VEGF165基因转染骨髓源性血管内皮祖细胞的体外实验研究

目的探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）转染骨髓源性血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）后，EPC分泌VEGF及活性以及EPC特性的影响。方法体外获取大鼠骨髓，分离单个核细胞，经培养，鉴定为EPC。用脂质体介导pcDNA3．0-hVEGF165转染，转染后EMSA法测培养上清VEGF蛋白水平，培养上清液对ECV304细胞生长的影响，以评价VEGF蛋白活性，MTY法评价转染对细胞活性的影响，免疫细胞化学检测EPC表达VEGF、vWF（血友病因子）、VEGF—R2（血管内皮生长因子受体2）的变化。结果转染后的第7天表达的VEGF蛋白浓度达1280pg／ml，转染对EPC的增殖无影响，表达VEGF、vWF、VEGF—R2的比率随时间而逐渐升高，至第7天时分别为88．52％、82．65％和95．97％。结论VEGF转染的EPC能表达一定浓度有功能的VEGF蛋白，能帮助EPC保持内皮细胞特性，向成熟内皮细胞分化。     

VEGF基因转染血管内皮祖细胞的实验研究

目的:探讨血管内皮生长因子（VEGF）基因转染血管内皮祖细胞（EPCs）的方法及效果。方法:取生长活跃的EPCs,分别转染不同浓度的携带VEGF-165基因的腺病毒质粒（Adv-GFP-VEGF165）（转染组）及空质粒（Adv-GFP）（空质粒组）,并设空白对照组。荧光显微镜下观察转染效果,MTT法检测不同病毒滴度时细胞增殖情况;ABC-ELISA法检测上清液中VEGF蛋白表达情况。结果:转染组镜下观察到大部分细胞呈现绿色荧光。病毒滴度为1∶100的转染会导致细胞生长停滞,并造成细胞损害; 1∶50的转染后对细胞增殖无明显影响。ELISA检测证实转染组上清液中VEGF蛋白浓度明显高于空质粒组及空白对照组（P<0.01）。结论:以腺病毒为载体的VEGF基因转染EPCs是可行的,1∶0是合适的转染比率,转染后上清液中VEGF蛋白表达明显增加。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建血管内皮生长因子165重组腺病毒

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建血管内皮生长因子165（VEGF165）重组腺病毒，并在293T细胞中扩增。方法将PCR获取的VEGF165基因酶切并插入到pAdTrack-CMV中，构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165，经PmeI酶切线性化后，采用电穿孔转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中，挑选同源重组菌落。提取质粒并用Pac I酶切鉴定，线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞，包装成重组腺病毒颗粒，荧光显微镜下观察绿色荧光表达，并扩增收集重组腺病毒，测定病毒滴度。结果经限制性内切酶检测、基因测序及和绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒，并扩增出10^9pfu／mL的高滴度重组腺病毒。结论成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒载体，为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础。     

人VEGF165基因转染人外周血内皮祖细胞的实验研究

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)基因转染对人外周血内皮祖细胞(EPCs)的影响.方法 体外分离、培养、鉴定人外周血EPCs.实验分脂质体介导pcDNA3.1-hVEGF165质粒转染组,pcDNA3.1空质粒转染组,窄白对照组.ELISA法和硝酸还原酶法分别测定各组上清液中VEGF和一氧化氮(NO)的含量;噻唑蓝(MTT)检测它们对EPCs增殖的影响.结果 FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3.1-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清液中VEGF和NO表达量明显高于其他两组(P＜0.01);VEGF质粒转染对EPCs的增殖无明显影响.结论 人外周血EPCs可以成功转染hVEGF165基因.同时能表达一定浓度的VEGF蛋白,并可促进NO的分泌,而对EPCs的活性无明显影响.该研究为进一步研究VEGF165基因和EPCs结合治疗缺血性疾病提供了实验依据.     

血管内皮生长因子基因转染血管内皮祖细胞治疗肢体缺血的实验研究

目的利用血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF-165）基因转染体外诱导的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,并移植到下肢缺血的新西兰兔体内,观测其促进血管新生,改善肢体缺血的效果。方法（1）梯度离心法分离兔骨髓单个核细胞,然后用含有VEGF、bFGF、IGF-1的M199培养液诱导培养EPCs。并以免疫荧光、透射电镜等方法进行鉴定。（2）用携带VEGF165基因的腺病毒质粒（Adv-GFP-VEGF165）转染所培养的细胞,ELISA法检测上清液中VEGF蛋白的表达。（3）制作兔下肢缺血模型,并将其随机分为A、B、C 3组,分别移植EPCs、VEGF165基因转染后的EPCs、M199培养基,多种方法检测移植效果及局部整合情况。结果（1）自兔骨髓诱导出梭形贴壁细胞,免疫荧光及电镜检测证实为EPCs。（2）Adv-GFP-VEGF165成功转染EPCs,ELISA法检测转染VEGF165后的EPCs其上清液中VEGF蛋白浓度明显升高。（3）Brdu示踪显示移植细胞整合到缺血局部,CTA及免疫组化检查显示VEGF-165基因转染后的EPCs移植后其改善肢体缺血效果优于其他两组。结论VEGF基因转染EPCs后能改进EPCs质量,移植后促血管新生能力增强,其效果优于未转染组。     

重组腺病毒介导的β-神经生长因子基因转染大鼠内皮祖细胞的实验研究

[目的]探究携带β-神经生长因子(β-NGF)基因的重组腺病毒转染大鼠骨髓源内皮祖细胞(EPCs)的最佳感染复数(MOI),并从基因转录和蛋白合成两个水平上观察转染后EPCs对β-NGF基因的表达,探讨其对脊髓损伤后神经元细胞微环境的影响。[方法]密度梯度离心法分离、全骨髓贴壁法培养大鼠骨髓源EPCs,免疫荧光法检测EPCs特异性表面分子CD34、CD133和VEGFR-2的表达。用不同MOI值的携带β-NGF基因和绿色荧光蛋白基因(GFP)的重组腺病毒转染EPCs,确定最佳的MOI值。用携带β-NGF基因的重组腺病毒转染的细胞为β-NGF基因组,用空载的重组腺病毒转染的细胞为空载组,未转染的细胞为空白组。RT-PCR法、Western blot法和ELISA法检测β-NGF的表达。[结果]成功分离、培养出大鼠骨髓源EPCs,特异性表面分子CD34、CD133和VEGFR-2经鉴定呈阳性表达;携带β-NGF基因的重组腺病毒转染EPCs最佳的MOI为70;转染成功的细胞β-NGF基因在m RNA和蛋白两个不同的水平上表达都升高,并持续向细胞外分泌。[结论]携带β-NGF基因的重组腺病毒可成功转染EPCs,成功转染β-NGF基因的细胞能持续向细胞外分泌有活性的β-NGF蛋白。     

血管内皮细胞生长因子体外转染血管内皮祖细胞的研究

目的 探讨脂质体介导血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染血管内皮祖细胞(EPC)应用于基因治疗的可行性、安全性。方法 体外分离、培养、免疫组织化学及流式细胞仪鉴定EPC,转染VEGF后用免疫组织化学和ELISA检测EPC表达VEGF蛋白,噻唑蓝(MTT)检测EPC对VEGF质粒转染的敏感性。结果 EPC表达CD_(34)、CD_(31)、KDR及CD_(133)细胞表面标志,转染后EPC胞内表达VEGF。脂质体介导PcDNA3.1(-)/VEGF_(165)质粒转染、PcDNA3.1(-)/VEGF_(165)空质粒转染、不转染任何质粒的3组EPC培养基上清中表达的VEGF分别为(352±35)ng/L、(45±5)ng/L、0 ng/L(P<0.05),VEGF质粒转染对EPC增殖无影响。结论 EPC可作为VEGF转染的靶细胞,用于基因治疗。     

人血管内皮生长因子165基因转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

Objective To establish an effective method of transfecting human marrow mesenchymal stem cells (MSC) with human vascular endothelial growth factor 165 ( VEGF 165) gene. Methods MSCs isolated and cultured in vitro were divided into transfection group (pShuttle-CMV/VEGF 165 plasmid was transfected into MSCs through liposome-mediating method), empty plasmid group (pShuttle-CMV vehi-cle was transfected into MSCs as control), liposome group (liposome was transfected into MSCs as control) and control group(normal culture). Expressions of Mrna and protein of MSCs were determined by RT-PCR, enzyme-linked immunosorbent assay and Western Blot. Sensitivity to MSCs on VEGF plasmid transfec-tion was detected by MTT test. Results Expression level of VEGF 165 gene Mrna in transfection group, empty plasmid group, liposome group, and control group was respectively 0.89 ± 0.03, 0. 34 ± 0.04, 0.40 ± 0.03, and 0.30 ± 0.03, and the difference between transfection group and the other three groups was statistically significant ( P <0. 01 ). Content of VEGF protein in transfection group, empty plasmid group, liposome group, and control group was respectively (778 ± 35 ), (543 ± 24), (561 ± 28), (571 ± 23) pg/Ml, and the difference between transfection group and the other three groups was statistically significant ( P <0.01 ). In the transfection group, expression level of VEGF protein peaked on 7th day after transfec-tion, which was decreased gradually later. In transfection group, expression level of V EGF 165 protein was obviously higher than that of the other three groups ( P <0. 01 ), and no inhibitory effect of VEGF plasmid transfection on MSCs proliferation was found. Conclusions The method for transfecting human VEGF 165 gene into MSCs is established in this research, through which target gene and protein can express effectively.     

重组腺病毒介导β半乳糖苷酶基因转染内皮祖细胞的实验研究

目的测定重组腺病毒介导β半乳糖苷酶基因对内皮祖细胞的转染率,为利用人类单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因转染内皮祖细胞治疗肺癌提供依据。方法将转染β半乳糖苷酶（LacZ）的重组腺病毒AD5F35（AD5F35LacZ）加入培养有内皮祖细胞的24孔板,转染内皮祖细胞。转染后用LacZ检测试剂盒染色,计算转染率。结果在光学显微镜下观察,蓝色细胞为AD5F35LacZ基因转染成功的内皮祖细胞。在不同感染复数MOI的前提下,腺病毒对内皮祖细胞的转染率是不同的,在一定的范围内,转染率随MOI的增大而增大,在MOI达到400时,转染率最大,为98．38％±1．25％。结论重组腺病毒可成功转染内皮祖细胞,转染率随MOI的增大而增大,当感染复数为400时转染率最大。     

重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因对血管生成的治疗作用

经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄率高；支架术后再狭窄率仍高达15％～54％。采用血管内皮生长因子(VEGF)基因治疗的方法以质粒、重组病毒作为VEGF基因载体经心外膜下或心内膜下心肌内注射。我们用携带人VEGF165基因重组腺病毒(Ad-VEGF165)，在猪慢性心肌缺血模型体内进行了血管生成的实验研究。