白纹伊蚊细胞色素P450CYP6N3基因分子进化机制初探

为了初步探讨白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6家族新基因分子进化机理,根据已获得的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株一新的细胞色素P450CYP6基因cDNA片段,设计反向引物,进行5‘-cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE);以正向引物进行3‘-RACE。然后分别进行克隆,测序和鉴定。根据获得白纹伊蚊CYP6家族新成员全长cDNA序列,运用PC/CENE软件分析其5‘-UTP区DNA序列相似性及编码区氨基酸残基相似性,构建系谱树。结果获得的3个全长序列中5‘-UTP区DNA序列安全相同;编码区氨基酸残基相似性为3/497或4/497个氨基酸差异。而且此种差异均位于蛋白质功能非保守的基础区域;构建的系谱树显示CYP6N3基因与冈比亚按蚊CYP6N1-2亲缘关系最近,而与致倦库蚊的CYP6E1,CYP6F1亲缘关系较远。说明白纹伊蚊CYP6N3基因较致倦库蚊的CYP6E1,CYP6F1基因更为古老;白纹伊蚊CYP6N3各等位基因变异体是通过整个CYP6N3基因座的新近复制而产生。     

白纹伊蚊CYP6N3基因启动子序列的分子克隆与功能分析

根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的 5′ 末端核苷酸序列 ,设计 2个反向特异引物 (GSP1和GSP2 ) ,利用 4种限制性内切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ分别消化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株高分子量基因组DNA ,消化产物与适配子连接产生 4种消化的DNA库 ,并分别以此为模板 ,进行基因步移。用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第 1步PCR扩增 ,然后再以第 1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第 2次PCR扩增。将扩增产物进行T A克隆及测序。结果显示 :分别以DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ消化的DNA库为模板而获得 4个长短不一的DNA序列 :80 6bp、 2 190bp、 3 0 76bp和 2 2 0 6bp ,它们均包括有CYP6N3全长cDNA5′ 非翻译区序列及氨基端开头 10个氨基酸的编码序列 ;在其ATG上游序列中均存在有若干个典型的TATA盒、Barbie盒和 或CCAAT盒、抗氧化剂反应元件或外源化合物反应元件。表明本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3基因 4个上游启动子区序列 ,并分析、讨论了它们在蚊虫中细胞色素P45 0基因多样性及其参与杀虫剂抗性中的作用     

白纹伊蚊CYP6N3基因启动子序列的分子克隆与功能分析

根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的5′-末端核苷酸序列,设计2个反向特异引物(GSP1和GSP2),利用4种限制性内切酶Dra Ⅰ、EcoR Ⅴ、Pvu Ⅱ和Stu Ⅰ分别消化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株高分子量基因组DNA,消化产物与适配子连接产生4种消化的DNA库,并分别以此为模板,进行基因步移.用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第1步PCR扩增,然后再以第1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第2次PCR扩增.将扩增产物进行T-A克隆及测序.结果显示分别以Dra Ⅰ、EcoR Ⅴ、Pvu Ⅱ和Stu Ⅰ消化的DNA库为模板而获得4个长短不一的DNA序列806bp、2 190bp、3 076bp和2 206bp,它们均包括有CYP6N3全长cDNA5′-非翻译区序列及氨基端开头10个氨基酸的编码序列;在其ATG上游序列中均存在有若干个典型的TATA盒、Barbie盒和/或CCAAT盒、抗氧化剂反应元件或外源化合物反应元件.表明本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3基因4个上游启动子区序列,并分析、讨论了它们在蚊虫中细胞色素P450基因多样性及其参与杀虫剂抗性中的作用.     

2a型丙型肝炎病毒5’非编码区的RACE护增及二级结构的分析

目的：获得真全长中国大陆2a型丙型肝炎病毒（HCV）5’非编码区（5’UTR）cDNA，并分析其一级结构和二级结构，为进一步研究其在HCR复制、翻译中的调控机制、开发新的抗HCV药物奠定基础。方法：利用逆转录套式聚合酶链反应（RT－PCR）联合限制性内切酶长度多态性分析（RFLP）初步筛选出1例2a型HCV感染者，采用cDNA末端快速扩增技术（RACE）扩增出一条约800bp的cDNA片段，A－T克隆，用RFLP与PCR鉴定重组子，全自动序列分析仪测定插入子序列，RNAdraw预测二级结构。结果：RACE法获得真全长2a型HCV 5’端序列。5个克隆中，3个克隆含全长5’UTR序列，与HCV－1，HC－C2，HC－J6，HC－J8相比，同源性分别为93．6％－94．4％，92．1％－93．0％，98．8％－99．7％，96．2％－96．5％，与2a型标准株HC－J6相比，21，170，222，247，339位不同，分别为G，A，C，C，T,但这些突变不影响其二级结构。另外2个克隆为5’端缺失突变株，分别缺失54bp和144bp。结论：RACE技术快速、有效、实用，可用效获得病毒基因组的末端序列；依此获得中国大陆2a型HCV的5’UTR cDNA；在感染者血液中存在5’端部分缺失的HCV基因片段。     

联合PCR技术克隆白纹伊蚊漆酶型酚氧化酶基因及其生物信息学分析

目的测定白纹伊蚊漆酶型酚氧化酶的基因的全长序列并用生物信息学方法分析其结构和功能。方法从白纹伊蚊卵、幼虫、蛹、雌蚊、雄蚊中提取总RNA,逆转录后以总cDNA为模板,设计简并引物进行巢式PCR,扩增部分序列后设计新的特异性引物补全5’端序列,使用3’-RACE法补全3’端序列,拼接全长后进一步进行生物信息学分析。结果通过巢式PCR扩增出1145bp的核苷酸序列,测序后设计5’端序列的下游引物,扩增出约900bp的核苷酸序列,设计3’端的上游引物,配合3’RACE试剂盒扩增出约600bp的核苷酸序列,寻找重复序列将三段序列进行拼接,得到国内外从未获得的长2244bp、编码747个氨基酸序列的白纹伊蚊漆酶型酚氧化酶基因的全长序列。生物信息学分析其与白纹伊蚊的相似性最高,为含信号肽的跨膜蛋白,含3个Cu氧化酶超家族位点,属于蓝色多铜氧化酶家族。结论联合PCR技术的应用使较长长度的基因序列的扩增更为方便、准确。为进一步对其进行功能的研究奠定了基础。     

白纹伊蚊基因组中CYP6家族新成员基因片段的克隆与分析

目的获得白纹伊蚊CYP6基因家族中新成员的基因片段。方法根据家蝇CYP6A1、CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E1同源区氨基酸序列,设计1对简并引物,分别以白纹伊蚊敏感品系和抗性品系基因组DNA为模板进行PCR,产物经T-A克隆转化至JM109大肠杆菌中,经筛选后测序,获得与设计的细胞色素P450基因片段大小相符合的5个基因片段,并将推导的氨基酸序列进行同源性分析。结果在白纹伊蚊敏感品系中获得了2个基因片段(AEDG-S1,AEDG-S2),核苷酸序列长度分别为240bp和236bp;在白纹伊蚊溴氰菊酯抗性品系中获得了3个基因片段(AEDG-R2,AEDG-R3,AEDG-R4),核苷酸序列长度分别为236bp、236bp和239bp。所得序列与昆虫CYP6家族的同源性在23.1%～53.8%之间,与CYP3家族的同源性在25.6%～43.9%之间,而与CYP4家族同源性较低,为13.9%～24.4%。结论所得5个序列为CYP6家族中5个新成员的基因片段。     

严重烧伤F344大鼠免疫细胞中一个EST全长序列的扩增

目的:探讨免疫细胞在大面积烧伤后全身免疫功能紊乱中的变化,对F344大鼠烧伤后血液淋巴细胞和单核细胞中的1个差异表达基因片段(AI764697.1)进一步研究。方法:根据该片段核苷酸序列设计双向引物和巢式引物,应用cDNA末端快速扩增技术(SMARTRACE)对该片段进行双向扩增,扩增后结果经测序,用Northernblot杂交验证。结果:设计的两对引物经扩增都得到了产物,克隆测序后得到1条长度为592bp的片段。Northernblot杂交在烧伤后得到1个长度约700bp的产物,在脾脏中表达水平较高,与RACE结果符合。该核苷酸序列已得到GenBank登录号AF244895。结论:在严重烧伤F344大鼠的血液淋巴细胞和单核细胞中分离并扩增出一个新的基因全长序列,其来源、定位和功能需要进一步研究。     

白纹伊蚊Rh类糖蛋白基因的克隆与生物信息学分析

目的应用简并引物RT．PCR和RACE方法获取白纹伊蚊Rh类糖蛋白（Aedes albopictus rhesuslike glycoprotein,AaRh）基因的全长cDNA。方法根据冈比亚按蚊、埃及伊蚊等亲缘关系较近物种的Rh类糖蛋白同源性分析结果,在氨基酸高度保守区域184／343和219／337氨基酸位点设计2对简并引物,以白纹伊蚊雌蚊总RNA为模板,应用巢式RT—PCR扩增AaRh的基因片段。根据获得的AaRh基因部分序列,设计2对特异性引物AaRhGSP1、GSP2和AaRhGSP3、GSP4,应用5’RACE和3’RACE分别扩增AaRh基因的5’端和3’端cDNA片段,然后拼接出全长cDNA序列。通过在线生物信息学分析（NCBI和Expasy）,对目的基因序列进行生物信息学分析。结果应用2对简并引物进行巢式RT-PCR．获得379bpAaRh基因片段。应用5’RACE和3’RACE方法,分别获得AaRh基因5’端1008bp、3’端822bpcDNA序列,根据两个片段的首／尾共同序列拼接为1717bp的基因片段。该核苷酸序列经BLASTn分析显示,与埃及伊蚊Rh蛋白的一致性高达95％,鉴定其为白纹伊蚊Rh类糖蛋白基因。AaRh基因具有完整的开放阅读框,其ORF从第128位到1516位含1389bp,编码462个氨基酸。Expasy在线生物信息学程序分析显示,白纹伊蚊Rh类糖蛋白是一个整合膜蛋白,跨膜11次,58aa．446aa具有铵离子通道的结构功能域;理论等电点（pI）5．37,分子量49775．10Mr,laa-26aa可能为分泌信号肽序列;含有4个潜在的天冬酰胺糖基化位点和17个线性抗原决定簇,翻译后可能进行糖基化修饰,提示其为糖蛋白。结论成功获取AaRh基因的全长cDNA,生物信息学分析结果为AaRh蛋白的生物学特性和功能研究奠定了基础。     

肺癌候选抑瘤基因HLCDG1片段的验证及全长序列的克隆

目的： 对肺癌候选抑瘤基因HLCDG1片段（已知序列）进行验证,并克隆其全长cDNA序列。方法: 采用RT-PCR和末端快速扩增技术(RACE),对正常人肺组织中HLCDG1基因片段进行验证和克隆其全长cDNA序列,登录基因数据库进行比对分析。结果: 从正常人肺组织中钓取到HLCDG1基因未知的3’端和5’端序列分别为1 304 bp和1 548 bp。HLCDG1基因与人酪蛋白激酶Ⅰα（CSNK1A1）基因2号转录变体相似性达99%,score=5 544,E=0。结论: HLCDG1基因为已知的CSNK1A1基因的2号转录变体,可能参与肺癌发生发展。     

2a型丙型肝炎病毒5′非编码区的RACE扩增及二级结构的分析

目的获得真全长中国大陆2a型丙型肝炎病毒(HCV)5′非编码区 (5′UTR)cDNA,并分析其一级结构和二级结构,为进一步研究其在HCV复制、翻译中的调控机制、开发新的抗HCV药物奠定基础.方法利用逆转录套式聚合酶链反应(RT-PCR)联合限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)初步筛选出1例2a型HCV感染者,采用cDNA 末端快速扩增技术(RACE)扩增出一条约800 bp的cDNA片段,A-T克隆,用RFLP与PCR鉴定重组子,全自动序列分析仪测定插入子序列,RNAdraw预测二级结构.结果 RACE法获得真全长2a型HCV 5′端序列.5个克隆中,3个克隆含全长5′UTR序列,与HCV-1,HC-C2,HC-J6,HC-J8相比,同源性分别为93.6%～94.4%, 92.1%～93.0%, 98.8%～99.7%,96.2%～96.5%,与2a型标准株HC-J6相比,21,170,222,247,339位不同,分别为G,A,C,C,T,但这些突变不影响其二级结构.另外2个克隆为5′端缺失突变株,分别缺失54 bp和144 bp.结论 RACE技术快速、有效、实用,可有效获得病毒基因组的末端序列;依此获得中国大陆2a型HCV的5′UTR cDNA;在感染者血液中存在5′端部分缺失的HCV基因片段.     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株4龄幼虫cDNA文库的构建

目的 :构建白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫cDNA文库。方法 :抽提、纯化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫总RNA ,进行反转录合成第 1链cDNA ;用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒进行长距离PCR ,合成全长双链cDNA ;PCR产物经蛋白酶K消化、提纯后 ,进行SfiI酶切 ;用ChromaSpin 40 0柱将酶切产物进行分级分离 ,然后经 1 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,回收 40 0bp以上的组分 ,并与λTriplEx2载体连接 ;连接产物经体外蛋白包装 ,产生未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库的扩增 ,并测定扩增文库的滴度 ;随机挑取 9个噬菌体 ,用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增 ,以检测所构建的cDNA文库的质量。结果 :经检测 ,未扩增文库滴度达 2 0× 10 7pfu mL ,重组效率在 10 -4 稀释度时每块平板约 2 10～ 2 5 5个噬菌斑中均未发现任何蓝色噬斑 ,扩增文库滴度达 1 75× 10 9pfu mL ;用载体克隆位点两端的引物进行PCR鉴定 ,结果显示 :所选 9个噬菌体中均含有重组的cDNA ,并且均在 5 0 0bp以上 ,其中 1kb以上的有 2个、 70 0bp的有 5个、 5 0 0bp的有 2个。结论 :已成功地获得一高质量的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫cDNA文库。     

同源区段长度对In-Fusion技术连接效率的影响

目的在目的基因原载体（DNA 模板）与克隆载体相同的条件下,探讨了 PCR 扩增片段（含目的基因）的末端与载体间同源区段长度对 In-Fusion 连接效率的影响,并建立以In-Fusion 技术为基础的高通量克隆方法。方法以糖基水解酶 Lxyl-p1-2（2.4 kb）基因突变库的构建为例,设计引物使目的基因的两端分别与线性化载体末端含有15~200 bp 重叠序列,并通过易错 PCR 方法获得含目的基因的 PCR 扩增片段,运用 In-Fusion 技术将 PCR 扩增片段定向克隆至表达载体 pPIC3.5K 中。结果对于长度大约为2.4 kb 的较大片段 DNA 的克隆, PCR 扩增片段的末端与载体间最适同源区段长度约为100 bp,此时连接效率最高,其阳性重组率高达90%左右,是常规酶切连接法的3倍。与后者相比,该技术将克隆周期由3~4 d 缩短为1~2 d。结论优化的同源区段长度可以显著提高 In-Fusion 技术对于2.4 kb 目的基因与载体的连接效率,该方法尤其适用于定向进化过程中基因突变库的构建。     

我国登革2型病毒43株基因组全长cDNA的构建

目的 构建我国登革2型病毒43株基因组全长cDNA,为进一步研究其体外RNA转录产物的感染性,阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础。方法 根据登革2型病毒参考株NGC株的核苷酸序列,利用DNASTAR软件设计覆盖登革2型病毒43株基因组的6对重叠引物。从感染登革2型病毒43株的乳鼠脑中提限病毒基因组RNA,采用RT－PCR分别扩增6条基因片段,并将其分别与pGEM－T载体进行连接。重组质粒用PCR进行快速鉴定,并在377A型自动测序仪进行序列分析。然后利用单一酶切位点,分别自阳性重组子上切下各基因片段,在体外分别进行5′半分子和3′半分子的连接,最后将5′和3′半分子连接成基因全长的cDNA。扩增各接头两侧长约457－691bp的基因片段,连接至T载体后测序,从而对全长cDNA进行鉴定。结果 共扩增出6条约1．5－2．5kb的基因自然,并在体外进行连接,获得了全长cDNA。结论 通过测序证实成功地构建了我国登革2型病毒43株基因组全长cDNA分子。本研究结果将为阐明我国登革病毒株的毒力及致病机理奠定基础。     

藏羚羊大脑皮质cDNA文库的构建

目的:构建藏羚羊大脑皮质组织的cDNA文库并鉴定文库质量。方法:提取藏羚羊大脑皮质组织总RNA,经oli-gotex试剂盒纯化得到mRNA。利用SMART技术,使用含有SfiIB酶切位点的oligo(dT)引物和含有SfiIA酶切位点的SMARTIV寡核苷酸在PowerScript逆转录酶作用下运用mRNA5′末端的模板转换方法合成cDNA第1链。利用LDPCR扩增cDNA,经SfiI(ⅠA和ⅠB)酶切后,通过CHROMASPIN-400柱进行分级分离去除<500bp的片段,再同经SfiI酶切的λTripIEx2载体连接,体外包装后转染到大肠杆菌XL1-Blue宿主菌中,进行文库滴度和重组率的测定,然后扩增文库并随机挑取10个噬菌斑行PCR反应鉴定插入片段大小。结果:构建的cDNA文库滴度为1.8×109pfu/L,重组率>98%,文库扩增后滴度达8×1012pfu/L,插入片段长度在750～6000bp之间,平均长度为4250bp。结论:文库具有良好的质量,为进一步筛选、克隆藏羚羊大脑皮质组织特异表达基因奠定了基础。     

应用长链RT-PCR法扩增我国登革2、4型病毒株全长cDNA

目的：采用长链RT-PCR技术扩增登革2型及4型病毒基因组全长cDNA，为构建登革病毒全长cDNA克隆、表达，深入阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础。方法：根据已测定的登革2、4型病毒全基因组序列，设计上下游引物。从感染登革病毒的乳鼠脑中提取病毒基因组RNA，采用长链RT-PCR技术进行扩增。为检验扩增产物的特异性，以PCR产物为模板扩增覆盖基因组的10个片段。将含有复杂二级结构的5′非编码区扩增片段，在377A型自动测序仪进行序列分析。结果：扩增出登革2、4型病毒基因组全长近11kb cDNA分子，非编码区测序结果表明扩增产物为登革2、4型病毒所特有。结论：利用长链RT-PCR首次成功扩增出登革病毒全长cDNA分子。     

Taq聚合酶逆转录并直接扩增细胞RNA

几年来的实践表明,PCR技术是基因分析中的一种十分有用的手段。近来结合mRNA逆转录为cDNA方法,应用PCR技术分析基因转录体(RT-PCR)。作者在用PCR技术分析基因组DNA过程中,注意到时常出现相应于cDNA片段大小的扩增产物,因而作者推测,Taq聚合酶直接合成并扩增了cDNA片段。为了证明Taq聚合酶能逆转录RNA模板,从末稍血分离4μg总RNA,用Taq聚合酶进行40轮的PCR扩增,所用引物为与人β血影蛋白cDNA 0.4kb两侧互补的寡核苷酸引物。在另一反应管中,同时用1μg基因组DNA用同一引物进行PCR扩增。PCR反应产物电泳分析表明,前者可是0.4kb扩增片     

一种改良方法克隆新的成人腹泻轮状病毒J19株的大片段基因

目的扩增、克隆新的成人腹泻轮状病毒J19株的大片段基因。方法以新成人腹泻轮状病毒J19株的病毒核酸为材料，利用非依赖核酸序列的单引物扩增方法，扩增新的成人腹泻轮状病毒J19株的第5～11基因；根据第5～11基因序列设计7对抑制性引物，通过在PCR扩增体系中添加小片段基因的抑制性引物来提高大片段基因的PCR产量。结果当在PCR反应体系中添加2对抑制性引物时，大于2kb的大片段基因的PCR产量得到显著提高。将扩增的基因片段克隆至pMD18-T后进行测序，最后得到J19株第2、3、4基因的全长cDNA克隆。结论这种改良的非依赖核酸序列的单引物扩增方法可以用于对轮状病毒大片段基因的扩增和克隆。     

人源噬菌体Fab抗体库构建过程中引物的优化和初步鉴定

目的 优化设计一套引物，扩增全套人抗体Fd片段和L链基因，改善扩增效率，益于人源噬菌体抗体库的构建。方法 根据V-BASE数据库提供的人抗体可变区胚系基因，在其家族分类基础上，根据FR1区5’端保守序列重新分组，设计特异性的5’端扩增引物。同时对设计引物的匹配情况进行分析，并应用PCR扩增和测序反应对其扩增效果进行鉴定。结果 Fd链5’端扩增引物有5条，κ轻链有6条5’端扩增引物，而λ轻链5’和3’扩增引物有10条。分析表明，人抗体可变区胚系基因与5’引物有较好的匹配率，数目较少，匹配率较高。PCR结果显示，全部的重链及轻链引物对均能高效扩增出特异性较高的目的片段。测序结果表明PCR扩增产物具有较好的亚类和可变区家族分布。结论 优化了一套扩增全套人抗体Fd片段和L基因的引物，为人源噬菌体抗体库的构建奠定了良好的基础。     

5'和3'末端快速扩增法克隆多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2

目的 在多发性骨髓瘤患者中KIAA0058基因序列表达明显下调,从正常人骨髓单个核细胞中克隆该序列全长cDNA,以期更好地研究该序列结构,获得其功能信息。方法 采用末端快速扩增法（RACE）,进行多轮RT-PCR后,对PCR产物进行测序、拼接、证实,与NCBI核酸数据库进行比对。结果 该序列全长cDNA长度为1913bp,登陆号为AY430097,与来源于人睾丸cDNA文库的序列DAZAF2同源性高达99％以上。该序列具有较短的5’非翻译区及长的3’非翻译区,开放阅读框序列从第84位碱基至590位碱基,具有poly（A）尾。结论 利用RACE法,从骨髓单个核细胞中成功克隆了DAZAF2全长cDNA。     

弓形虫RH株速殖子期表达型cDNA文库的构建及鉴定

为构建弓形虫速殖子期表达的基因的完整长度cDNA文库 ,用CF 11纤维素柱快速提纯速殖子 ,以盐酸异硫氰酸胍 (AGPC)一步法抽提总RNA ,oligo dT纤维素分离mRNA后 ,用ClonTech公司的SmartTMPCRcDNA文库构建试剂盒 ,构建了弓形虫RH株的表达型文库。获得 5× 10 6个独立克隆 ,重组率为 99% ,插入片段的平均长度约为 1kb。根据已知序列设计引物 ,从cDNA文库中扩增出编码棒状体蛋白 1(ROP1)的基因 (不含编码信号肽的序列 ) ,本文库可望用于弓形虫疫苗研究的候选基因的筛选。