不同方法移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠糖尿病的疗效比较

背景：目前多数研究集中于探讨骨髓间充质干细胞移植后的转分化及其调控机制，而缺少干细胞移植治疗糖尿病的方法学和功能学研究。 目的：观察不同途径移植骨髓间充质干细胞对糖尿病模型鼠的治疗效果。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2008-03/11在深圳市人民医院临床研究中心完成。 材料：1周龄雄性SD大鼠4只，用于制备骨髓间充质干细胞。8周龄雌性SD大鼠32只，随机分为胰腺包膜下移植组、静脉移植组、糖尿病对照组、正常对照组，8只/组。 方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，贴壁法纯化扩增。胰腺包膜下移植组、静脉移植组、糖尿病对照组大鼠通过腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型。造模后，胰腺包膜下移植组取5×106个第3代骨髓间充质干细胞，重悬于0.2 mL PBS中，多点注射至胰腺包膜下；静脉移植组经股静脉注射等量骨髓间充质干细胞悬液；糖尿病对照组及正常对照组不接受任何处理。 主要观察指标：动态观察移植后血糖、胰岛素、C-肽水平变化，以及糖耐量实验结果。 结果：与糖尿病对照组比较，移植后30 d内胰腺包膜下移植组和静脉移植组血糖值均明显降低(P < 0.05)，且胰腺包膜下移植组下降幅度更为显著(P < 0.05)；移植后第2，4，6周胰腺包膜下移植组与静脉移植组的胰岛素、C-肽水平均明显升高(P < 0.05)，且胰腺包膜下移植组升高幅度更为显著(P < 0.05)，但仍低于正常对照组(P < 0.05)。糖耐量实验中腹腔注射葡萄糖后，胰腺包膜下移植组血糖水平30 min达峰值，90 min降低至空腹水平，接近正常对照组的葡萄糖处理能力；静脉移植组对葡萄糖的处理能力略强于糖尿病对照组(P < 0.05)，但此2组在180 min内均未能恢复到正常血糖水平。 结论：骨髓间充质干细胞移植途径与糖尿病的治疗效果有直接关系，胰腺包膜下移植效果优于静脉移植。     

人脐带间充质干细胞体外向胰岛样细胞诱导分化及其治疗糖尿病效果

背景：相对于其他来源的干细胞而言，脐带间充质干细胞免疫排斥反应和免疫原性较小，但并不等同于无任何免疫排斥反应。 目的：观察人脐带间充质干细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化，及其移植后对糖尿病大鼠的治疗效果。 设计、时间及地点：细胞学体内对照观察，于2008-11在辽宁医学院解剖学教研室实验室完成。 材料：清洁级雄性SD大鼠36只，随机分为4组：胰岛样细胞组12只、间充质干细胞组12只、模型对照组6只、正常对照组6只。人脐带间充质干细胞由天津国家干细胞中心提供。 方法：取传至第3代的人脐带间充质干细胞，待细胞融合至70%~80%后，换用含碱性成纤维细胞生长因子、尼克酰胺的DMEM高糖培养基，向胰岛样细胞诱导分化。除正常对照组外，其余3组大鼠均腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型。造模后，胰岛样细胞组于肾被膜下植入胰岛样细胞2×106个，间充质干细胞组同法植入等量未诱导的脐带间充质干细胞，模型对照组植入不含任何细胞的培养液1 mL。 主要观察指标：诱导后胰岛样细胞的鉴定，胰岛样细胞的移植效果。 结果：诱导前脐带间充质干细胞呈长梭形贴壁生长；诱导4 d后细胞向中央聚集，出现胰岛样细胞团，此后胰岛样细胞团逐渐增大且数量增多；诱导7 d双硫腙染色呈阳性表达。移植后2周，胰岛样细胞组血糖浓度明显降低，一直维持至第6周；间充质干细胞组血糖浓度在移植后很快下降，但4周后血糖浓度上升；模型对照组血糖浓度一直处于糖尿病血糖浓度范围内。免疫组化染色结果显示，移植后4周胰岛样细胞组胰腺管腔内可见大量胰岛素表达，间充质干细胞组仅有表达少量胰岛素，正常对照组胰岛素表达无明显变化。 结论：人脐带间充质干细胞体外可诱导分化为胰岛样细胞。与脐带间充质干细胞相比，胰岛样细胞能够较长时间维持大鼠血糖浓度在正常水平，且植入后可迅速发挥降糖作用。     

与胎鼠胰腺干细胞共培养保护大鼠胰岛活性**★

目的：如何保护胰岛功能一直是胰岛移植中一个重要的研究内容。很多研究表明，干细胞除了自身具有较强的增殖分化能力之外，还可通过分泌一些细胞因子或者通过细胞-细胞接触、融合等方式促进损伤组织的修复，维持正常组织细胞功能。本实验利用胎鼠胰腺干细胞与大鼠胰岛共培养，观察其在保护胰岛功能、延长胰岛体外存活时间方面的作用。 方法：实验于2006-07/2007-04在深圳人民医院中心实验室完成。①实验材料：选取体质量500 g、孕16 d的雌性SD大鼠1只，10周龄、体质量200~250 g SD大鼠20只，雌雄不限，均由广东省实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：分离纯化孕16 d SD大鼠胎鼠的胰腺干细胞，并应用免疫细胞化学法及流式细胞术鉴定；采用胶原酶Ⅴ消化、不连续密度梯度法分离纯化SD大鼠胰岛，并应用双硫腙鉴定。按随机对照表法将胰岛培养分单纯胰岛培养、胰岛与胰腺干细胞联合培养两组，15孔/组。③实验评估：观察胰岛形态变化及胰岛存活率，应用酶联免疫吸附法检测胰岛素分泌量并计算刺激指数。 结果：①胎鼠胰腺干细胞培养传代3代后免疫细胞化学可见巢蛋白阳性细胞，流式细胞术测定巢蛋白阳性细胞含量占74.1%。②单纯培养组培养3 d时，胰岛生长状况较好，轮廓清楚，培养7 d时，胰岛结构变松散，边界不清，培养超过14 d后，胰岛结构均已破坏。联合培养组培养3 d时，胰岛生长良好，大部分胰岛悬浮生长，部分胰岛与贴壁干细胞松散黏附，培养7 d后大部分胰岛仍完整，培养14 d时仍可见完整胰岛。③联合培养组培养7，14 d时胰岛存活率明显高于单纯培养组（P < 0.01）；④高糖刺激下联合培养组培养7 d时胰岛素分泌刺激指数明显高于单纯培养组（P < 0.01）。 结论：胎鼠胰腺干细胞与胰岛联合培养可以明显延长胰岛体外存活时间，并保持良好的活性。     

HU-MSCS诱导为胰岛样细胞移植治疗糖尿病大鼠的研究

摘要目的: 观察人脐带间充质干细胞体外诱导分化为胰岛β样细胞及治疗糖尿病大鼠的效果方法：经培养，当细胞融合至70%~80%，诱导人脐带间充质干细胞向胰岛样细胞团分化，并用双硫腙染色法进行鉴定。采用完全随机法将40只SD大鼠分为正常对照组6只，链脲佐菌素组34只。空腹12h后，链脲佐菌素组腹腔注射链脲佐菌素（70mg/kg）和柠檬酸钠缓冲液(0.1 mol/L) 。大鼠分别于注射前、后48 h、第5 d和第8 d空腹断尾采血, 测定全血血糖浓度。选用连续2次血糖浓度高于16.7mmol/L的大鼠作为糖尿病模型。采用完全随机法从已成模的糖尿病大鼠中选出30只分为3组：胰岛样细胞移植组12只，进行肾被膜下胰岛样细胞团移植, 每只大鼠注入胰岛样细胞2×106 个；脐带间充质干细胞组12只，肾被膜下注入未进行诱导的脐带间充质干细胞, 细胞数2×106个；糖尿病对照组6 只, 肾被膜下移植不含细胞的培养液。3 组大鼠均于移植前及移植后48 h 测定空腹血糖浓度, 每周定点测空腹血糖及称体重1次。结果:（1）成功将人脐带间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞团, 双硫腙染色阳性。（2）胰岛样细胞团移植组大鼠移植2周，血糖浓度显著降低, 且血糖下降的趋势一直维持至第6周。脐带间充质干细胞组移植2周，血糖浓度显著下降，但是4周后血糖浓度出现上升。糖尿病对照组大鼠血糖浓度一直处于糖尿病血糖浓度范围内。结论：人脐带间充质干细胞体外可诱导分化为胰岛样细胞团，并对糖尿病大鼠有治疗作用。     

胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞与天然胰岛细胞的基因差异性

背景：目前胰腺干细胞在体外诱导转分化效率和分化成熟度较低，哪些基因在转分化中起关键性调控作用尚不清楚。 目的：通过基因表达谱芯片分析转分化的胰岛样细胞与天然胰岛细胞在成熟度上的基因差异，筛选对转分化起关键性调节作用的基因。 设计、时间及地点：基因水平的对照实验，于2004-07/2006-04在暨南大学第二临床医学院（深圳市人民医院）临床医学研究中心实验室完成。 材料：SD大鼠胰腺分离的胰腺干细胞转分化的胰岛样细胞团，SD大鼠分离的天然胰岛。 方法：分离和消化SD大鼠胰腺，用差异性贴壁、低血清培养等方法纯化出大鼠胰腺导管上皮细胞，利用免疫组化方法鉴定CK-19和PDX-1。通过含有exendin-4、角质细胞生长因子、尼克酰胺等细胞因子和葡萄糖的培养基，使之转分化为胰岛样细胞团，应用双硫腙染色和胰岛素免疫荧光染色鉴定。提取转分化的胰岛样细胞和天然胰岛细胞RNA，利用大鼠22000位点寡核苷酸芯片进行杂交，筛选差异性表达的基因，并进一步采用反转录-聚合酶链反应验证13个相关基因的表达。 主要观察指标：转分化的胰岛样细胞团和天然胰岛鉴定，差异性基因筛选和鉴定。 结果：筛选出差异表达基因1 072个，其中表达上调的基因397个，上调10倍以上的基因35个；表达下调的基因有675个，其中下调20倍以上的基因37个。上调10倍以上的差异性基因中与细胞组织和生物发生相关基因最多，下调20倍以下的基因中与发育相关基因最多。对选定的13个与胰岛细胞发育密切相关的基因PDX-1, PDX-4, PDX-6, Nkx2.2, Nkx6.1，Nkx6.2，Ptfla，Isll，Ngn3，Myt1，Ptf1a，capn5，Ppy，通过反转录-聚合酶链反应进一步验证与芯片检测结果一致。 结论：转分化的胰岛样细胞与天然胰岛细胞基因表达差异显著，参与胰岛发育的关键基因表达明显下调。     

脐带源间充质干细胞与大鼠胰腺细胞共培养向胰岛样细胞分化及移植治疗1型糖尿病★

背景：脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞可以向胰岛样细胞诱导分化。 目的：验证脐带源间充质干细胞与大鼠胰腺细胞共培养向胰岛样细胞诱导分化的可能性，并观察移植后对糖尿病大鼠血糖的影响。 方法：分离、诱导、传代脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞，再与大鼠胰腺细胞共培养，诱导成胰岛细胞团样组织。将大鼠分为3组，正常对照组不进行移植及造模；模型组仅制备糖尿病大鼠模型；实验组造模后将胰岛样细胞移植入糖尿病大鼠肾脏包膜。 结果与结论：脐带Wharton’s Jelly细胞培养中有细胞从组织块中爬出，第7天形态发生变化，贴壁细胞部分变成梭形。分离培养的细胞表达具有间充质干细胞表面特有标志CD44、CD29、CD105，不表达CD34、CD45、CD14。诱导第7，10天PDX-1及人胰岛素强染色；胰岛素及C-肽浓度较单纯培养组明显升高；PDX-1及人胰岛素mRNA诱导第7、10天较高表达。移植第1周大鼠尾尖血糖链脲佐菌素实验组明显低于模型组(P < 0.01)，但明显高于正常照组(P < 0.01)。8周链脲佐菌素实验组肾脏被膜下发现胞核染棕色染色的Brdu阳性、胞浆棕色染色的胰岛素阳性细胞。结果表明，脐带Wharton’s Jelly中存在脐带源间充质干细胞，与大鼠胰腺细胞共培养可促进间充质干细胞向胰岛样细胞诱导分化，移植入糖尿病大鼠肾脏被膜下，可显著降低糖尿病大鼠血糖。     

大鼠胰岛细胞经门静脉肝内移植模型的建立

背景：由于肝脏既是胰岛素的作用部位,又是相对的免疫特惠区,排斥反应小,肝窦及其小静脉结构还有利于胰岛的居留和生长,可供移植容积大,有利于胰岛的生存,因此肝脏是一个较为理想的移植部位。 目的：建立一种经门静脉胰岛细胞肝内移植治疗SD大鼠1型糖尿病的动物模型。 方法：采用文献方法制备SD大鼠胰岛细胞。以腹腔注射链尿佐菌素诱导建立SD大鼠1型糖尿病模型,随机数字表法分为2组：实验组经门静脉主干穿刺输注SD大鼠胰岛1 000 胰岛当量1.5 mL;对照组经门静脉主干穿刺输注无血清1640液1.5 mL。术后未给予免疫抑制剂,观察两组大鼠出血量、血糖、胰岛素水平及肝脏组织形态学变化。 结果与结论：所有大鼠均移植成活,门静脉穿刺一次成功率90%,出血量< 0.5 mL。胰岛移植大鼠血糖降为正常的时间1~6(3.7±1.7) d,移植胰岛存活时间为2~15(8.4±4.1) d。术后2周内实验组大鼠空腹血清胰岛素水平明显高于对照组(P < 0.05,P < 0.01)。病理结果证实,移植大鼠肝细胞形态、肝小叶结构均正常,肝实质未见坏死灶,血管内无血栓形成;门静脉主干未见狭窄,亦未发生感染,说明胰岛细胞在肝窦内存活并能发挥功能。证实大鼠胰岛经门静脉主干穿刺输注肝内移植是胰岛移植基础研究的理想模型。     

损伤胰腺提取液对骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的作用

背景：损伤胰腺提取液含有胰腺再生过程的特异性生长因子，能够促进β细胞系增殖和胰岛素分泌，可能有助于胰岛再生和细胞分化。 目的：观察损伤胰腺提取液对骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2005-06/2007-03在解放军军事医学科学院生物工程研究所完成。 材料：清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠6只，由解放军军事医学科学院实验动物中心提供。活化素A、视黄酸、胰蛋白酶抑制剂为Sigma公司产品，链脲菌素为Sigma公司产品。 方法：大鼠腹腔注射链脲菌素，2 d后血糖浓度超过10 mmol/L时取其胰腺组织，在含有胰蛋白抑制剂的磷酸盐缓冲液中制备匀浆，2次离心后取上清，即为损伤胰腺提取液。采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞，当传代细胞生长至70%~80%融合时，随机分为4组：对照组以体积分数为0.02的胎牛血清的低糖DMEM培养11 d；活化素A+视黄酸组以活化素A、视黄酸各自诱导24 h，再以碱性成纤维生长因子、尼克酰胺、尼克酰胺+exendin 4各自诱导3 d；活化素A+视黄酸+损伤胰腺提取液组在前组基础上添加损伤胰腺提取液；损伤胰腺提取液组单纯以损伤胰腺提取液诱导11 d。 主要观察指标：应用免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应等方法对分化细胞表型进行检测，ELISA法检测细胞胰岛素的分泌水平。 结果：活化素A+视黄酸组、活化素A+视黄酸+损伤胰腺提取液组有较多的胰岛素阳性反应细胞出现，且后者形成的胰岛样结构较前者大而多；损伤胰腺提取液组可见较少的胰岛素阳性反应细胞及胰岛样结构。各诱导组均检测到胰岛素1 mRNA的表达，培养上清中均可检测到胰岛素的分泌，且活化素A+视黄酸+损伤胰腺提取液组胰岛素分泌水平>活化素A+视黄酸组>损伤胰腺提取液组（P < 0.05）。对照组各项指标均呈阴性表达。 结论：基于前期活化素A、视黄酸及其他成熟因子的诱导方案基础上，损伤胰腺提取液对骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞具有促进作用，能够提高诱导分化效率。     

不同幼年供体胰段的超微结构观察

背景：随着胰腺移植供体的不足,胰段移植已倍受关注。从解剖学角度认识胰腺各段胰岛和胰岛细胞（A,B细胞）的分布规律,可否得出胰段移植的最佳选择。 目的：观察幼年大鼠胰腺胰尾的微细结构,胎尸胰腺胰尾的微细结构,胰岛B细胞胰高血糖素和胰岛素阳性表达面积及胰岛B细胞免疫阳性染色面积,并予以比较。 设计、时间及地点：对比观察,于2006-01/2007-06在福建医科大学人体解剖组织胚胎学系实验室完成。 材料：出生1周内健康SD大鼠33只,3~10个月龄胎尸胰腺80个,每月龄10个。胰高血糖素抗血清为武汉博士德生物工程公司产品,胰岛素抗血清为北京中山金桥生物技术公司产品,图像处理系统（Videopro32型）由福建医科大学人体解剖实验室提供,Hu-12A型透射电镜为日本电子株式会社产品。 方法：随机选择30只大鼠,取胰尾切片苏木精-伊红染色后光镜观察,显微测微器测量胰岛个数和面积,用胰高血糖素抗血清和胰岛素抗血清进行免疫组织化学染色。另3只大鼠取胰尾组织块铀铅染色,每月龄胎尸各取2例胰尾组织,1例行ABC法胰岛素免疫组化染色,另1例行铀铅染色。 主要观察指标：透射电镜观察并比较胎尸胰及幼年大鼠胰腺B细胞及胰岛形态和数量、结构及其分泌颗粒。 结果：幼年大鼠胰尾组织中胰岛B细胞内分泌颗粒多,内质网、高尔基复合体和线粒体等细胞器发达,胰岛数目分布多,胰岛B细胞的免疫阳性染色面积大。胎尸胰尾有较多而密的胰岛B细胞散在分布,胰岛B细胞分泌颗粒多。 结论：幼年大鼠和胎尸胰腺细胞的分泌活动均旺盛的,消化功能强,适宜作为胰腺胰段胰岛移植供体,且以胰尾为最佳。     

大鼠肌源性干细胞植入糖尿病鼠胰腺后的存活能力及血糖调节

背景：肌源性干细胞易于提取、分离及扩增，在特定条件下可分化为骨软骨、肌肉等中胚层组织细胞，还可以跨胚层分化为神经细胞等。 目的：观察糖尿病鼠胰腺内植入的肌源性干细胞存活情况，及其调节血糖的效果。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007-04/09在辽宁医学院科学实验中心完成。 材料：SPF/VAF级新生5 d龄SD大鼠31只，由辽宁医学院实验动物中心提供。造模使用的链脲佐菌素为星隆达公司产品。 方法：取5只大鼠的前肢肱三头肌与后肢腓肠肌，采用差速贴壁法纯化扩增大鼠肌源性干细胞，传至第3代用于移植，临用前以携带绿色荧光蛋白的腺病毒悬液进行转染。取20只大鼠，通过尾静脉注射链脲佐菌素建立糖尿病模型，15只成功造模，取12只随机均分为2组：细胞移植组胰腺被膜下移植肌源性干细胞约2×106个，模型对照组同法给予等量不含细胞的培养液。余6只大鼠作为正常对照组。 主要观察指标：肌源性干细胞移植至胰腺后的存活情况，移植后大鼠血糖浓度的变化。 结果：移植后1周，胰腺组织呈网架样结构，表达较强的黄绿色荧光；4周后仍有荧光表达，但强度减弱。与模型对照组比较，移植前2 d细胞移植组大鼠血糖浓度无明显差异（P > 0.05）；移植后4，8 d，大鼠血糖浓度一直处于较高水平；至移植后第4，8周大鼠血糖浓度明显下降（t=-2.416~8.372，P < 0.01）。 结论：肌源性干细胞移植后能在糖尿病模型鼠的胰腺部位存活，且一定程度上可下调大鼠血糖浓度。