巴戟天MoDXR基因及其启动子的克隆与分析

从巴戟天中克隆MEP途径中的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶基因MoDXR及其启动子序列,并进行生物信息学分析、启动子区顺式作用元件分析,以及进行原核表达分析。根据巴戟天转录组中DXR基因原始序列和NCBI-ORFfinder分析,设计特异性引物,并进行RT-PCR扩增和生物信息学分析;采用染色体步移克隆MoDXR基因的5′端启动子序列;通过亚细胞定位分析MoDXR基因在细胞中的位置;构建原核表达载体pET-28a-MoDXR,导入BL21(DE3)表达感受态细胞后,在IPTG诱导下表达。从巴戟天中克隆的MoDXR基因,其cDNA全长2 015 bp,预测的阅读框大小为1 425 bp,编码474个氨基酸,分子质量为51.27 kDa; BlastP序列比对分析表明MoDXR基因与其他植物的DXR基因具有高度同源性,如:咖啡树DXR (CaDXR)、萝芙木DXR (RvDXR);系统进化发育树分析显示,巴戟天MoDXR蛋白与小粒咖啡和栀子的DXR蛋白聚为一类,其亲缘关系最近;由亚细胞定位可知MoDXR基因所编码的蛋白定位于叶绿体上; MoDXR基因5′端启动子序列长度为1 493...     

白木香AsERF1基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

乙烯响应因子(ethylene-response factor, ERF)是AP2/ERF家族中的亚家族,在植物信号转导、生长发育和植物防御反应中起到重要作用。本研究以白木香(Aquilaria sinensis)为材料,设计特异性引物,克隆了白木香的AsERF1基因的cDNA序列,并进行氨基酸序列分析、原核表达和纯化、亚细胞定位、组织特异性分析、非生物胁迫诱导表达分析研究。白木香AsERF1基因的开放阅读框(ORF)长691 bp,编码229个氨基酸,其蛋白分子质量为25.36 kD。AsERF1蛋白含有1个保守的AP2区域,系统进化树分析表明AsERF1与毛果杨的ERF2蛋白亲缘性最高。利用本生烟瞬时表达系统研究表明AsERF1主要定位于植物细胞核中。构建原核表达载体pET28a-AsERF1,并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达AsERF1重组蛋白,纯化得到可溶性重组蛋白。实时荧光定量PCR结果显示AsERF1在叶中的表达量最高,茎次之,根和茎尖最低。盐、干旱、低温和重金属胁迫能够诱导AsERF1的表达,其中干旱胁迫对AsERF1的表达水平影响最显著。本研究为揭示ERF基...     

茅苍术AlCMK基因的克隆及原核表达分析

4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶[4-(cytidine-5′-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase, CMK]是生成萜类化合物MEP途径的关键酶之一。本研究以茅苍术转录组数据为依据,克隆获得CMK基因序列,命名为AlCMK (GenBank登录号为OM283293)。研究结果表明, AlCMK包含一个全长为1 230 bp的开放阅读框(ORF),编码409个氨基酸,推测其相对分子质量为44 752.53,蛋白理论等电点为6.67;跨膜结构分析表明其无跨膜结构,二级结构显示其主要由无规则卷曲(48.17%)结构组成;同源氨基酸序列分析表明,茅苍术与除虫菊、桂花、杜仲、忍冬、丹参CMK基因编码的氨基酸序列具有较高同源性;系统进化树分析表明,茅苍术AlCMK与菊科植物CMK蛋白亲缘关系较近;构建pET-32a-AlCMK原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21 (DE3)表达感受态,蛋白表达结果显示其分子质量约为65 kDa;利用qRT-PCR分析AlCMK基因在不同组织和茉莉酸甲酯(MeJA)处理后的表达模式,同时采用ELISA试剂...     

三七PnMYB1R1基因的克隆、亚细胞定位与不同胁迫下的表达分析

MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物信号转导、生长发育和植物防御反应中起到重要作用。本研究以三七(Panax notoginseng)为材料,设计特异引物,克隆了三七中1R-MYB转录因子PnMYB1R1基因,并进行氨基酸序列分析、原核表达和纯化、亚细胞定位、转录活性分析、组织特异性分析及非生物胁迫下的诱导表达分析。PnMYB1R1基因开放阅读框(ORF)长738 bp,编码245个氨基酸,蛋白分子质量27.0 kD。序列分析及系统进化树结果表明PnMYB1R1包含1个保守的R3结构域,属于1R-MYB型转录因子中的TRF-like类蛋白。构建原核表达载体pET28a-PnMYB1R1并在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中成功表达PnMYB1R1重组蛋白,纯化得到可溶性重组蛋白。亚细胞定位实验结果表明PnMYB1R1定位于植物细胞的细胞核中。转录活性分析显示PnMYB1R1转录因子具有转录激活活性。实时荧光定量PCR结果表明PnMYB1R1基因在三七主根中表达量最高,茎、叶次之,须根中表达量最低。盐、低温及干旱胁迫均能够影响主根、须根、茎、叶中PnMYB1R1基因的表达...     

钩藤叶化学成分的研究

目的 研究茜草科植物钩藤Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jacks.叶的化学成分.方法 用多种色谱方法和重结晶法进行分离和纯化,经理化、光谱和色谱分析等方法鉴定结构.结果从钩藤叶中分离得到5个化合物,鉴定为喜果苷(vincoside lactam,Ⅰ)、异去氢钩藤碱(isocorynoxeine,Ⅱ)、异钩藤碱(isorhynchophylline,Ⅲ)、去氢钩藤碱(corynoxeine,Ⅵ)、钩藤碱(rhynchophylline,Ⅴ).结论化合物Ⅲ为首次从钩藤叶中分离得到,通过2D-NMR技术完善了化合物Ⅲ的核磁数据.     

sTRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

克隆TRAIL基因的95-281位(sTRAIL)，构建表达载体，建立原核表达体系，优化诱导表达的条件。分离人外周血淋巴细胞，提取总RNA，RT-PCR，克隆sTRAIL的cDNA，构建原核表达载体，优化IPIG诱导的条件。结果：(1)克隆了TRAIL基因95-281位的cDNA，DNA测序结果与报道的一致。(2)构建了sTRAIL基因的原核表达载体，酶切结果与预期的一致。(3)转化宿主菌，优化IPIG诱导条件，发现3mmol/L，诱导3～4h表达最好。sTRAIL基因的克隆及表达为下游中试发酵及纯化奠定了上游的基础，也为研究TRAIL抗肿瘤的机制提供了可能。     

sMICA基因的克隆表达及其纯化

目的构建重组MICA原核表达载体并探讨MICA对NK细胞毒效应的影响。方法经RT-PCR从Hela细胞获取MICA基因,经适当酶切后构建表达载体pBV220-MICA,转入大肠杆菌DH5α进行表达。重组MICA蛋白经纯化后与NK92细胞孵育观察对NK细胞毒效应的影响。结果带有重组质粒pBV220-MICA的大肠杆菌经热诱导后,以可溶性形式表达重组MICA蛋白,纯化后的重组MICA蛋白纯度为95%。经重组MICA处理的NK92细胞对MICA表达阳性的肿瘤细胞的杀伤作用明显降低。结论构建了pBV220-MICA重组质粒,并在大肠杆菌中获得可溶性表达,为研究MICA与NK细胞受体的相互作用机制奠定了基础。     

论钩藤的带钩率与质量控制

目的 论钩藤的带钩率与质量的关系,建立钩藤的显微鉴定和异钩藤碱的高效液相含量测定.方法 采用中药材粉末显微鉴定法,寻找钩藤药材在显微镜下的最常见的特征性细胞与带钩率的关系;用高效液相法测定不同带钩率的钩藤药材提取物的异钩藤碱含量.结果 显微鉴定:特征性细胞与带钩率不同有关联;含量测定方法:操作简单,准确,异钩藤碱在1.0943～70.0350 μg之间呈良好的线性关系,异钩藤碱的回收率为 97.83%.结论 本实验用定性、定量方法来检验不同带钩率的钩藤药材与提取物的质量,对药材的进一步开发利用提供了科学依据.并对传统用药习惯进行论证.     

天麻苷与钩藤生物碱在实验动物体内的代谢分析

中药药对作为复方中一种相对固定的组方单位,是前人对2药配对应用后产生某些特殊功效的精辟总结,自有其内在规律。天麻、钩藤作为平肝熄风中药,常配伍使用。本课题通过对2药活性成分在生物体内的代谢研究,旨在用现代方法研究其配伍机理,为中医理论的论证及临床实践提供新的方法学和依据。钩藤为常用中药,其主要活性成分为钩藤生物碱,其中,钩藤碱(Ｒｈｙｎｃｈｏｐｈｙｌｉｎｅ)、异钩藤碱(Ｉｓｏｒｈｙｎｃｈｏｐｈｙｌｉｎｅ)含量较高[1]。由于钩藤在治疗高血压、改善血液循环及脑功能方面呈现良好效果,因此受到国内外医药工作者的重视,已…     

pyrG基因的克隆表达及CTPS的活性测定

为提高乳清酸到三磷酸胞苷(CTp)的转化效率,克隆并表达了编码CTP合成酶(CTPS)的基因pyrG。根据Genbank的资料,设计了pyrG的引物,经PCR扩增、酶切后,将pyrG插入到表达载体pET-28a中,构建了重组质粒pET28a-pyrG,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,乳糖诱导表达后,经SDS-PAGE对表达产物进行分子量鉴定。分离纯化后,对表达产物CTPS进行活性测定,并对转化工艺进行初步研究。结果:构建的工程菌产生了一种相对分子质量在60.0k的蛋白,该蛋白显示出CTPS的活性,并且可以转化乳清酸为CTP。     

阿司匹林与异钩藤碱合用的抗血小板聚集作用

目的观察阿司匹林(ASP)与异钩藤碱(Iso)合用对家兔体外血小板聚集的影响。方法通过体外血小板聚集实验,采用比浊法测定ASP与Iso合用对胶原(Col)、凝血酶(Thr)及二磷酸腺苷(ADP)诱发的家兔血小板聚集率的影响。结果ASP与Iso合用可抑制由Col(50mg·L-1)、Thr(3 U·m L-1)及ADP(15μmol·L-1)诱导的血小板聚集。结论 ASP与Iso合用能协同抑制家兔体外血小板聚集。     

人白介素-15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的克隆人白介素-15(IL-15)基因系列启动子,构建IL-15基因启动子荧光素酶报告基因载体。方法通过PCR方法从HaCaT细胞基因组DNA中获得IL-15基因编码序列5′上游七段逐步缺失的IL-15启动子序列;双酶切后,分别重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因pGL3-Basic载体上,构建IL-15基因系列启动子报告基因载体;用脂质体转染法将含最长启动子序列的报告基因载体转染至HaCaT细胞,并设置空白对照组和LPS组分别处理;24 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果经PCR方法扩增出七段逐步缺失的IL-15基因启动子片段,PCR及双酶切鉴定各重组体构建正确;瞬时转染HaCaT细胞后经报告基因检测得知所克隆最长序列具有启动子活性。结论成功构建了IL-15系列启动子报告基因载体,并在HaCaT细胞中初步活性分析得知所克隆IL-15基因调控系列内包含启动子核心区域,为进一步研究IL-15表达调控机制奠定了实验基础。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达

目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子 1(hIGF 1) ,构建hIGF 1原核表达载体 ,并进行表达与纯化。方法以pUCIGF质粒为模板 ,PCR扩增了hIGF 1基因。经适当酶切后 ,构建表达载体pRSET IGF ,转入大肠杆菌BL2 1(DE3)进行表达 ,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化。结果带有重组质粒pRSET IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,以可溶性形式表达 7.8kD大小的蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白量的10 %～ 2 0 % ,纯化后目的蛋白纯度达 95 %以上 ,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF 1抗原活性。结论构建了pRSET IGF重组质粒 ,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达 ,为获得大量基因工程产品奠定了基础     

人的核糖体蛋白S3a基因克隆、表达、纯化与亚细胞定位

目的克隆人核糖体蛋白S3a（Ribosomal protein S3a,RPS3a）基因,并表达、纯化其蛋白,分析RPS3a蛋白的细胞定位,为其功能研究奠定基础。方法应用RT-PCR从人胚肾HEK293细胞的总RNA中反转录并扩增出RPS3a基因,克隆到原核表达载体PET-21a中,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,PET21a-RPS3a融合表达载体在大肠杆菌菌株BL21（DE3）中以可溶性蛋白的形式高效表达RPS3a蛋白,超声破碎细胞,通过Ni~（2＋）-NTA亲和层析柱初步纯化,再应用50kD超滤膜进一步纯化。用Western Blot印迹实验检测纯化后的蛋白。构建绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）的pEGFP-N1-RPS3a表达载体,转染HEK293细胞,通过荧光显微镜观察RPS3a重组荧光蛋白在细胞内的分布。结果获得了较高纯度的RPS3a蛋白,亚细胞定位分析表明RPS3a蛋白主要分布于细胞质。结论成功克隆了RPS3a基因并表达纯化了其蛋白,确定其亚细胞分布,为进一步研究RPS3a蛋白的性质和功能奠定了基础     

CD2AP启动子的克隆和活性分析

目的 构建表达CD2AP基因转录起始位点上游启动子的表达质粒,转染人类胚胎肾(HEK)-293T细胞,评价其启动子活性.方法 以人全血细胞总DNA为模板,PCR扩增CD2AP转录起始位点上游2082 bp的启动子区片段.亚克隆此片段至无启动子活性的pGL-3基本载体荧光素酶报告基因上游的多克降位点,构建含CD2AP启动子的重组报告质粒.转染HEK-293T细胞,行荧光素酶活性检测,计算相对活性单位(RLU).生物信息学分析转录因子结合位点.结果 酶切,测序鉴定证实成功构建含有CD2AP基因转录起始位点上游2082 bp的启动区的表达质粒.CD2AP的启动子与正常的pGL-3基本质粒比较,其RLU增加了74.8倍.其上游启动子区序列中含多个转录因子结合序列如AP1、Sp1、CREB和GATA-1等.结论 CD2AP转录起始位点上游序列在HEK-293T细胞中具有较强的启动活性.     

链霉菌A因子合成酶编码基因的克隆与原核表达载体构建

链霉菌是重要的抗生素产生菌。在链霉菌中,抗生素合成受到复杂的调控,由细胞内外小分子信号、全局性调节基因（如光秃基因bld）、抗生素合成的多效性调节基因（abaA,absAB,afsR—afsK,cutRS等）和途径专一性调控基因（act Ⅱ-4,redD等）。     

细胞毒素Gelonin的亚克隆、表达与纯化

将分别含有细胞毒素gelonin基因片段的重组子pUC-gell和pUC-gelⅡ，按照预先设计的酶切位点，通过亚克隆得到含有gelonin全基因的重组子pUC-gel。然后将pUC-gel与pET28a同时用NdeI/EcoRI双酶切，相关片段构建成表达重组子pET-gel，并进行DNA序列测定。工程菌E.coli BL21/pET-gel表达产物经两步SP－Sepharose柱层析，可得电泳纯的重组gelonin，分子质量为28000u。无细胞体系蛋白质合成实验表明，其IC50（使蛋白质合成抑制50％所需浓度）为35μg/L。酶联免疫实验为阳性。     

钩藤碱和异钩藤碱与牛血清白蛋白的相互作用

目的 研究钩藤碱、异钩藤碱与牛血清白蛋白相互作用的荧光猝灭类型、结合位点和作用力类型。方法 采用荧光光谱法、紫外-可见分光光度法、红外光谱法以及分子对接技术进行研究。结果 钩藤碱与异钩藤碱的加入会导致牛血清白蛋白发生静态荧光猝灭,与其site I位点结合,结合位点数为1;二者与牛血清白蛋白主要以氢键和范德华力结合,可使牛血清白蛋白的二级结构发生改变。结论 阐明了钩藤碱和异钩藤碱与牛血清白蛋白相互作用的机制,为临床应用提供了实验数据。     

散发性乳腺癌组织BRCA1基因启动子甲基化与蛋白表达的相关性

目的：探讨BRCA1基因启动子甲基化对BRCA1蛋白表达的影响,与散发性乳腺癌发病之间的关系。方法：采用甲基化特异性PCR（MS-PCR）检测51例散发的乳腺浸润性导管癌和10例乳腺良性组织的BRCA1基因启动子甲基化状态,免疫组织化学SP法检测相应组织的石蜡标本BRCA1蛋白表达水平。结果：10例乳腺良性组织中均未检测到BRCA1启动子的异常甲基化,结合免疫组织化学检测,BRCA1蛋白均在细胞核阳性表达,其中70％为强阳性表达;在51例散发性乳腺浸润性导管癌组织中检测到7例BRCA1启动子发生异常甲基化,甲基化比例为13．73％（7／51）;其余44例（44／51,86．27％）未检测到BRCA1启动子甲基化。     

异钩藤碱对猫的心血管作用与血药浓度的关系

目的　用麻醉猫研究异钩藤碱 (Iso)的心血管药理效应与血药浓度的关系。方法　异钩藤碱粉末 ,分别临用时配制 (FPI)和配好后室温放置 1周备用 (DPI)。以RM 6 0 0 0八道生理仪记录猫的收缩压、舒张压和心率的变化 ,相应时间点取血 1.0mL。用反相高效液相色谱法测定血药浓度。结果　Iso的降压及负性频率效应与其给药剂量及血药浓度呈明显的量 效关系 ,同剂量的DPI和FPI给药 ,FPI的起效时间、疗效维持时间及最大效应均强于DPI。结论　Iso的降压及负性频率效应与其给药剂量及血药浓度呈明显的量 效关系 ;Iso的溶液剂型不稳定 ,室温放置 1周后可降低其心血管药理效应。