P＜0.01),E-钙黏素显著高于T C组(P＜0.01);T siC组胸腺素β1、α-SMA和E-钙黏素表达与T C组相比均无显著差异(P＞0.05).胸腺素β4和α-SMA表达呈显著正相关.结论 RNAi阻滞胸腺素β4表达能有效地抑制TGF-β1诱导EMT,提示胸腺素β4是介导TGF-β1诱导EMT的重要分子.     

肝细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子对血管壁细胞增殖的影响

观察肝细胞生长因子 (HGF)及血管内皮细胞生长因子 (VEGF)对牛冠状动脉血管内皮细胞 (BCAEC)和平滑肌细胞(BCASMC)增殖的影响。分离和培养BCAEC、BCASMC ,VEGF组和HGF组细胞培养液分别含VEGF 5 0ng/ml和HGF 5 0ng/ml,采用四甲基偶氮唑蓝法观察细胞的增殖。结果显示 ,对照组、HGF组和VEGF组BCAEC的OD值分别为 0 2 3± 0 0 2、0 5 8± 0 10和 0 4 2± 0 12 ;BCASMC的OD值分别为 0 31± 0 0 8、0 4 5± 0 0 9和 0 4 0± 0 11;HGF对BCAEC、BCASMC的增殖率分别为 15 2 2 %± 33 8%、45 2 %±2 5 3%,VEGF对BCAEC、BCASMC的增殖率分别为 82 6 %± 18 7%、2 9 0 %± 2 0 4 %。提示HGF对BCAEC、BCASMC的增殖均有促进作用 ;VEGF能促进BCAEC的增殖 ,而对BCASMC的增殖作用不明显。HGF对BCAEC的增殖作用强于对BCASMC的作用 ;HGF对BCAEC的增殖作用强于VEGF。     

微波辐照对兔晶体上皮细胞增殖和转化生长因子β表达的影响

目的观察微波辐射对兔晶体上皮细胞（ＲＬＥＣｓ）增殖和转化长生因子β（ＴＧＦ－β）表达的影响,探讨ＴＧＦ－β在微波白内障形成中的作用。方法原代培养ＲＬＥＣｓ并鉴定,应用平均功率密度８０ｍＷ／ｃｍ２的连续波辐照ＲＬＥＣｓ１５ｍｉｎ。测量培养液温度,并采用噻唑盐（ＭＴＴ）比色试验、免疫细胞化学法检测细胞活力和ＴＧＦ－β１表达的改变。结果ＲＬＥＣｓ在常规培养条件下可表达ＴＧＦ－β１,但较弱;本实验条件下,辐照前后培养液温度未见明显改变,辐照后ＴＧＦ－β１的表达显著增强,而细胞增殖能力却较对照组降低。结论低剂量微波暴露,可能导致ＴＧＦ－β１的过表达,并抑制晶体上皮细胞增殖活力,从而使晶体发生白内障样病理改变。推测ＴＧＦ－β１表达的增强和ＲＬＥＣｓ增殖能力的降低,是微波致白内障的可能机理。     

重组融合饰胶蛋白拮抗转化生长因子β1刺激 增生性瘢痕成纤维细胞增殖的作用

目的观察重组谷胱甘肽S-转移酶与饰胶蛋白的融合蛋白(GST-Decorin)对转化生长因子β1刺激增生性瘢痕成纤维细胞的作用,探索瘢痕治疗的新方法。方法采用RT-PCR技术克隆饰胶蛋白(Decorin)cDNA并连接到pGEX-4T-1载体上,大肠杆菌内表达GST-Decorin;体外分离培养增生性瘢痕成纤维细胞,加入1∶6.25,1∶12.50,1∶25.00,1∶50.00,1∶100.00稀释度的GST-Decorin,经四唑盐(MTT)比色法测定细胞增殖速度;进一步将2mg/L的TGF-β     

HGF和FGF4在诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化中的作用

目的 评估肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细胞生长因子4(FGF4)在诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化中的作用.方法 CCl_4经腹腔注射复制小鼠肝损伤模型,48h后处死小鼠取肝组织,分离肝脏组织制备肝损伤条件培养液进行培养.以正常小鼠肝组织制备的培养液作为对照组.ELISA法测定培养0、1、5、3、6、12、24、48h后肝组织培养液中的HGF和FGF4含量.用肝损伤条件培养液培养骨髓间充质干细胞,分别加入HGF抗体和(或)FGF4抗体,以封闭培养液中的HGF和(或)FGF4因子,未添加细胞因子抗体的培养液作为对照组;ELISA法检测肝细胞特异性白蛋白(ALB)水平,免疫荧光法检测细胞内ALB、甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白19(CK19)的表达,评价骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化状况.结果 与对照组比较,肝损伤小鼠肝细胞培养液中HGF和FGF4表达量均升高(P<0.05);在培养3h时HGF、FGF4上升达峰值,随后下降;FGF4在培养12h达低谷后再次升高.抑制HGF和(或)FGF4第14天后,ELISA和荧光标记染色法检测均显示ALB表达下降,与对照组比较差异显著(P<0.05);荧光标记染色显示封闭后AFP及CK-19表达均有下降(P<0.05).结论 HGF、FGF4是诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的重要因子,且可能有其他因子参与诱导肝细胞的定向分化.     

永生化人支气管上皮细胞中TGF-β1对MAPK家族ERK通路的活化效应

目的 研究转化生长因子-β1(TGF-β1)在永生化人支气管上皮细胞BEP2D信号转导中MAPK家族ERK通路的激活情况及其引起的细胞增殖、凋亡和形态学的改变.方法 用Western blot方法检测TGF-β1对ERK的活化特点;用荧光染料染色分析和流式细胞术检测TGF-β1引起ERK活化时细胞的凋亡变化;用细胞克隆形成率分析TGF-β1引起ERK活化时细胞的增殖情况;观察TGF-β1引起ERK活化时细胞的形态改变.结果 TGF-β1可在短时间内激活ERK1/2,1h达峰值,然后逐渐减弱;TGF-β1诱导BEP2D细胞凋亡,抑制其增殖,使其体积和间距增大;用U0126抑制ERK通路,能促进TGF-β1对细胞在凋亡、增殖方面的作用,但抑制其对细胞形态的影响.结论 TGF-β1诱导的ERK1/2的磷酸化在调节BEP2D细胞的增殖和凋亡间的平衡方面起着重要作用.     

人气道上皮细胞的体外原代培养研究

目的 探索简单有效的人原代气道上皮细胞培养方法 .方法 以人肺叶或肺段支气管为取材对象,用蛋白酶ⅩⅣ消化 机械刮刷法分离肺叶或肺段支气管上皮细胞,并与蛋白酶ⅩⅣ消化 机械剥离法、胰酶消化 机械刮刷法比较分离的细胞数、纯度及成活率,同时比较含必需营养因子的DMEM/F12无血清培养与有血清培养时的细胞纯度及成活率.角蛋白AE1/AE3免疫组化鉴定培养的细胞.结果 蛋白酶ⅩⅣ消化 机械刮刷法组分离的细胞数为(9.37±1.62)×105,而蛋白酶ⅩⅣ消化 机械剥离法组为(5.20±0.75)×105,二者比较差异显著(P＜0.01);蛋白酶ⅩⅣ消化 机械刮刷法组分离的细胞成活率及纯度均高于胰酶消化 机械刮刷法组(94.3% vs 85.7%,92.5% vs 83.0%,P＜0.05);无血清培养的成活率及纯度均高于有血清培养(90.7% vs 82.1%,95.5%vs 83.0%,P＜0.01);培养的细胞角蛋白AE1/AE3染色阳性.结论 蛋白酶ⅩⅣ消化 机械刮刷法分离肺叶或肺段支气管上皮细胞,并用含营养因子的DMEM/F12无血清培养是一种简单有效的人原代气道上皮细胞培养方法 .     

HGF非融合蛋白真核表达载体的构建及其在骨骼肌细胞中的表达

目的构建以HGF为目的基因、以EGFP为报告基因的非融合蛋白真核表达载体pCMV-HGF-IRES-EGFP,并观察HGF基因在原代培养的大鼠骨骼肌细胞中的表达。方法利用BamHI单酶切质粒pcDNA3-HGF,得到HGF基因片段,将其正向插入到真核表达载体pCMV-IRES-EGFP的CMV后方BamHI的单克隆位点。脂质体介导转染至原代培养的大鼠骨骼肌细胞,在荧光显微镜下观察EGFP的表达,并用ELISA法检测HGF的表达情况。结果构建了HGF的非融合蛋白真核表达载体pCMV-HGF-IRES-EGFP,转染原代培养的大鼠骨骼肌细胞24~72h后,见30%的细胞表达EGFP。ELISA检测细胞培养液证实转染后第1天即有HGF的表达,第4天HGF浓度为(5402.0±227.9)ng/L。结论成功构建了非融合蛋白真核表达载体pCMV-HGF-IRES-EGFP,其在原代培养的大鼠骨骼肌细胞中能有效表达。     

KGF对离体子宫内膜上皮细胞生长与分泌的影响

目的:观察KGF对离体培养的EEC生长和分泌CA125的影响。方法:体外培养增殖期EEC,加入不同浓度KGF作用后,MTT法检测OD值了解细胞生长情况,磁酶免法测定CA125分泌。结果:①不同浓度KGF对EEC的生长、分泌均有刺激作用,以50ng/ml作用最明显;②MTT法所测OD值与CA125浓度有显著的相关性。结论:KGF可促进体外培养的增殖期EEC生长和分泌,EEC分泌CA125的量与细胞生长有关。     

复方鳖甲软肝方药物血清干预TGF-β1对HSC增殖的影响

目的观察复方鳖甲软肝方(FFBJRGF)药物血清干预TGF-β1对离体肝星形细胞(HSC)增殖的影响作用.方法采用改进的中药血清药理学方法,在HSC的培养体系中添加外源性TGF-β1,运用MTT法检测TGF-β1对HSC增殖的影响,观测不同剂量复方鳖甲软肝方药物血清的干预TGF-β1对离体肝星形细胞(HSC)增殖的作用.结果添加外源性TGF-β1可减低HSC的增殖能力,但显效时间较长(72h);高、中、低剂量FFBJRGF药物血清组和IFN-γ血清组与正常对照HSC培养组比较,均明显HSC的增殖活性(各组OD值比较,分别P<0.05),且显效时间短于添加外源性TGF-β1组(24h).结论 FFBJRGF药物血清、IFN-γ血清和TGF-β1均具有减弱HSC增殖的作用,且FFBJRGF药物血清可在TGF-β1作用基础上发挥增效作用.     

凝血酶受体在衰老大鼠肾组织中的表达变化特点

目的检测衰老大鼠肾小球凝血酶受体与纤维蛋白的表达变化,明确凝血酶受体活化的意义。方法选用3月、12月与24月龄Wistar大鼠,采用改良的Lendrum纤维蛋白染色法与免疫荧光法检测纤维蛋白的沉积,免疫组化方法检测肾小球凝血酶受体PAR-1与转化生长因子13（TGF-β）在肾组织中的表达。半定量PCR法检测PAR-1 mRNA的表达。结果3月、12月与24月龄大鼠肾小球内均未检测到纤维蛋白的表达。PAR1在3月龄鼠肾小球内皮、系膜与上皮细胞中广泛表达;24月龄鼠肾小球内PAR-1的表达明显减少。PAR-1 mRNA和肾小球TGF13的表达随增龄明显增加。结论衰老大鼠肾小球凝血酶的活化不伴有纤维蛋白的形成,活化的凝血酶受体可能在衰老相关肾脏结构变化中发挥重要作用。     

Cyr61基因过表达对人肾小管上皮细胞表达细胞外基质成分的影响

目的观察Cyr61基因过表达对人肾小管上皮细胞(HKC)表达细胞外基质成分的影响,探讨Cyr61在常染色体显性多囊肾病(ADPKD)发病中的作用及机制。方法RT PCR扩增Cyr61全长基因,构建pcDNA3.1+Cyr61重组质粒,转染HKC细胞。经RT PCR、Westernblot鉴定转染细胞系Cyr61基因的整合及表达。荧光定量PCR检测空白HKC、空质粒pcDNA3.1转染的HKC、Cyr61转染的HKC和囊肿衬里上皮细胞内Cyr61、I型和Ⅳ型胶原、层黏连蛋白的基因表达。结果构建了pcDNA3.1+Cyr61重组质粒并转染HKC细胞。Cyr61基因转染组和囊肿衬里上皮细胞内Cyr61蛋白表达显著高于空白HKC组,Cyr61基因转染组的I型和Ⅳ型胶原、层黏连蛋白mRNA表达都明显增高,且Ⅳ型胶原的基因表达增高程度远大于Ⅰ型(P<0.01)。但Cyr61基因转染组上述细胞外基质成分的表达仍显著低于囊肿衬里上皮细胞(P<0.01)。结论过表达Cyr61的HKC表达细胞外基质成分明显增强,尤以Ⅳ型胶原为著。过表达的Cyr61可能通过调节细胞外基质成分,促进细胞外基质重构,参与ADPKD囊肿的形成和发展。