日本血吸虫（中国大陆株）表达基因的EST序列测定及同源性分析

目的 运用表达序剜标签技术(EST方法),从Sj cDNA库中分离、鉴定和鉴定血吸虫表达基因序列。方法 应用EST方法,从Sj cDNA库中随机挑选出单个重组克隆进行PCR直接序列分析,通过互联网将获得的EST序列送入NCBl GenBank进行同源性检索,并对检索结果进行分析。结果 分离了46个Sj cDNA克隆,并对18个克隆cDNA插入片段的PCR进行直接序列分析,获得了16个EST序列。其中13个EST序列为GenBank中已知的血吸虫基因序列．3个未发现明显同源(score<200)基因序列。结论 采用EST-PCR直接序列分析方法可大量获得血吸虫表达基因EST序列,为进一步开展日本血吸虫（中国大陆株）表达基因的研究奠定了基础。     

日本血吸虫（中国大陆株）成虫表达序列标签的获取及分析

随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库单个重组克隆进行部分测序以获得EST（ex-pressed sequence tag),获得的EST通过BLAST程序同EMBL寄生虫数据库和GeneBank数据库进行比较及同源性分析。结果在随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库150个单个重组克隆中,获得了56个有价值的EST序列,其中47个在GeneBank dbEST中登录,7.1%EST序列为日本血吸虫已知序列,3.6%为日本血吸虫同源序列,曼氏血吸虫或其他生物的同源序列占25%,未知序列占55.6%。通过同源性分析可知,大多数和同源序列具有看家基因功能。另外,也发现了几个有价值的基因。     

EST法筛选日本血吸虫表达基因序列的研究

本运用表达序列标签法(EST)筛选日本血吸虫(中国江西株)成虫cDNA库,将得到的EST序列送入GenBank和EBI进行同源性分析检索,获得30个日本血吸虫基因EST,今后寻找新的抗血吸虫疫苗侯选分子及研制新的化疗药物奠定一定的工作基础。     

日本血吸虫TGF-β受体Ⅰ基因胞外段的克隆与表达

目的获得日本血吸虫TGF-β受体I胞外段（SjTβRIout）的序列,行原核克隆和表达,并分析其蛋白的免疫学功能。方法应用cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends,RACE）方法获得SjTβRI基因cDNA部分序列,用RT-PCR方法扩增SjTβRI胞外段（SjTβRIout）基因,构建pET28a（＋）重组原核表达载体,并测序鉴定。将质粒转入大肠埃希菌,IPTG诱导表达,并使用Ni离子亲和层析并透析处理获得纯化重组蛋白。使用纯化蛋白与弗氏佐剂共同免疫SD大鼠获得抗血清,使用ELISA方法检测血清中SjTβRIout特异抗体IgG含量。结果成功构建SjTβRIout原核表达载体。测序鉴定显示SjTβRIout包含399bp,编码133个氨基酸,并且与曼氏血吸虫TGF-β受体I的同源性较高。重组蛋白经SDS-PAGE分析,显示其相对分子质量约为20000,与目的基因编码蛋白的预测分子量相符。经重组蛋白免疫的SD大鼠产生高效价（〉1：100000000）的抗原特异性IgG抗体。结论首次获得pET28a（＋）-SjTβRIout的重组蛋白,并且证明其具有良好的免疫原性。     

日本血吸虫卵壳蛋白基因的筛选及EST序列测定

目的 通过对日本血吸虫(Sj)成虫cDNA库的核酸杂交筛选，分离出Sj卵壳蛋白相关基因的cDNA克隆，并进一步探讨该基因的结构与功能关系。方法 用地高辛标记的特异性寡核苷酸探针对Sj成虫cDNA库进行膜原位杂交筛进，挑选出阳性克隆，用通用引物进行PCR扩增，获得cDNA插入片段，采用PCR直接序列测定法，对其部分序列进行测定，而后将EST序列输入GENEBANK进行同源性检索和分析。结果 本实验从Sj cDNA库筛选到9个不同的阳性克隆，用通用引物扩增出9十分子量大小不同的单一条带，其中两个为已知序列，其余7个为新的EST序列。结论 用寡核苷酸标记探针对Sj库中进行校酸杂交筛选是寻找特定目的基因的有效方法。     

日本血吸虫线粒体大亚基核糖体基因的亚克隆,测序？…

目的 将筛选日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ文库得到基因克隆并测序。方法 体外将以阳性克隆为模板的ＰＣＲ产物和ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接，转化大肠杆菌ＸＬ１－ｂｌｕｅ，经抗生素及生色度物Ｘ－ｇａｌ初筛，再用限制性内切酶酶切法进一步鉴定和用ＤＮＡ自动测序仪测序。序列送ｂｌａｓｔ基因服务站进行同源性分析。结果 构建了３个含日本血吸虫ｃＤＮＡ基因片段的重组子，其中１个阳性克隆序列为编码日本血吸虫线粒体大亚基核糖体ｒＲＮ     

日本血吸虫大陆株26kDa谷胱甘肽S┐转移酶编码区基因的克隆及序列测定

从日本血吸虫大陆株成虫分离总ＲＮＡ，逆转录合成ｃＤＮＡ第一链，根据菲律宾株２６ｋＤａ谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）的ｃＤＮＡ序列，设计并合成引物，扩增出２６ｋＤａ的编码区基因，并克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒。初步酶切鉴定后，从两端对插入片段进行核苷酸序列测定。结果与菲律宾株比较，核苷酸同源性为９９．８％，仅第５８２位碱基不同，菲律宾株为Ａ，而大陆株为Ｇ。比较从ｃＤＮＡ推导出的氨基酸序列，两者１００％相同。测序结果也与曼氏血吸虫进行了比较。     

日本血吸虫毛蚴相关蛋白基因SjMP13的克隆表达及免疫学鉴定

利用日本血吸虫感染者唾液免疫筛选日本血吸虫虫卵cDNA文库,对获得的阳性克隆进行序列分析,其中一阳性克隆插入片段包含一个351 bp的开放读码框,其编码116个氨基酸,预测分子量为12.9 kDa,将其命名为SjMP13,该蛋白与血吸虫尾蚴相关蛋白(GenBank序列号:AF448823.1)同源性高达96%.将该序列克隆入原核表达质粒pET32a(+)并转化宿主菌B121/DE3,经IPTG诱导表达后,其重组表达产物经亲和层析纯化,再用Western-blot进行免疫学分析,该序列的原核表达产物能被日本血吸虫感染者唾液以及血清识别,提示该分子具有诊断抗原的开发价值.     

日本血吸虫卵壳蛋白基因的克隆及真核表达载体的构建

血吸虫卵壳蛋白基因是探讨血吸虫病免疫预防的重要靶标。本研究根据已发表的多个血吸虫卵壳蛋白基因的核苷酸序列,设计合成了特异引物,体外扩增和克隆了编码日本血吸虫中国大陆株卵壳蛋白基因SjESG的cDNA,测序结果表明与已发表的卵壳蛋白基因序列有较高同源性。为进一步研究该基因的功能,将其克隆入pcDNA3中,成功构建了真核表达载体,为SjESGDNA疫苗的研究打下了基础。     

日本血吸虫新基因的发现及其功能的初步预测

本文运用表达序列标签（expressed sequence tags,EST)法筛选日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库,获得50个日本血吸虫EST片段,经过测序后将EST序列送入EMBL和NCBI,Genbank进行同源性分析并登录。为寻找新的抗血吸虫疫苗候选分子,化疗药物及具有我国自主知识产权的血吸虫功能基因奠定工作基础。     

人树突状细胞cDNA质粒文库的构建及其大规模随机测序体系的建立

目的：建立人树突状细胞（ＤＣ）的ｃＤＮＡ文库,通过大规模随机测序克隆免疫新分子。方法：来源于正常人外周血的单核细胞,体外经ＧＭＣＳＦ和ＩＬ４培养,扩增出高纯度的ＤＣ,抽提纯化ｍＲＮＡ,转录成ｃＤＮＡ,定向插入ｐＳＰＯＲＴ２０载体,建立人ＤＣ的ｃＤＮＡ质粒文库;用ＡＢＩ３７７全自动测序仪对该文库进行随机测序,将得到的ＥＳＴ在ＳｕｎＥ４５０服务器中与ＥＭＢＬ及Ｓｗｉｓｐｒｏｔ数据库进行同源性比较,筛选出代表未知基因ＥＳＴ,然后在ＧＣＧ软件中进行分析,对重要的未知ＥＳＴ克隆其全长ｃＤＮＡ。结果：所扩增的ＤＣ经流式细胞仪分析高表达ＭＨＣⅠ、ＭＨＣⅡ、Ｂ７、ＣＤｌａ和ＣＤ８３等表面标志,能强烈刺激同种异体Ｔ淋巴细胞的体外增殖反应;建立的ＤＣｃＤＮＡ文库９２％以上克隆有平均１６ｋｂ大小的插入片段;从所测的１２０００余条ＥＳＴ中筛选出代表未知基因的３０００余条,克隆到１０９条全长新基因,包括属于细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和粘附分子等家族的免疫新分子,部分全长基因已在Ｇｅｎｅｂａｎｋ中登录。结论：成功建立了人ＤＣ的ｃＤＮＡ基因文库及其大规模随机测序体系,并克隆到免疫分子。     

人树突状细胞cDNA质粒文库的构建及其大规模随机测序体系的 …

目的：建立人树突状细胞的ｃＤＮＡ文库。通过大规模随机测序克隆免疫新分子,方法：来源于正常人外周血的单核细胞,体外经ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－４培养,扩增出高纯度的ＤＣ,抽提纯化ｍＲＮＡ,转录成ｃＤＮＡ,定向插入ｐＳＰＯＲＴ２．０载体,建立人ＤＣ的ｃＤＮＡ质粒文库;用ＡＢＩ３７７全自动测序仪对该文库进行随机测序,将得到的ＥＳＴ在Ｓｕｎ－Ｅ４５０服务器中与ＥＭＢＬ及Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ数据库进行同源性比较,筛     

18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库的构建

为揭示血吸虫生长发育机理,深入研究血吸虫与宿主、血吸虫雌雄虫之间蛋白质的相互关系,本研究选取血吸虫进入终末宿主体内18天时的虫体(发育成熟初期),采用Clontech Matchmaker技术成功构建日本血吸虫的酵母双杂交cDNA文库.该文库具有基因多样性和足够大的库容量,库容量为2.5×106 pfu/mL,插入的双链cDNA片段的长度在0.25～2.0 kb之间,文库重组比率为97.9%,具有良好的代表性.该文库的构建为筛选相互作用蛋白并进一步阐明其生理意义提供了基础.     

日本血吸虫大陆株26kDa谷胱甘肽S—转移酶编码区基因的克隆…

从日本血吸虫大陆株成分离ＲＮＡ，逆转录合成ｃＤＮＡ第一链，根据菲律宾株２６５ｋＤａ谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）的ｃＤＮＡ序列，设计并合成引物，扩增出２６ｋＤａ的编码区基因，并克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒，初步酶切鉴定后，从两端对插入片段进行核苷酸序列测定。结果与菲律宾株比较，核苷酸同源性为９９．８％，仅第５８２位碱基不同，菲律宾为Ａ，而大陆株为Ｇ。比较从ｃＤＮＡ推导出的氨基酸序列，两者１００％     

湖南省日本血吸虫线粒体cox1基因部分序列多态性的研究

目的研究湖南省日本血吸虫不同自然隔离群的线粒体细胞色素c氧化酶亚基1基因（coxl）部分序列（pcoxl）的变异，为阐明我国日本血吸虫的种群遗传结构奠定基础。方法采用聚合酶链反应（PCR）技术对湖南省岳阳君山、汨罗的日本血吸虫的pcoxl片段进行扩增、克隆及序列分析。结果获得480bp的pcoxl序列。经DNAstar软件分析，pcoxl序列有一定的种内差异（0～1．2％）。结论本研究为阐明我国日本血吸虫的种群遗传结构提供了数据。     

日本血吸虫铁蛋白基因的克隆、表达及其免疫诊断的研究

目的：构建、表达、纯化日本血吸虫铁蛋白基因的原核表达重组蛋白，并初步观察其免疫诊断价值。方法：将日本血吸虫铁蛋白基因亚克隆于pGMC载体，转化重组体到大肠杆菌E．coli 2566进行表达；采用电泳层析法分离纯化日本血吸虫铁蛋白；用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达纯化产物；用Dot-ELISA分别检测了血吸虫病人及正常人的血清。结果：重组的日本血吸虫铁蛋白以GMC(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)．日本血吸虫铁蛋白融合蛋白的形式在细菌中得到高效表达，分子量为40kD，能被日本血吸虫感染兔血清识别。用重组铁蛋白检测30例日本血吸虫病人血清和30例正常人血清，阳性率和假阳性率分别为93．3％和3．3％。结论：成功地表达纯化日本血吸虫重组铁蛋白．且该蛋白具有一定的免疫诊断价值．     

中国大陆4地日本血吸虫蛋白质及同工酶的多态性研究

本文通过对中国大陆境内安徽、湖南、湖北和云南４地日本血吸虫的蛋白质组分、同工酶多态性进行分析表明：１梯度ＳＤＳ、ＩＥＦ电泳结果均显示４地日本血吸虫雌雄虫的蛋白条带相同，说明在蛋白质组分上可能是相同的。２同工酶电泳显示４地血吸虫雌雄虫在ＣＯ酶谱上无差别，即没有多态性表现。在ＧＰＩ、ＡＣＰ和Ｇ６ＰＤＨ上显示了雌雄虫间的酶谱略有差异，但不同地理株同性虫体间未显示差异，说明在雌雄虫间可能存在基因位点的多态性，在ＰＧＭ和ＭＤＨ的同工酶谱上则表现出既有雌雄虫间的不同，也有不同地理株间的差异，表现４地日本血吸虫雌雄虫和不同地理株间有基因位点的多态性表现。     

日本血吸虫线粒体大亚基核糖体基因的亚克隆、测序及同源性分析

目的将筛选日本血吸虫成虫cDNA文库得到基因克隆并测序。方法体外将以阳性克隆为模板的PCR产物和 pGEM T载体连接 ,转化大肠杆菌XL1 blue,经抗生素及生色底物X gal初筛 ,再用限制性内切酶酶切法进一步鉴定和用DNA自动测序仪测序。序列送blast基因服务站进行同源性分析。结果构建了3个含日本血吸虫cDNA基因片段的重组子 ,其中1个阳性克隆序列为编码日本血吸虫线粒体大亚基核糖体rRNA的基因序列 ,另2个序列与已知的日本血吸虫基因序列无同源性。结论获得了日本血吸虫线粒体大亚基核糖体rRNA基因片段 ,为进一步分析其一级结构和功能打下了基础。     

日本血吸虫腺苷酸激酶-1与程序性细胞死亡蛋白-10基因的克隆表达及其在发育中表达的变化

目的:克隆、表达、定位日本血吸虫腺苷酸激酶-1(Schistosoma Japonicum Adenylate Kinase-1,SjAK1)及日本血吸虫程序性细胞死亡蛋白-10(Schistosoma Japonicum Programmed Cell Death-10,SjPCD10),为进一步研究其基因在生长发育中的功能奠定基础。方法:据SjAK1、SjPCD10基因完整开放阅读框(长度分别为594bp、651bp)分别设计并合成特异性引物,提取日本血吸虫成虫总RNA,RT-PCR获得cDNA,以cDNA为模板分别扩增SjAK1、SjPCD10目的基因片段,与载体pET28a质粒共同进行双酶切,连接、转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并测序鉴定后,抽提重组质粒,转化表达宿主菌BL21。PCR鉴定阳性重组克隆,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western Bloting检测表达结果,镍柱亲和层析纯化目的蛋白,BCA法定量目的蛋白;ATP荧光检测试剂盒检测重组SjAK1的活性。将目的蛋白分别免疫新西兰兔制备多抗,ELISA鉴定多抗效价。免疫组化法检测SjAK1和SjPCD10基因在日本血吸虫皮肤型童虫(30min)、肺型童虫(3天)、肝门型童虫(10天、14天、18天、22天)以及成虫(26天)中表达的变化。结果:成功构建重组表达质粒pET28-SjAK1和pET28-SjPCD10,原核表达的目的蛋白rSjAK1为可溶性、rSjPCD10呈包涵体形式;SDS-PAGE鉴定目的蛋白rSjAK1约26kDa、rSjPCD10约28kDa,与理论分子量一致;经镍柱亲和层析纯化获得高纯度目的蛋白,rSjAK1的比酶活为135.2U/mg。将目的蛋白免疫新西兰兔后血清效价均高于1∶1 280。免疫组化结果显示,SjAK1在各型童虫均有表达,皮肤型和肺型童虫中表达较少,肝门型童虫感染10天开始增加,但成虫期表达又减少;SjPCD10从18天开始表达增多,在雄虫和虫卵表达最为明显。结论:本实验成功克隆表达及纯化SjAK1、SjPCD10,其基因在日本血吸虫发育过程中均有表达,为深入研究其基因功能奠定了基础。